检查荧光模式Cryosectioning酵母社区
2012年12月26日
我们提出了一个协议冻结和cryosectioning的酵母菌社区观察荧光细胞的内部模式。该方法依赖于甲醇固定，OCT-嵌入社区内的荧光蛋白失活的细胞没有保留的空间分布。
以下实验的总体目标是生成酵母群落的横截面，以检查群落内不同荧光细胞群的空间分布。这是通过首先冷冻群落，然后使用甲醇固定它来实现的，以保持群落中细胞的空间分布。第二步，蒸发甲醇以允许包埋的 OCT 化合物渗透。
然后冷冻嵌入的群落以准备冷冻切片。接下来，冷冻切片。群落和横截面可以在荧光显微镜下成像获得的结果显示了群落内荧光细胞群的空间分布。
与光学切片等现有方法相比，该技术的主要优点是它揭示了这些群落深处种群的空间分布。要开始此过程，请在膜过滤器上培养酵母群落。该方案对应于小于 2 乘以 10 的典型社区，接下来在零下 20 摄氏度的冰箱中，将 6 毫米直径的膜过滤器上的 8 个细胞
。为了保留更大程度的荧光，请使用一张 watman 5 4 1 滤纸覆盖直径为 1 厘米的底部。那么，这种滤纸是作为载体转移群落后期，向井中加入 1 毫升零下 20 摄氏度的 100% 甲醇，将井置于零下 20 摄氏度，让温度达到平衡。现在，使用镊子将膜过滤器与菌落一起浸入液氮中至少 15 秒，以冷冻酵母群落。
接下来，将冻结的群落转移到零下 20 摄氏度的井中。冰箱中的甲醇确保群落保持水平。将其浸入甲醇中等待 20 分钟后，膜过滤器将开始在甲醇中分解。
20 分钟后，使用载体 watman 滤纸将群落从甲醇孔转移到保持在零下 20 摄氏度的冷培养皿中。转移时，请让社区处于运营商 Watman 过滤器的顶部。用另一张厚 watman 纸吸出额外的甲醇滴，然后将其放入冷培养皿中。
这将确保不同样品的甲醇蒸发时间一致。等待 4 到 6 小时，让甲醇蒸发。在正确的时间结束蒸发对于该程序的成功至关重要。
为避免样品过度干燥，请在蒸发过程中定期检查酵母群落的状态，同时在甲醇蒸发时。制作一个矩形立方体铝箔容器，该容器足够大，使样品每侧至少有大约 2 毫米的边距。在此容器的底部添加一滴 OCT，以确保样品从四面八方被 OCT 包围。
蒸发完成后，将样品从零下 20 摄氏度的冰箱中取出。切掉滤纸上未被酵母群落覆盖的部分。快速执行此步骤非常重要。
避免样品过度干燥。将社区放在铝箔容器的底面上，并立即用 OCT 覆盖样品至社区高度以上 3 到 4 毫米。等待 10 分钟。
最后，将 OCT 包埋样品放在干冰上的金属板上，将冷冻群落冷冻储存在零下 20 摄氏度或零下 80 摄氏度。在准备切片冷冻群落时，将冷冻切片室的温度设置为零下 25 摄氏度。将样品留在腔室中，直到其温度达到腔室的温度。
然后从样品中取出箔片并切掉多余的 OCT。在低温镶样上滴一滴 OCT，然后将样品放在低温镶样上。用暴露的 watman 滤纸将 OCT 均匀地铺在样品的一侧，使 OCT 厚度为 2 至 3 毫米。
确保样品所有侧面的 OCT 余量为 2 到 3 毫米，有助于保持切片的完整性。切片前让 OCT 在低温恒温器室内冻结。使用 OCT 样品块的侧面将样品与刀片对齐。
如果样品未与刀片对齐，则切片将从样品的角落或侧面开始。调整底座以确保刀片切割出样品块的完美垂直面。酵母群落的典型切片厚度约为 14 微米。
切割切片后，使用保存在室温下的显微镜载玻片收集切片。通过将载玻片缓慢移动到切割部分，该切片将熔化并转移到显微镜上。一张载玻片最多可将 18 个切片转移到一张载玻片上。
将载玻片储存在低温下，最好在成像前零下 20 摄氏度。在 4 摄氏度下保存一周以获得最大荧光信号时，信号损失最小。切片后应立即进行影像学检查。
此处显示了在相同条件下生长的酵母群落垂直横截面的代表性荧光图像。该群落由两种用荧光蛋白标记的 visier 的向光性菌株组成。M cherry 可视化为红色，Y-E-G-F-P 可视化为绿色共享资源竞争，包括空间导致列状图案，如其垂直横截面所示。
可以分辨到单个细胞的分辨率。该图比较了下图所示的甲醇固定和上图所示的无甲醇固定获得的横截面。荧光信号保留在群落切片中而不固定，但群落的完整性受到损害。
结果，一些细胞在切片的边缘漂浮，与固定群落相比，总体产量较低。甲醇固定使社区细胞保持在一起，但会导致收缩，如社区高度的降低所观察到的那样。该图显示了酵母群落的代表性明场和荧光垂直横截面，该酵母群落由两种原位菌株组成，与 DS RED 和 YFP 荧光蛋白结合。
群落顶部的细胞形成一个冠状体，看起来与母细胞不同，其特征是在明场中具有更强的散射和更亮的荧光。这些模式与已报道的酵母菌落分化模式一致。观看此视频后，您应该对如何使用冷冻切片来检查酵母群落内的荧光 su 空间模式有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种用于冷冻和冷冻切片酵母群落以观察荧光细胞的内部模式的协议。该方法利用甲醇固定和OCT包埋来维持细胞的空间分布，同时保持荧光蛋白。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
- 酵母群落
背景
- 了解群落中细胞的空间分布对于各种生物学研究至关重要。
- 荧光蛋白常用于标记特定的细胞群体。
- 传统方法可能破坏细胞的空间排列。
- 本研究旨在提供一种可靠的方法来保存细胞分布。
研究目的
- 开发一种观察酵母群落中荧光细胞群体的协议。
- 确保在冷冻过程中保持空间分布。
- 促进使用荧光显微镜对横截面进行成像。
使用的方法
- 冷冻酵母群落以准备冷冻切片。
- 使用甲醇固定来保存细胞分布。
- 蒸发甲醇以允许OCT包埋。
- 使用荧光显微镜进行冷冻切片和成像。
主要结果
- 成功保存横截面中的荧光细胞群体。
- 清晰地可视化了酵母群落内的空间分布。
- 证明了所提出方法的有效性。
- 结果支持对酵母群落动态进行进一步研究。
结论
- 该协议有效地保持了荧光细胞的空间排列。
- 该方法可以应用于涉及酵母和其他微生物群落的各种研究。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索细胞相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization in microbial communities is critical for de-risking target validation in antimicrobial and microbiome therapeutics. Cryosectioning yeast communities enables high-resolution fluorescence mapping of gene expression and cell distribution, supporting mechanistic insights into community function and stability. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving native spatial architecture without disrupting fluorescent reporters.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial hypotheses in microbial communities by preserving fluorescent reporter patterns for target validation studies.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess gene expression localization without disrupting community integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively imageable sections for screening fluorescent reporters in spatially resolved microbial assays.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent cryosection thickness and fluorescence preservation across replicates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker analysis by linking spatial gene expression patterns to community-level phenotypes in yeast models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical evaluation by preserving spatial context in frozen, sectioned samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling spatially resolved fluorescence readouts that inform target engagement and pathway modulation in microbial systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of spatial organization in microbial communities through preserved fluorescence imaging.
- Screening: Delivers assay-ready sections with quantitative fluorescence outputs for evaluating modulator effects on community structure.
- Analytics: Provides spatial fluorescence measurements that allow comparison of conditions based on internal organization patterns.
- Translational Research: Connects spatial gene expression to community function, supporting biomarker alignment in preclinical yeast models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for spatial profiling applicable across microbial strain panels and culture conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by revealing true spatial distribution of fluorescent populations, reducing artifacts from optical scattering.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, embedding, and sectioning parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved data on target engagement in community contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated spatial mechanisms in microbial systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cryostat operation for sectioning and imaging.
- Depends on cryostat, microtome, and fluorescence microscope infrastructure for section preparation and visualization.
- Necessitates standardization of fixation duration, OCT infiltration, and section thickness across teams.
- Involves adaptation considerations for different microbial community sizes and extracellular matrix compositions.
- Limited by tissue integrity during methanol evaporation and OCT embedding, requiring precise timing to avoid over-drying or poor infiltration.
