的视觉检测，以监测T6SS介导的细菌竞争

以下实验的总体目标是评估两种细菌物种在同一生态位中茁壮成长时相互竞争的能力。特别是，我们将评估 6 型分泌系统或 6 型分泌系统在这个竞争过程中的作用。这是通过用具有活性 6 型的供体细胞或猎物细胞制备检测起始板来实现的，这些供体细胞将成为蓝色的 OnX 鳞片板。

然后制备测定输出板，在其上结合供体菌株和赞美菌株。接下来，孵育板以允许 6 型活性发生。然后从输入和输出板制备连续稀释液，并将稀释的培养物点样在读出输入和输出板上。

根据简单的目视观察，结果表明每个斑点中蓝色的优势存在差异，表明每种情况下猎物细胞的存活率。蓝色越多意味着猎物存活率越高，因此供体细胞的杀伤活性越差。与计数菌落形成单位等现有方法相比，该技术的主要优点是这种方法简单且不耗时，并且允许直接评估针对给定猎物的 6 型活动。

因此，该技术评估了混合培养物中的细菌密封活性，因此可能有助于理解为什么一些慢性多种微生物感染最终由一种细菌种类主导，例如囊性纤维化患者肺部的假单胞菌胫。开始在 LB 琼脂或 LBA 平板上过夜，将 6 型活性 D 阳性或 6 型非活性 D 阴性的大体气原供体细胞在 37 摄氏度下过夜。在这里介绍的示例中，我们使用了一种假单胞菌气原 RET S 菌株，该菌株具有组成型活性的 H one 6 型，以及具有 H one 6 型基因簇工程师缺失的等基因突变体，大肠杆菌受体细胞或猎物通过用质粒转化 DH 5 α，允许缺乏基因的 α 互补。

用 XGL 和适当的抗生素从 LB 上的甘油原液中分离细菌，并于第二天在 37 摄氏度下孵育过夜。选择并挑选蓝色转化体，并在 5 毫升胰联体大豆肉汤或 TSB 中制备过夜培养物，并在 37 摄氏度下搅拌下生长，用于第二天的实验准备 LBA 板，标记为菌株、D 阳性、D、阴性和 P 的测定输入，以及 D 阴性加 P 和 D 阳性加 P 的测定输出。 测量光密度并计算获得相当于一个单位 OD 600 的细胞密度所需的体积。将每种培养物收集在无菌的 1.5 ml 微量管中。

在以 13， 000 RPM 的转速引航细菌样品 1 分钟后，Resus 将颗粒悬浮在 100 微升新鲜 TSB 中，将每种菌株的 10 微升作为单个点接种在 A 输入板上。接下来，将 30 微升 D 阳性与 30 微升 P 轻轻混合，并在第二根试管中，将 30 微升 D 阴性与 30 微升 P 混合，然后用每种混合物的 20 微升点接种板的 A 输出。让斑点在 abus 和燃烧器附近干燥后，将板在 37 摄氏度下孵育，以便杀死细菌。

为了分析细菌杀灭性能，准备每毫升含有 40 微克 xal 的 LBA 板。对于检测读数，标记板读数输入以点出分离的细菌或输出以点定每个板背面的混合细菌培养物，分为四个相等的部分，并将第 0 部分标记为负 10，将 10 标记为负 2，将 10 标记为负 3。每次稀释都将允许对同一点内的蓝白细菌比率进行半定量评估。

使用无菌环，从 A 输入板和 A 输出板收集单个细菌点，并将每个点重悬于含有 1 毫升 TSB 的单独 1.5 毫升微管中。摇动试管 30 分钟，以便在培养物摇动时重悬细菌。准备五组三个微管，每组含有 900 微升 TSB。

然后从每个重悬点开始，使用新鲜的吸头准备 10 倍连续稀释液，并在 LVA xal 板上的每个稀释点之间短暂涡旋，从最稀释的样品开始，到未稀释的样品结束。将 A 输入管接种在 R 输入板上，将 A 输出稀释液接种在 R 输出板上，每个象限内每个重现点 20 μL，一式三份。为了量化此阶段的比赛论文，将 A 输出样品的 100 微升到负 3 微升稀释液一式三份，在 LBA xga 板上一式三份，在 37 摄氏度下孵育过夜，并在无菌区域计数蓝色菌落，将板打开，让多余的液体吸收和培养箱在 37 摄氏度下过夜， 此时杀戮仍在发生。

由于两种菌株仍然接触以获得输出分析图像或扫描板。大部分保持蓝色的斑点表明大肠杆菌尚未被杀死。与所示的 6 型缺陷阳性菌株一起培养时的典型情况一样，以下是该测定中使用的菌株的读出输入板的连续稀释。

正如预期的那样，表达缺失基因的大肠杆菌前斑点 P 在补充有 XGL 的培养基上呈蓝色，而供体 p 气原鼻菌株 D 阳性 6 型活性和 D 阴性 6 型非活性保持白色。在发现猎物和 6 型活性菌株 D 阳性 P 之间的混合物的读出输出板上显示蓝色猎物消失，从而表明它已被杀死。这表明供体有能力胜过猎物。

D 阴性 P 板上蓝色的持久性表明，不活跃的 6 型供体无法杀死蓝色猎物。因此，在尝试此程序时，重要的是要记住，生长或 6 型分泌活性的要求可能因细菌种类而异，因此可能需要对实验设置进行一些调整。此外，您还必须记住，如果您想评估一个物种的 6 型分泌活性，那么尽可能将 6 型分泌突变体的活性与亲本菌株的活性进行严格比较也非常重要。

看完这个视频后，你应该对如何设置一篇视觉论文来评估前细胞在接触 6 型熟练或 6 型缺陷菌株后的存活情况有更好的了解。