Name: 的视觉检测，以监测T6SS介导的细菌竞争 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学习利用VI型分泌系统介导的细菌竞争检测方法，通过铜绿假单胞菌与大肠杆菌的共培养实验，快速评估供体菌对猎物菌的杀伤活性。该视觉检测技术操作简便，可直观观察猎物细胞存活情况。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由惠康基金会资助项目 WT091939MA 资助。Alain Filloux 得到英国皇家学会的支持。

1. 细菌菌株与培养
<ol>
 <li>设计一个 大肠杆菌 受体细胞（猎物， P) 通过使用标准的 CaCl 转化法2 处理或电穿孔15 E. coli DH5&alpha; 带有质粒的细胞，该质粒可实现α-互补 lacZ 基因表1）。将转化后的细胞接种于含5-溴-4-氯-吲哚基-β-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-indolyl-β-&beta;-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal），终浓度为40 mg/ml，并加入适当的抗生素。37℃培养 &deg;C 过夜培养，次日早晨筛选蓝色转化子（参见 &sect;1.3).</li>
 <li>培养 铜绿假单胞菌 具有T6SS活性的供体细胞（D+）或 T6SS 失活（D-) (表1在37℃的LBA上过夜培养 &deg;C. 在本示例中，我们使用了 铜绿假单胞菌 retS 具有组成型活性 H1-T6SS 的菌株16 以及一个缺失H1-T6SS基因簇的同基因突变体（表1).</li>
 <li>第二天，在振荡培养瓶中接种一个亮蓝色克隆，制备过夜液体培养物 E. coli 转化子（P）从上述平板中描述的 &sect;1.1，在5 ml添加了适当抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中培养。在37℃下振荡培养。 &deg;C. 以单个菌落同样进行后续操作（D+）以及（D-）从上述平板中描述的 &sect;1.2.</li>
</ol>
2. 竞争实验
<ol>
 <li>为第二天的实验准备LBA平板。确保这些平板充分干燥（可在本生灯旁或层流柜中干燥）。为菌株（D+）、（D-）和（P）准备一块“检测输入”（A-输入）平板。为菌株（D-+P）和（D++P）准备一块“检测输出”（A-输出）平板。将平板分区并做好相应标记。</li>
 <li>过夜培养后（见§1.3），测定输入细菌培养物（D-、D+和P）的光密度（OD600nm），并计算获得每种菌株相当于1单位OD600nm细胞密度所需的体积。将每种“输入”细胞培养物（D-、D+和P）分别收集至无菌的1.5 ml离心管中。</li>
 <li>在室温下以13,000 rpm离心细菌样品1分钟，并弃去上清液。</li>
 <li>用移液枪轻轻吹打，将D-、D+和P培养物的菌体沉淀重悬于100 μl新鲜TSB中，并将每种对应菌株各10 ml以单点形式接种至“A-输入”平板（按§2.1制备）。</li>
 <li>接种“A-输出”平板（按§2.1制备）。更具体地说，分别在两个独立的离心管中，将30 μl（D+）与30 μl（P）混合，以及30 μl（D-）与30 μl（P）混合（注意：所用培养物为§2.4中所述）。将混合液（D+/P）和（D-/P）各取20 μl，分别以单点形式接种至“A-输出”平板上。在本生灯旁让接种点自然干燥，随后将平板置于37 °C培养箱中孵育适当时间，以进行细菌杀伤反应。以P. aeruginosa为例，当比较T6SS活性菌株与T6SS缺陷菌株时，通常在孵育5小时后可观察到显著的细菌杀伤效应。</li>
</ol>
3. 细菌杀灭作用的定性观察
<ol>
 <li>准备含有 40 μg/ml X-gal 的 LBA 平板，用于检测实验结果。这些平板将被称为“读出输入”（R-input），用于点样分离的细菌，或“读出输出”（R-output），用于点样混合细菌培养物，从而读取杀伤效果。这些平板也需要充分干燥。在平板背面将其均分为四个部分，并标记为 0、10-1、10-2 和 10-3，代表待点样于琼脂平板上的细菌培养物稀释度（见 §3.3）。该稀释梯度将允许在同一菌斑内对蓝/白细菌比例进行半定量评估。</li>
 <li>使用无菌接种环从“A-input”平板（见 §2.4）和“A-output”平板（见 §2.5）上分别收集单个细菌菌落，并将每个菌落重悬于不同的含有 1 ml TSB 的 1.5 ml Eppendorf 管中。将管子置于 Eppendorf 振荡器中振荡 30 分钟，以有效重悬细菌。</li>
 <li>准备 5 组、每组 3 个 Eppendorf 管，每管加入 900 μl TSB，并对每个重悬的菌样进行连续 10 倍梯度稀释至 10-3。确保每次稀释时更换移液器吸头，并在每步稀释之间涡旋振荡 5 秒。</li>
 <li>将 §3.3 中制备的细菌稀释液点样到充分干燥的含 40 μg/ml X-gal 的 LBA 平板上，从最高稀释度到未稀释的悬液依次点样，这些平板即为“A-input”菌落对应的“R-input”平板和“A-output”菌落对应的“R-output”平板（图 2）。在点样前短暂涡旋每根试管，以保持细菌悬液均匀。为保证结果可重复性，在每个象限内以 20 μl 为一份，点样三份（图 2）。此时平板的相对干燥程度至关重要，因为菌斑必须在平板上保持彼此分离，不能相互流动融合。 
 在实验的这一阶段也可对竞争实验进行定量分析。在完成步骤 3.3 后，取 10-3 稀释度的菌液 100 μl 涂布于含 40 μg/ml X-gal 的 LBA 平板上。为保证结果可重复性，对“A-output”平板上的每个菌样均进行三份涂布。将稀释平板置于 37 °C 恒温培养箱中过夜培养（相当于 16 小时）。随后计数蓝色菌落（即仍存活的 P 细胞）。竞争 5 小时后的典型结果如 图 3 所示。
 </li>
 <li>将平板打开（不加盖）置于无菌区域内，使每个菌斑中的多余液体被充分吸收。</li>
 <li>将平板置于 37 °C 恒温培养箱中过夜培养。在此培养期间，混合菌群（D+/P）中的杀伤作用仍在持续，因为两种菌株仍处于接触状态。</li>
 <li>对平板进行拍照或扫描，用于结果分析（图 2）。若菌斑大部分呈蓝色，表明 E. coli 未被 P. aeruginosa 杀死。当 E. coli 与 T6SS 缺陷型 P. aeruginosa 菌株（D-）混合时即出现此情况（图 2，右下角平板）。</li>
</ol>

<ol><li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+type+VI+secretion+machine%3A+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570(2008).</li>
<li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102(2012).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355(2010).</li>
<li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733(2008).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154(2009).</li>
<li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+translocates+a+phage+tail+spike-like+protein+into+target+cells+where+it+cross-links+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508(2007).</li>
<li>Ma, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+effector+requires+bacterial+endocytosis+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells.</a> Cell Host Microbe. 5 (3), 234(2009).</li>
<li>Hood, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+targets+a+toxin+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25(2010).</li>
<li>Russell, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+delivers+bacteriolytic+effectors+to+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells.</a> Nature. 475 (7356), 343(2011).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+type+VI+secretion+effector+recognition+by+a+cognate+immunity+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002613(2012).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+anti-amoebae+and+anti-bacterial+activities+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> PLoS One. 6 (8), (2011).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathog. 6 (8), e23876(2010).</li>
<li>Murdoch, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opportunistic+pathogen+Serratia+marcescens+utilizes+type+VI+secretion+to+target+bacterial+competitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors.</a> J. Bacteriol. 193 (21), 6057(2011).</li>
<li>Boyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bacterial+type+VI+secretion+system+by+a+genome+wide+in+silico+analysis%3A+what+can+be+learned+from+available+microbial+genomic+resources%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?</a> BMC Genomics. 10, 104(2009).</li>
<li>Maniatis, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring, NY. (1982).</li>
<li>Mougous, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virulence+locus+of+Pseudomonas+aeruginosa+encodes+a+protein+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus.</a> Science. 312 (5779), 1526(2006).</li>
<li>Records, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system%3A+a+multipurpose+delivery+system+with+a+phage-like+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751(2011).</li>
<li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317(2011).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文介绍的方法可实现对T6SS介导的杀菌/抑菌活性的直观观察。该检测在琼脂平板表面进行。先前研究表明，采用混合细菌液体培养物进行的T6SS依赖性杀伤检测效率较低，原因可能是两种细菌之间缺乏稳定的接触8。目前认为，T6SS的作用机制类似于噬菌体将DNA注入靶细胞的机制17。在液体培养条件下，T6SS的管状结构可能更容易断裂，细菌间的接触可能中断，导致毒素无法有效递送。
就孵育时间而言，我们所描述的供体菌株与捕食对象之间最初的5小时接触已足以观察到铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）与大肠杆菌（E. coli）之间的细菌杀伤作用，如图3所示。然而，建议通过进行动力学实验来调整孵育时间，以优化实验条件。
由于该方法是一种基于颜色的技术，供体菌株的色素沉着可能会影响输出结果。例如，在铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）中，某些菌株会产生高水平的有色色素，如绿脓菌素（pyocyanin）和绿脓菌荧光素（pyoverdine），这些物质可能干扰检测信号的读取，使得与捕食对象的区分相对困难。可使用其他显色型β-半乳糖苷酶底物替代X-gal（表1），例如magenta-gal或red-gal。
竞争实验可使用其他报告基因进行检测。例如，已有研究使用绿色荧光蛋白标记的猎物蛋白进行了类似的实验12。
我们的检测方法虽然不是定量的，但由于基于报告菌（reporter prey）的存活或被杀灭情况，因此能够很好地指示T6SS活性。该技术的优势在于操作简便，可方便地评估任何细菌物种T6SS的杀菌/抑菌活性。迄今为止，T6SS的活性仅在革兰氏阴性菌中得到证实，尚无明确报道显示革兰氏阳性菌对T6SS敏感12。此外，显然在测试不同细菌物种时，需考虑它们在培养条件上的不兼容性（例如生长温度、供氧条件、特定培养基）。
我们的检测方法还可用于评估T6SS中哪些组分是绝对必需的，因为即使微量分泌的毒素也可能足以杀死捕食对象。与使用培养上清液和Western印迹分析来检测T6SS依赖性分泌的标准方法相比，该方法能够清晰地检测到T6SS的微弱活性。然而，仍需进行准确的菌落形成单位（CFU）计数，以实现对T6SS活性的精确定量。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;PAK&amp;#916;&lt;em&gt;retS&lt;/em&gt; （D&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;) &lt;br/&gt;（有活性的 T6SS）</td><td>实验室菌株</td><td></td><td>参见参考文献16</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa&lt;/em&gt; PAK&amp;#916;&lt;em&gt;retS&lt;/em&gt;&amp;#916;&lt;em&gt;H1-T6SS&lt;/em&gt; （D&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;（T6SS失活）</td><td>本研究</td><td></td><td>上述 &lt;em&gt;H1-T6SS&lt;/em&gt; 通过等位基因交换方法，按照参考文献18中描述的步骤，删除了包含PA0070至PA0095基因的基因簇。上游片段引物用于扩增突变片段，其引物序列为： &lt;br/&gt; 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3'，以及 &lt;br/&gt; 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3'。下游片段引物：&lt;br/&gt; 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3' &lt;pre&gt;5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' &lt;/pre&gt; </td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258-012</td><td>F- &amp;#966;80&lt;em&gt;lac&lt;/em&gt;Z&amp;#916;M15 &amp;#916;(&lt;em&gt;lac&lt;/em&gt;ZYA-&lt;em&gt;arg&lt;/em&gt;F) U169 &lt;em&gt;重组&lt;/em&gt;A1 &lt;em&gt;结束&lt;/em&gt;A1 &lt;em&gt;hsd&lt;/em&gt;R17 (r&lt;sub&gt;k&lt;/sub&gt;-，m&lt;sub&gt;k&lt;/sub&gt;+) &lt;em&gt;pho&lt;/em&gt;A &lt;em&gt;sup&lt;/em&gt;E44 &amp;#955;- &lt;em&gt;thi&lt;/em&gt;-1 &lt;em&gt;gyr&lt;/em&gt;A96 &lt;em&gt;rel&lt;/em&gt;A1 </td></tr><tr><td>pBluescript II SK(+)</td><td>安捷伦</td><td>212205</td><td>该载体表达 &amp;alpha; 肽段 &amp;#946;-半乳糖苷酶用于 &amp;alpha;α-互补</td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td>40时使用 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>默克化学品</td><td>1.10283.0500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）</td><td>Oxoid</td><td>CM109</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器 Genius 3</td><td>IKA</td><td>3340000</td><td></td></tr><tr><td>扫描仪 </td><td>Epson</td><td>V700</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>WPA Biowave</td><td>CO8000 细胞密度计</td><td></td></tr><tr><td>Magenta-gal</td><td>Bioworld</td><td>30350001-1 (715241)</td><td></td></tr><tr><td>Red-gal</td><td>有机化合物研究</td><td>1364c</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;表1. &lt;/strong&gt; 菌株、质粒、材料与试剂的使用。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

一种用于监测t6ss介导的细菌竞争的可视化检测方法

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

VI型分泌系统（T6SS）是一类分子纳米机器，可使革兰氏阴性细菌将蛋白质转运并注入多种靶细胞中1,2。T6SS由13种核心组分构成，其结构与噬菌体的尾管具有相似性3。噬菌体利用尾管和穿刺装置穿透靶细菌的细胞包膜并注入DNA。目前认为，T6SS是一种倒置的噬菌体装置，可在细菌细胞包膜上形成特定通道，将效应蛋白和毒素输送至细胞表面。该过程可能进一步延伸：当细菌与其他细胞接触时，T6SS装置亦可穿孔这些细胞，从而将效应蛋白注入此类靶标。T6SS的尾管和穿刺装置部分分别由Hcp和VgrG蛋白构成4,5。
通过使用多种细菌病原体的研究，已证明T6SS具有多功能性。Vibrio cholerae 的T6SS可通过注射携带C端肌动蛋白交联结构域的“进化”型VgrG蛋白，重塑真核宿主细胞的细胞骨架6,7。另一个显著的例子是近期利用Pseudomonas aeruginosa所证实的，该菌能够以依赖T6SS的方式靶向并杀死其他细菌，从而促进自身在特定微生物生态位及竞争性环境中的定植8,9,10。
在后一种情况下, 三种T6SS分泌蛋白，即Tse1、Tse2和Tse3，已被鉴定为注入靶细菌的毒素（图1）。通过Tsi1、Tsi2和Tsi3免疫蛋白介导的抗毒素机制，供体细胞可免受这些效应因子的有害影响。8,9,10这种抗菌活性可在T6SS功能完整的细菌与同种的T6SS失活菌株或其他细菌物种于固体表面共培养竞争时进行监测。8,11,12,13.
现有的数据强调了细菌竞争实验的数值化方法，包括耗时的菌落形成单位（CFU）计数，该方法在很大程度上依赖于抗生素生产商。对于P. aeruginosa等抗生素耐药菌株，这些方法可能并不适用。此外，随着在超过100种细菌基因组中已鉴定出约200种不同的VI型分泌系统（T6SS）位点14，开发一种便捷的筛选工具显得尤为迫切。我们建立了一种操作简便、仅需常规实验器材和试剂的检测方法。该方法利用报告菌株作为猎物（本实验中为Escherichia coli DH5α），通过lacZ基因的α-互补作用，提供了一种快速且定性的技术，用于监测T6SS依赖性的杀菌/抑菌活性。总体而言，该方法具有直观性，可在琼脂平板上快速识别与T6SS相关的表型。本实验方案可根据其他菌株或细菌种类的具体条件（如培养基、温度或接触时间）进行适当调整。

典型结果如图所示 图1 使用文中所述的菌株和试剂 表1图中所示的平板在过夜培养后进行扫描。“读出-输入”平板显示了本实验所用菌株的系列稀释模式。正如预期的那样， E. coli 猎物斑点（P）过表达的 lacZ 基因在添加了X-gal的培养基上呈蓝色，而供体 P. aeruginosa 菌株（D+, T6SS 活性）和（D-, T6SS 无活性）保持白色。捕食菌与T6SS活性菌株混合后所用的“读出-输出”平板（D+/P) 上出现的斑点显示蓝色猎物消失，表明其已被杀死，这证明了供体具有战胜猎物的能力。蓝色在（D-/P) 平板显示无活性的T6SS供体无法杀死蓝色猎物。
<img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Bacterial interaction diagram; T6SS mechanism; P. aeruginosa attacking E. coli; cytoplasm labeled." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 杀伤作用 大肠杆菌 由具备T6SS功能的 P. aeruginosa P. aeruginosa 将毒素注入 E. coli 以T6SS依赖的方式靶向细胞（白色箭头所示）。两种毒素Tse1和Tse3（橙色和红色圆圈）被注入 E. coli 周质空间并降解肽聚糖9Tse2 毒素（黄色圆圈）被注入 E. coli 细胞质，具有抑菌活性8,10。毒素的协同作用可杀死靶细胞（闪电和头骨图标）。通过检测产生的β-半乳糖苷酶活性，可监测靶细胞的存活情况（另见 图2). P. aeruginosa 通过免疫蛋白 Tsi1、Tsi2 和 Tsi3（分别为橙色、黄色和红色方块）免受毒素活性的影响8,9,10.
<img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="细菌生长实验结果；不同条件下的培养皿示意图；微生物学分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 用于监测T6SS依赖性细菌杀伤作用的琼脂平板实验。 本图上半部分显示的是“读出-输入”平板，包含D-、D+和P输入菌株的系列稀释液。P输入菌株因lacZ基因的α-互补作用呈蓝色，从而产生可切割X-gal的β-半乳糖苷酶。下半部分显示的是“读出-输出”平板，包含活性（D+/P）或非活性（D-/P）T6SS供体菌株P. aeruginosa与E. coli捕食菌混合后的系列稀释液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="柱状图显示 (D+/P) 与 (D-/P) 的数据比较，带有垂直误差线。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. P. aeruginosa 在孵育 5 小时后对 E. coli 杀伤作用的定量分析。 该图展示了步骤 3.4 中描述的 E. coli 的菌落形成单位（CFU）计数结果。结果显示，T6SS+ 与 T6SS- 菌株之间存在 3 倍的差异，表明大部分杀伤作用发生在最初接触的 5 小时内。

我们描述了一种定性检测方法，用于监测由细菌介导的竞争现象 铜绿假单胞菌 VI型分泌系统（T6SS）。该实验依赖于携带特定质粒的大肠杆菌（Escherichia coli）靶细胞的存活/杀伤情况 lacZ-报告基因。该技术可调节用于评估具有VI型分泌系统（T6SS）的微生物的杀菌/抑菌活性。

一种用于监测T6SS介导的细菌竞争的可视化检测方法

VI型分泌系统（T6SSs）是一类分子纳米机器，可使革兰氏阴性细菌将蛋白质转运并注入多种靶细胞中。

以下实验的总体目标是评估两种细菌在相同生态位中生长时相互竞争的能力。具体而言，我们将评估VI型分泌系统（type six secretion system）在这一竞争过程中的作用。该目标通过制备检测输入平板来实现，平板中包含具有活性VI型分泌系统的供体细胞或将成为蓝色的猎物细胞（OnX scale平板）。然后制备测定输出平板，在其上将供体菌株和受体菌株混合。接着孵育平板，以使VI型分泌系统活性得以发生。随后，从输入平板和输出平板制备系列稀释液，并将稀释后的菌液点样于读出用的输入平板和输出平板上。通过简单的肉眼观察，可获得结果显示每个点中蓝色的强弱存在差异，从而指示每种情况下捕食细胞的存活情况。蓝色越深，表明猎物细胞存活越多，即供体细胞的杀伤活性越差。该技术相较于现有的菌落形成单位计数等方法的主要优势在于，本方法操作简便、耗时少，并可直接评估Ⅵ型分泌系统对特定猎物的活性。该技术可评估混合培养物中细菌的密封活性，因此有助于理解为何某些慢性多微生物感染最终会由单一细菌物种主导，例如囊性纤维化患者肺部的假单胞菌感染情况。首先，在LB琼脂或LBA平板上于37摄氏度过夜培养作为供体细胞的铜绿假单胞菌，这些细胞应为VI型分泌系统活性阳性（D阳性）或VI型分泌系统非活性阴性（D阴性）。在本示例中，我们使用了一株具有持续激活H1型VI型分泌系统的铜绿假单胞菌RET S菌株，以及一株等基因突变体，该突变体经基因工程改造缺失了H1型VI型分泌系统的基因簇；通过将DH5α大肠杆菌转化携带允许lacZ基因α互补的质粒，构建E. coli受体细胞（即猎物细胞）。从含有XGL和适当抗生素的LB培养基上的甘油菌种中分离细菌，并于37摄氏度过夜培养。次日挑选蓝色转化子，接种于5毫升含抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，在37摄氏度振荡培养过夜，用于次日实验。准备标记为“检测输入”的LBA平板，分别对应菌株D阳性、D阴性、P，以及标记为“检测输出”的D阴性加P、D阳性加P。对于每份输入菌液，测定其光密度，计算获得相当于1单位OD600细胞密度所需的菌液体积，并将各菌液收集至无菌的1.5毫升微量离心管中。将细菌样品在13,000 RPM下离心一分钟后，用100微升新鲜TSB重悬沉淀，并将每种菌株各取10微升作为单一点样接种于A输入平板上。接着，在第一个离心管中轻轻混合30微升D阳性菌液与30微升P菌液，在第二个离心管中混合30微升D阴性菌液与30微升P菌液。然后，将每种混合液各取20微升作为点样接种于A输出平板上。待点样液滴在酒精灯附近干燥后，将平板置于37摄氏度培养，以使细菌杀灭反应发生。为分析细菌杀灭效果，准备含有40微克/毫升xal的LBA平板。用于检测读数时，在每块平板背面均分为四个相等部分，并标记为“读数输入”（readout input），用于点样分离的细菌，或“读数输出”（readout output），用于点样混合细菌培养物，并将各区域分别标记为10⁰、10⁻¹、10⁻²和10⁻³。每个稀释度将允许在同一接种点内对蓝白斑细菌比例进行半定量评估。使用无菌接种环，从A输入平板和A输出平板上分别挑取单个细菌菌落，各自悬浮于含有1毫升TSB的1.5毫升离心管中。在培养物振荡的同时，将离心管振荡30分钟以充分重悬细菌。准备五组每组三个含有900微升TSB的离心管。然后从每个重悬的样品开始，使用新的枪头进行十倍系列稀释，每次稀释之间短暂涡旋混匀，并将各稀释样品点样于LVA xal平板上，从最稀释的样品开始，至未稀释样品结束。将A输入管中的样品接种至R输入平板，将A输出稀释液接种至R输出平板，每个重复点样20微升，每份样品设三个重复，分别置于平板的四个象限内。为在此阶段定量竞争实验，取A输出样品的10⁻³稀释液各100微升，分别三份点样于LBA xga平板上，于37摄氏度培养过夜，随后在无菌环境中计数蓝色菌落，将平板敞开放置以使多余液体吸收，并于37摄氏度继续培养过夜，此时杀菌过程仍在进行。由于两种菌株仍保持接触，因此在输出分析图像时，可直接扫描平板。斑点若仍呈明显的蓝色，表明大肠杆菌未被杀死。当与本实验中所示的 VI 型分泌系统缺陷菌株共培养时，通常会出现这种情况。以下是本实验所用菌株的读出输入平板的系列稀释结果。正如预期，大肠杆菌（e coli）预先点种的、过表达缺失基因的菌落在添加了XGL的培养基上呈现蓝色，而供体菌肺炎克雷伯菌（p aerogen noses）菌株D，即VI型分泌系统阳性（D阳性）和VI型分泌系统阴性（D阴性）则保持白色。捕食菌与VI型分泌系统阳性菌株D（D阳性P）混合后点种的读出平板上，蓝色的捕食菌消失，表明其已被杀死。这证明了供体菌能够战胜捕食菌。 D 阴性 P 平板上蓝色的持续存在表明无活性的 VI 型分泌系统供体无法杀死蓝色捕食对象。因此，在进行该实验操作时，重要的是要记住，不同细菌种类在生长或 VI 型分泌系统活性方面的需求可能存在差异，因此可能需要对实验条件进行一些调整。此外，还需要注意的是，如果希望评估某一单一物种中的 VI 型分泌系统活性，只要条件允许，必须严格比较该物种的 VI 型分泌系统突变株与其亲本菌株的活性。观看本视频后，您应能更好地理解如何建立视觉化实验，以评估前细胞在与具有完整VI型分泌系统或缺陷型VI型分泌系统的菌株接触后的存活情况。

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

的视觉检测，以监测T6SS介导的细菌竞争

来源： Speare, L., et al. 用于量化Vibrio fischeri 分离株之间竞争相互作用的共培养实验。J. Vis. Exp.

研究细菌菌株间竞争相互作用的共培养实验

来源： Perinbam, K., 和 Siryaporn, A. 利用阿米巴进行快速基于图像的细菌毒力检测。 J. Vis. Exp.

一种基于快速成像的表面诱导细菌毒力筛选检测方法

本视频展示了一种基于荧光显微镜的方法，用于在单细胞水平上研究细菌间的竞争。该方法可深入了解细菌群落的结构与功能。...

细菌共孵育实验：一种基于荧光显微镜的单细胞水平可视化种内细菌竞争的技术

本视频展示了一种用于评估血清中抗体介导的补体依赖性杀菌活性的技术。该方法将分离的血清与致病菌及外源性补体蛋白混合。经过孵育后，将细菌接种于琼脂平板上培养，并通过定量生成的菌落来测定血清的杀菌滴度。...

一种用于检测抗体补体介导杀菌活性的血清杀菌试验

细菌在其生命周期中可能积累有害或有益的突变。在细胞群体中，携带有益突变的个体可能迅速战胜其他个体。本文介绍一种简单的方法，通过使用荧光标记的个体，随时间推移可视化细菌群体内的种内竞争。...

通过共培养荧光标记菌株监测细菌种群内的种内竞争

本文介绍了两种基于显微镜的高通量筛选方法，用于研究参与Brucella感染的宿主因子。Brucella入侵检测法用于鉴定宿主细胞中支持其入侵的关键因子，而终点检测法则用于鉴定支持其胞内复制的宿主因子。尽管这些方法可适用于其他实验体系，本文以HeLa细胞中的siRNA筛选为例，详细说明实验方案的操作流程。...

基于显微镜的高通量筛选参与宿主因素的检测方法 布鲁氏菌 Hela细胞感染

延迟生长抑制试验可用于评估一种细菌分离株对另一种细菌分离株的竞争作用。通过测量产抑制物分离株周围透明圈的范围来定量抑制作用，或通过判断可见抑制范围进行定性评估。...

延迟生长抑制试验定量分析细菌来源抗菌物质对竞争的影响

这种基于分子的方法通过量化独特的基因组DNA条形码，可精确且准确地检测微生物，从而评估细菌的适应性。该方案描述了计算沙门氏菌（Salmonella）菌株竞争指数的方法；然而，该技术可轻松适用于需要对任何遗传上可改造的生物体进行绝对定量的各种实验方案。...

基于数字PCR的竞争指数用于高通量分析细菌适应性 沙门菌

细菌编码了多种参与种间竞争的机制。本文介绍一种基于培养的方法，用于表征细菌分离株之间的竞争相互作用，以及这些相互作用如何影响混合种群的空间结构。...

共培养实验用于量化Vibrio fischeri分离株之间的竞争相互作用

本文描述了一种利用单细胞荧光显微镜技术在共培养条件下观察和定量细菌竞争的方法。...

使用单细胞荧光成像定量细菌间竞争

学习利用VI型分泌系统介导的细菌竞争检测方法，通过铜绿假单胞菌与大肠杆菌的共培养实验，快速评估供体菌对猎物菌的杀伤活性。该视觉检测技术操作简便，可直观观察猎物细胞存活情况。

一种用于监测T6SS介导的细菌竞争的可视化检测方法

探索更多视频