Name: 脑幽静的白细胞的分离与分析伯氏疟原虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学习从感染伯氏疟原虫ANKA的小鼠脑血管中分离粘附性炎症白细胞的方法，利用多色流式细胞术进行免疫表型分析，揭示迁移至脑部的白细胞比例和数量，为脑型疟疾病理机制研究提供重要技术支持。

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作者谨此感谢 Liana Mackiewicz 女士提供的技术协助。本工作得益于维多利亚州政府运营基础设施支持以及澳大利亚政府国家卫生与医学研究理事会 IRIISS 和项目资助 1031212。

1. 用P. berghei-ANKA感染小鼠
<ol>
 <li>解冻一份冻存的P. berghei ANKA 感染红细胞（pRBC）。</li>
 <li>使用双手固定法固定一只对脑型疟疾具有抗性的 BALB/c 供体小鼠（8-12 周龄）。使用 1 ml 胰岛素注射器（28G 针头）向小鼠注射 100–200 μl pRBC。通常情况下，注射 1–2 只供体小鼠。</li>
 <li>在感染后第 4–5 天（p.i.），将供体小鼠从笼中取出，置于工作台或一次性操作垫上。</li>
 <li>轻轻抓住小鼠尾尖进行固定，用小剪刀剪去尾尖约 1 mm。或者，也可使用 25 G 针头在尾部进行小穿刺。</li>
 <li>将小鼠尾静脉的一滴血置于载玻片磨砂端附近。</li>
 <li>将另一张载玻片（推片）以 45° 角接触血滴，待血液沿边缘展开后，均匀地将推片沿载玻片向前推动，制成血涂片。让涂片自然风干。</li>
 <li>将血涂片置于 100% 甲醇中固定 30 秒，随后用新配制的吉姆萨染液染色 10 分钟。</li>
 <li>用流动水冲洗血涂片 1 分钟，风干后在显微镜下观察（100 倍油镜）。计数 1,000 个红细胞中的感染红细胞（pRBC）数量，计算寄生虫血症百分比。供体小鼠的寄生虫血症水平需达到 2.5–5% 后，方可采血用于实验动物感染。</li>
 <li>使用肝素化毛细管通过眼后静脉丛采血法采集供体小鼠血液。所有实验均符合 Walter &amp; Eliza Hall 研究所动物伦理委员会的要求。根据当地动物伦理委员会的规定，也可采用其他采血方法。将所需量的血液溶解于 RPMI 培养基中，终浓度为 1×106 pRBC/0.2 ml。注意，正常小鼠的红细胞压积约为 6×109 个红细胞/1 ml。</li>
 <li>通过腹腔注射（i.p.）向实验用 C57BL/6 小鼠（8–12 周龄）注射 1×106 pRBC/0.2 ml 进行感染。</li>
 <li>为监测感染小鼠的寄生虫血症水平，请参照步骤 1.3–1.8。应从感染后第 2 或第 3 天开始，每 2–3 天测定一次寄生虫血症。</li>
 <li>C57BL/6 小鼠重症疟疾的发病表现可能包括弓背、毛发竖立和活动减少。部分小鼠在此阶段可能恢复，但若进展至失去自我翻正反射，则表明疾病已不可逆，必须实施安乐死。</li>
</ol>
2. 小鼠心脏灌注及脑组织提取
<ol>
 <li>通过将一个500 ml的储液罐固定在连接于60 cm柱架顶部的柱夹上，组装一套手动重力灌注系统。将塑料管连接至储液罐底部，并在管路上安装一个管夹以控制缓冲液流速。将管路连接至23 G针头。用保持在22 °C的PBS充满储液罐，打开管夹，使缓冲液流经管路以排除所有气泡。</li>
 <li>通过吸入CO2处死感染P. berghei ANKA的小鼠。通过检查足底、眼眶和呼吸反应的消失来确认死亡。</li>
 <li>将已处死的小鼠仰卧位固定在塑料托盘内的泡沫解剖板上，前后肢用针固定。根据当地动物伦理委员会的要求，可在开始心脏灌注前给予麻醉。</li>
 <li>用70%乙醇擦拭腹部表面。</li>
 <li>使用大剪刀和镊子沿中线切开皮肤，暴露胸腔。将皮肤向两侧翻开并用针固定。</li>
 <li>用精细镊子夹住胸骨，剪断膈肌，并沿胸骨两侧剪断肋骨。注意避免损伤任何大血管。</li>
 <li>将肋骨笼通过胸骨松散地固定在头部旁边。</li>
 <li>用精细镊子夹住心室，用精细剪刀小心剪开右心房。</li>
 <li>当PBS正在流动时，将连接至重力灌注系统的23 G针头插入左心室，朝向升主动脉方向，针尖插入深度仅为0.5 cm。</li>
 <li>灌注小鼠5分钟，或直至流出液变澄清。</li>
 <li>取下固定针，将小鼠翻转至腹部朝下。用70%乙醇擦拭头部。</li>
 <li>使用大剪刀，在颈椎脊髓区域上方做一个切口。</li>
 <li>使用精细剪刀从颅底开始，沿中线向头侧做一尾-头方向的切口，并剥离皮肤以暴露颅骨。</li>
 <li>固定头部，将小剪刀的刀片分别插入两侧眼眶，于两眼眶之间做一剪切。</li>
 <li>沿矢状缝做一纵向切口，并小心将两侧大脑半球对应的颅骨向外剥离。</li>
 <li>使用刮勺轻轻抬起脑组织，将其放入含有RPMI培养基的10 ml离心管中。</li>
</ol>
3. 脑滞留白细胞（BSL）的分离
<ol>
 <li>在安全柜中操作，将新鲜收获的脑组织置于含有 3–5 ml RPMI 组织培养基的培养皿中的不锈钢细胞筛（40–60 目）上。</li>
 <li>将脑组织切成小块。</li>
 <li>使用晶体冲头将脑组织小块压过细胞筛。</li>
 <li>将脑匀浆转移至 10 ml 离心管中，在 4 °C 下以 250 × g 离心 10 分钟。</li>
 <li>将沉淀溶解于 3 ml RPMI 培养基中，其中含有 0.05% Collagenase D 和 2 U/ml DNAse I。</li>
 <li>室温下旋转孵育 30 分钟。通过将混合物压过 70 μm 尼龙细胞筛和/或在冰上孵育 5 分钟，去除细胞碎片。</li>
 <li>将脑匀浆铺于 7 ml 30% Percoll 垫层上，在室温下以 400 × g（无刹车）离心 20 分钟。</li>
 <li>将沉淀重悬于 1 ml 红细胞裂解缓冲液中，冰上孵育 5 分钟以裂解黏附的红细胞（pRBC），这些红细胞无法通过心脏灌注从脑组织中完全去除。</li>
 <li>加入 9 ml RPMI 培养基，洗涤细胞并在 4 °C 下以 250 × g 离心 10 分钟。</li>
 <li>将含有 BSL 的沉淀重悬于 50–100 μl RPMI 培养基中，并将细胞转移至 Eppendorf 管。</li>
 <li>取 5–10 μl 细胞样品，用台盼蓝按 1:2 比例稀释，用于鉴定活细胞。</li>
 <li>使用血细胞计数板在显微镜下计数活细胞。从感染后第 6 天（p.i.）开始，当感染 P. berghei ANKA 的小鼠出现神经系统症状时，可回收 20,000–100,000 个 BSL。</li>
</ol>
4. 通过多色流式细胞术对生物安全等级实验室的免疫表型分析
<ol>
 <li>在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 10 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 50 μl 染色缓冲液（PBS，1% 胎牛血清（FCS），2 mm EDTA）中。</li>
 <li>加入1 μl纯化的抗CD16/32抗体（Fc阻断剂）。</li>
 <li>将细胞在冰上孵育10分钟。</li>
 <li>用1 ml染色缓冲液洗涤细胞，在4 °C下以250 × g离心10分钟，吸除上清液。</li>
 <li>在含有已预先确定最佳稀释浓度的所需荧光抗体的 50 μl 染色缓冲液中重悬细胞 即 抗CD4、抗CD8、抗TCR和抗NK1.1</li>
 <li>冰上孵育1小时。</li>
 <li>用1 ml染色缓冲液洗涤细胞，在4 °C下以250 × g离心10分钟，吸除上清液。</li>
 <li>在100 μl PBS中重悬细胞。</li>
 <li>将细胞转移至流式细胞术塑料管中。</li>
 <li>使用流式细胞仪，至少采集 5,000–10,000 个细胞事件。根据需要设置相应的未染色细胞对照和荧光补偿样本。</li>
 <li>使用适当的流式细胞术软件分析结果。</li>
</ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

脑脊液（BSL）的分离与分析是一种可用于表征和定量实验小鼠模型中因组织损伤或感染而迁移至脑部的炎性细胞的方法。在器官提取及后续细胞分离之前，通过心内灌注清除血液成分，有助于防止循环中的非炎性白细胞污染炎性细胞样本。在某些嗜神经性感染（如小鼠脑脊髓炎病毒）中，炎性细胞可浸润脑实质5，此时该步骤可能并非必需；但在疟疾感染的大鼠模型中，这一操作尤为重要，因为感染的红细胞和炎性白细胞主要滞留在血管内，而非浸润脑组织。因此，对感染疟疾的小鼠进行心内灌注，不仅应推荐用于BSL分析，还可用于评估寄生虫在组织中的滞留情况10,11。与非炎性循环白细胞类似，疟原虫的未成熟形态无法黏附于血管内皮，应可通过灌注过程被清除；而黏附性的感染红细胞（pRBC，即成熟的裂殖体）则似乎仍保留在脑血管内。P. berghei ANKA 转基因疟原虫已成功构建并表达荧光素酶12，为这类分析提供了有价值的工具。在感染表达荧光素酶的虫株后，可通过IVIS系统对灌注后的动物脑组织进行成像，以确定寄生虫在组织中的滞留情况10,11。将灌注动物在感染后第6–7天的寄生虫滞留情况...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;溶液与缓冲液&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>吉姆萨伊红亚甲蓝溶液</td><td>默克密理博</td><td>1.09204.0500</td><td>在蒸馏水中按1:10比例稀释</td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td></td><td></td><td>小鼠张力 </td></tr><tr><td>小鼠等渗 PBS</td><td></td><td></td><td>20 mM 磷酸钠，0.149 NaCl，pH 7.3</td></tr><tr><td>0.4%台盼蓝 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>T-8154</td><td>1:2 稀释</td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>沃辛顿生物化学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNAse）I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4263-5VL</td><td>从牛胰腺</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>PBS 中的 30% 溶液 </td></tr><tr><td>超纯 Tris</td><td>Invitrogen</td><td>15505-020</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵（NH₄Cl）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>分析纯</td><td>10017</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>17 mM Tris，14 nM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl，pH 7.2</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>1009</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐</td><td>默克</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M，pH 7.2</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;抗体与偶联物&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/CD32（Fc 封闭抗体），克隆株 2.4G2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>1 &amp;mu;50升 &amp;mu;l 染色缓冲液（0.5 mg/50 ml）</td></tr><tr><td>FITC-抗小鼠 CD4，克隆 H129.19</td><td>BD Pharmingen</td><td>553651</td><td></td></tr><tr><td>PE-抗小鼠 NK1.1，克隆 PK136</td><td>BD Pharmingen</td><td>553165</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5-抗小鼠 CD8，克隆 53-6-7</td><td>BD Pharmingen</td><td>551162</td><td></td></tr><tr><td>APC-抗小鼠 TCR-&amp;#946;，克隆 H57-597</td><td>BD Pharmingen</td><td>553174</td><td></td></tr><tr><td>PE-抗小鼠 CXCR3，克隆 220803</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1685P</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CCR5 抗体，克隆号 C34-3448</td><td>BD Pharmingen</td><td>559922</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Pharmingen</td><td>551419</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器与材料&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>SuperFrost 显微镜载玻片</td><td>Lomb Menzel-Gl&amp;#228;血清</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖镊、剪刀</td><td>REDA 仪器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml PBS 储液槽</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>橡胶管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>23G针头</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>含金属筛网的细胞解离试剂盒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 尼龙细胞滤网</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>GmbH Neubauer</td><td>717810</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术管</td><td>BD Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

从感染plasmodium berghei anka小鼠中分离和分析脑滞留白细胞

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

我们描述了一种从感染P. berghei ANKA小鼠的脑血管中分离和表征黏附性炎性细胞的方法。易感小鼠品系感染该寄生虫株后，会引发实验性脑型疟疾，这是一种神经综合征，可模拟人类中由Plasmodium falciparum引起的重症疟疾的某些重要特征1,2。疟疾红细胞期的成熟形态会在感染红细胞表面表达寄生虫蛋白，使其能够与血管内皮细胞结合。此过程导致血流受阻，引起缺氧和出血3，并刺激炎性白细胞募集至寄生虫滞留部位。
与其他感染（例如嗜神经病毒4-6）不同，疟原虫寄生的红细胞（pRBC）以及相关的炎症性白细胞均滞留在血管内，而不会浸润脑实质。因此，为了避免滞留的白细胞被非炎症性的循环细胞污染，本实验在器官取出和组织处理前，必须对感染小鼠进行充分的心内灌注，以清除血液成分。灌注完成后，取出大脑并切成小块。随后使用胶原酶D和DNA酶I进行酶解处理，进一步破坏组织结构。将所得脑匀浆在Percoll梯度离心液上离心，从而将脑内滞留的白细胞（BSL）与髓鞘及其他组织碎片分离。分离后的细胞经洗涤后，用血细胞计数板计数，并用荧光标记抗体染色，用于后续的流式细胞术分析。
该方法可对响应多种刺激（包括脑卒中以及病毒或寄生虫感染）而迁移至脑组织的炎症性白细胞进行全面的表型表征。该方法还为临床前动物模型中新型抗炎治疗手段的评估提供了有效工具。

图2结果显示了从灌注或未灌注的疟疾感染小鼠及未免疫对照小鼠脑组织中回收的不同脑脊液样（BSL）细胞群体的百分比和绝对数量。分离的BSL细胞按照方案文本所述，使用PE标记的抗NK1.1抗体和APC标记的抗TCR-β抗体进行染色。与先前的研究结果一致7-9，在灌注的疟疾感染小鼠（感染后第6天）脑组织中，αβTCR+ T细胞在BSL细胞群中占比较高。而在未灌注动物的脑组织中，该细胞群体的比例明显偏低（图2A-B）。未灌注脑组织中T细胞频率的明显降低，与双阴性细胞（αβTCR- NK1.1-）比例和总数显著升高相关（图2A-B）。在未灌注的脑组织中，双阴性细胞的高比例和高数量不仅见于疟疾感染小鼠，也见于未免疫对照小鼠，提示这些细胞是存在于脑血管中的非炎症性白细胞，若未进行心内灌注，则会与炎症细胞一同被回收。
图3和图4展示了BSL分析的另外两个示例。简言之，将C57BL/6小鼠感染P. berghei ANKA（1×106 个感染红细胞）。已有研究7-...

本文介绍了一种从感染约氏疟原虫ANKA株（Plasmodium berghei ANKA）的小鼠脑血管中分离黏附性炎性白细胞的方法。该方法可通过荧光标记抗体染色后进行流式细胞术分析，对分离得到的白细胞进行定量以及表型鉴定。

从感染Plasmodium berghei ANKA小鼠中分离和分析脑滞留白细胞

我们描述了一种从感染伯氏疟原虫ANKA株（P. berghei ANKA）小鼠的脑血管中分离和鉴定黏附性炎性细胞的方法。

本实验的总体目标是从感染疟原虫（plasmodium burge eye anca）并诱发实验性脑疟疾的小鼠脑血管中分离出黏附的炎症性白细胞。通过注射感染疟原虫（plasmodium berge eye anca）寄生的红细胞使小鼠感染。当小鼠开始出现疾病症状后，采用经口灌注法清除疟疾感染小鼠体内的循环细胞。随后收获脑组织，并用酶消化组织以分离出炎性白细胞。接着进行多色流式细胞术以进行免疫表型分析。对脑内滞留的白细胞进行数据分析，可揭示迁移至疟疾感染小鼠脑内的白细胞百分比及绝对数量。该方法有助于回答疟疾发病机制领域中的关键问题，例如在不同实验条件下，哪些类型的炎性细胞会迁移至感染动物大脑中寄生虫滞留的部位。本方法的可视化演示至关重要。灌注步骤难以掌握，因其既需要速度，又需小心避免损伤重要血管。本实验部分操作的演示者包括：动物技术员莉安娜·麦克伊克（Leanna Mcic）、维多利亚女士（Ms. Victoria）、博士生里克（Rick），以及来自我实验室的博士后研究员莉莎·艾兹博士（Dr. Lisa Aez）。开始本实验方案时，先将小鼠感染 p. berghei anca。取出冻存的 p. berghei anca 感染红细胞（pRBCs） aliquot，使其恢复至室温以解冻。从笼中取出一只8至12周龄的供体小鼠，放置于工作台上。用拇指和食指抓住小鼠颈部的皮肤。将小鼠翻转，向其腹腔注射 100 至 200 微升的伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）眼液。通常情况下，需对两只供体小鼠注射 PbCS。注射后，将小鼠放回笼中，于感染后 4 至 5 天进行后续操作。将供体小鼠从笼中取出，放置于工作台上。取小鼠尾静脉的一滴血，滴于载玻片磨砂端附近。将另一张载玻片以45度角倾斜，从血滴后方推入。 当血液沿边缘扩散后，将推片均匀地推过载玻片以制备血涂片。让涂片自然风干以固定血细胞。将玻片浸入100%甲醇中30秒。然后将玻片浸入 freshly prepared GIM ZA 染液中染色 10 分钟，GIM ZA 染色后用流水冲洗玻片 30 秒。让玻片自然干燥，随后使用 100 × 油镜在显微镜下观察。计数 1000 个红细胞中的 PRBC 数量，并计算寄生率百分比。若供体小鼠的寄生率已达到 2.5% 至 5% 的要求水平，则在麻醉条件下通过心脏穿刺或使用肝素化毛细管通过眼后静脉丛采血收集供体小鼠血液。将血液溶解于RPMI培养基中，最终浓度为每只小鼠0.2毫升中含有1×10⁶个PRBC。需注意，正常小鼠的血细胞比容约为每毫升6×10⁹个红细胞。实际上，可通过腹腔注射向8至12周龄的实验用C57BL/6小鼠每只给予0.2毫升含1×10⁶个PRBC的悬液，方法同前。为了监测感染小鼠的寄生虫血症水平，按之前方法制备血涂片。应从感染后第2或第3天开始，每两到三天检测一次寄生虫血症，自第5天起持续进行。当寄生虫水平超过5%后，需每天监测小鼠是否出现重症疟疾症状，感染小鼠通常在感染后约第6天出现神经系统症状。通过吸入二氧化碳对感染小鼠实施安乐死，并立即按照随附文件所述用磷酸盐缓冲液（PBS）进行灌注。该操作中最困难的部分是心脏内灌注。以下是一系列故障排除提示：将小鼠固定在解剖板上的泡沫塑料中，置于解剖托盘内。用70%乙醇擦拭腹部表面，然后使用大剪刀和镊子沿中线切开皮肤以暴露胸腔，将皮肤向两侧翻开并用针固定。用精细镊子夹住胸骨，剪断膈肌及胸骨两侧的肋骨，切断肋骨。注意不要损伤任何大血管。将胸骨附近的肋骨笼松松地固定在头部旁边。用精细镊子夹住心室，用精细剪刀小心剪开右心房。将连接重力灌注系统的23号针头插入左心室，方向朝向升主动脉。在PBS运行的同时，仅将针头尖端插入0.5厘米，灌注小鼠5分钟，或直至流出液变澄清。灌注完成后，解剖脑组织并将其放入含有RPMI培养基的10毫升离心管中。将新鲜获取的脑组织置于培养皿中的40至60目不锈钢细胞筛网上，培养皿内含3至5毫升RPMI组织培养基。将脑组织切成小块。然后使用晶体冲棒将脑组织小块通过细胞筛滤器。将脑匀浆转移至10毫升离心管中，在4摄氏度下以250 × g离心10分钟。离心后，弃去上清液，并将沉淀物溶解于3毫升RPMI培养基中。加入胶原酶 D 和 DNA 酶的培养基。室温下旋转孵育 30 分钟。将混合物通过 70 微米尼龙细胞滤网，以去除细胞碎片。然后在冰上孵育5分钟，接着将样品转移至10毫升离心管中。小心地将脑匀浆液铺加在7毫升30% Percoll垫上，于室温下以400 × g离心20分钟，离心时关闭刹车。弃去上清液后，将沉淀物重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中，再于冰上孵育5分钟。为了裂解未通过口腔内灌注从脑组织中清除的贴壁型外周血单个核细胞（pbcs），加入9毫升RPMI培养基洗涤细胞，并在4°C下以250 × g离心10分钟。将脑组织中滞留的白细胞或含有BSL的沉淀重悬于50至100微升RPMI培养基中，转移细胞至微量离心管，在显微镜下使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法计数活细胞。感染后第6天，一旦获得活细胞计数，即可回收20,000至100,000个BSLs。随后将细胞制备用于流式细胞术分析。该操作步骤的详细信息见随附文件，但此处首先进行简要概述。将从每个脑组织中分离的所有细胞在1.5毫升微量离心管中离心，并用含抗CD16和CD32封闭抗体的染色缓冲液重悬。冰上孵育10分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞，再次离心，并重悬于含有抗CD4、抗CD8、抗TCR和抗NK1.1荧光抗体的染色缓冲液中。细胞于冰上避光孵育1小时，随后用染色缓冲液洗涤并离心。离心后，将细胞重悬于PBS中，并在流式细胞仪上至少采集5,000至10,000个事件。使用适当的流式细胞术软件分析所得数据。BSL细胞群来自灌注或未灌注、感染疟疾及未感染的对照小鼠脑组织，并用PE标记的抗NK1.1抗体和PC标记的抗TCRβ抗体进行染色。这些点图显示了灌注或未灌注、疟疾感染及未感染对照小鼠中 NK 细胞、T 淋巴细胞、NK1.1 阳性 TCR 阳性细胞和双阴性细胞（NK1.1 阴性 TCR 阴性）的百分比，结果与既往研究一致。在感染疟疾后第6天经灌注的小鼠脑组织中，αβ TCR 阳性 T 细胞在脑内淋巴细胞（BSL）群体中占比较高。该细胞群体在未灌注动物的脑组织中明显比例偏低。未灌注脑组织中T细胞频率的表观减少与这些动物脑组织中双阴性细胞的比例和总数显著升高相关。未灌注脑组织中双阴性细胞比例和数量的升高不仅见于疟疾感染小鼠，也见于未免疫的对照组，提示这些细胞是存在于脑血管中的非炎症性白细胞，若未进行心内灌注，便会与炎症细胞一同被回收。在进行该操作时，重要的是要牢记在器官提取前对感染小鼠进行充分的心内灌注，以避免滞留的白细胞被非炎症性的循环细胞污染。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过流式细胞术分离和分析恶性疟原虫感染小鼠脑内滞留的白细胞。

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免疫学与感染

脑幽静的白细胞的分离与分析<em&gt;伯氏疟原虫</emANKA感染的小鼠

采用活体显微技术追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症事件的时间与空间变化。...

使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

介绍了一种从小鼠脑组织中快速获取浸润性白细胞的方法。该方法利用连续Percoll梯度和不连续Ficoll梯度，选择并纯化富含白细胞的组分层。分离得到的白细胞随后可通过流式细胞术进行表征分析。...

脑浸润性白细胞的分离

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小鼠模型中使用减毒活子孢子进行皮内免疫

本文介绍了一种从小鼠皮肤及引流淋巴结中分离髓系细胞的实验方案，该方法适用于在皮肤内注射疟原虫（Plasmodium）子孢子后的情况。对所获取细胞进行流式细胞术分析，可可靠地检测皮肤及引流淋巴结对寄生虫引发的炎症反应特征。...

小鼠皮肤及引流淋巴结中髓系细胞的分离——基于活体减毒疫苗皮内免疫后 疟原虫 子孢子

我们描述了一种实验性脑型疟疾的小鼠模型，并展示了如何追踪炎症和微血管病理变化 体内 使用磁共振成像。...

体内追踪实验性脑型疟疾模型中水肿发展及微血管病理变化的磁共振成像研究

由于啮齿类疟原虫在生命周期和生物学特性上与人类疟原虫具有显著相似性，啮齿类疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的工具。本文中，我们对野生型和转基因啮齿类疟原虫进行表型分析时所使用的一些最重要技术进行了标准化。...

啮齿类疟原虫无性与有性血液阶段及蚊期阶段的表型分析

本实验方案的总体目标是指导如何从中枢神经系统中提取、培养和分离小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞，随后用原生动物寄生虫进行感染。...

同时分离原代星形胶质细胞和小胶质细胞用于原生动物寄生虫感染研究

疟疾通过子孢子阶段的接种传播 疟原虫 通过感染的蚊子传播。转基因 疟原虫 使我们能够更深入地理解疟疾的生物学特性，并直接推动了疟疾疫苗的研发工作。在此，我们描述了一种简化的转基因制备方法 疟原虫伯氏疟原虫...

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从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

疟原虫的有性发育发生在蚊子的中肠内。靶向寄生虫的有性阶段是阻断传播的一种有前景的策略。我们开发了Ookluc，这是一种在合子形成后表达纳米荧光素酶的转基因P.

Ookluc：一种用于鉴定阻断传播化合物的Plasmodium berghei菌株

学习从感染伯氏疟原虫ANKA的小鼠脑血管中分离粘附性炎症白细胞的方法，利用多色流式细胞术进行免疫表型分析，揭示迁移至脑部的白细胞比例和数量，为脑型疟疾病理机制研究提供重要技术支持。

从感染Plasmodium berghei ANKA小鼠中分离和分析脑滞留白细胞

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