脑幽静的白细胞的分离与分析伯氏疟原虫
2013年1月2日
贴壁脑血管的炎性白细胞隔离的方法伯氏疟原虫 ANKA感染的小鼠进行说明。可以量化的方法，以及后的孤立白细胞表型特征流式细胞仪荧光抗体染色和随后的分析。
该程序的总体目标是从伯氏疟原虫眼 anca 感染小鼠的脑血管中分离出粘附的炎性白细胞，以诱导实验性脑疟疾。小鼠通过注射感染 Plasmodium berge eye anca 寄生红细胞。在小鼠开始出现疾病迹象后，通过口内灌注去除疟疾感染小鼠的循环细胞。
然后收获大脑，用酶消化组织以分离炎性白细胞。然后进行多色流式细胞术以检测免疫表型。对结果数据的大脑隔离白细胞分析揭示了迁移到疟疾感染小鼠大脑的白细胞的百分比和绝对数量。
这种方法可以帮助回答疟疾发病机制领域的关键问题，例如在不同实验条件下，什么类型的炎症细胞迁移到受感染动物大脑中寄生虫隔离的部位。这种方法的视觉演示至关重要。灌注步骤很难学习，因为它们需要速度和小心，以免损坏任何重要的血管动物技术员 Leanna Mcic、Victoria 女士、博士生 Rick 和我实验室的博士后 Lisa Aez 博士将演示该程序的某些部分。
通过用 p berge eye anca 感染小鼠来开始此方案，解冻冷冻保存的 P berge eye anca 寄生红细胞或 PBCS，使其达到室温。从笼子中取出一只 8 到 12 周大的供体小鼠，并将其放在工作站上。用食指和拇指抓住脖子的褶皱。
将鼠标翻转过来，将 100 至 200 微升疟原虫眼注射到腹膜腔中。通常，将两只供体小鼠注射 PBCS。注射后，在感染后 4 到 5 天将小鼠放入笼子中。
从笼子中取出供体鼠标并将其放在工作站上。将一滴来自小鼠尾静脉的血滴放在磨砂末端显微镜载玻片的末端附近。将第二张载玻片以 45 度角放置，然后将其放回血滴中。
一旦血液沿边缘扩散，将铺展器载玻片均匀地推过显微镜载玻片，使血涂片。让涂片风干以固定血涂片。将玻片浸入 100% 甲醇中 30 秒。
然后在新鲜制备的 GIM ZA 中对载玻片进行染色 10 分钟，用 gim za 染色后，用流水冲洗载玻片 30 秒。让载玻片风干，然后使用 100 x 油浸镜头在显微镜下检查它。列举 1000 个红细胞内的 PRBC，如果供体小鼠已达到所需的 2.5% 至 5% Parsit 水平，则计算百分比para 在麻醉下通过心脏穿刺或使用肝素化微量血细胞比容毛细管眶后出血从供体小鼠收集血液。
将血液溶解在 RPMI 培养基中，终浓度为 1 倍 10 至 6 PRBC/0.2 毫升/小鼠。考虑一下，正常小鼠的血细胞比容大约是每毫升红细胞的 6 乘以 10 到 9 分。事实上，8 至 12 周龄的实验 C 57 黑 6 只小鼠像以前一样在 0.2 毫升腹膜内注射 1 次 10 至 6 个 PRBC。
为了监测受感染小鼠的 para 水平，请像以前一样准备血涂片。从感染后第 5 天开始，应每 2 到 3 天测定一次 Para。感染后。
一旦 para 水平大于 5%，并且小鼠在感染后第 6 天左右出现神经系统症状，则每天监测小鼠是否有严重疟疾的迹象。通过吸入 CO2 对感染的小鼠实施安乐死，并立即如随附文件所述灌注 PBS。该程序最困难的方面是心内灌注。
此处概述了一系列故障排除提示：将鼠标固定在聚苯乙烯泡沫塑料解剖板上。在解剖托盘内。用 70% 乙醇擦拭腹侧，然后用大剪刀和镊子沿中线打开皮肤，露出胸腔，将皮肤折叠并固定在两侧。
用细镊子夹住胸骨，切开隔膜和胸骨两侧，切断肋骨。注意不要损伤任何大血管。将胸骨松散地固定在头部旁边。
用细镊子固定心室，用细剪刀小心地切开右心房。将连接到重力灌注系统的 23 号针头插入左心室，朝向升主动脉。当 PBS 运行时，仅插入 0.5 cm 的针尖，灌注小鼠 5 分钟或直到流出物清澈为止。
灌注后，解剖大脑并将其放入含有 RPMI 的 10 毫升离心管中。中等。将新鲜收获的大脑放在含有 3 至 5 毫升 RPMI 组织培养基的培养皿中 40 至 60 目大小的不锈钢细胞过滤器的顶部。将脑组织切成小块。
然后使用晶体柱塞将小块脑组织推入细胞过滤器。将脑匀浆转移到 10 毫升试管中，并在 4 摄氏度下以 250 倍 G 离心 10 分钟。旋转后，弃去上清液，将沉淀溶解在 3 毫升 RPMI 中。
含有胶原酶 D 和 DNA swan 的培养基。在室温下旋转混合物 30 分钟。将混合物推入 70 微米尼龙细胞过滤器，去除任何细胞碎片。
然后在 10 mL 试管中孵育后在冰上孵育 5 分钟。小心地将脑匀浆覆盖在 7 毫升 30% /次垫上，在室温下以 400 倍 G 离心 20 分钟，并折断。弃去上清液后，将沉淀重悬于 1 毫升红细胞裂解液、缓冲液中，并在冰上孵育 5 分钟。
裂解粘附的 PBCS，这些 PBCS 不会通过口内灌注从大脑中去除。加入 9 ml RPMI 培养基洗涤细胞，并在 4 摄氏度下以 250 倍 G 离心 10 分钟。复苏，将大脑隔离的白细胞或含有 BSL 的沉淀悬浮在 50 至 100 微升 RPMI 培养基中，并将细胞转移到微量离心管中，在显微镜下使用血细胞计数器和 trian 蓝排除对活细胞进行计数。
感染后 6 天，一旦获得活细胞计数，就可以回收 20， 000 至 100， 000 个 BSL。制备细胞用于通过流式细胞术进行分析。此过程的详细信息在随附的文档中给出，但首先在此处进行总结。
将从每个脑中分离的所有细胞离心在 1.5 毫升微量离心管中，并在含有抗 CD 16 和 CD 32 阻断抗体的染色缓冲液中重悬。在冰上孵育 10 分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞，再次离心，并重悬于含有抗 CD 4、抗 CD 8、抗 TCR 和抗 NK 1.1 荧光抗体的染色缓冲液中。将细胞在冰上孵育 1 小时，用染色剂、缓冲液洗涤并离心。
离心后，将细胞重悬于 PBS 中，并在流式细胞仪上采集至少 5， 000 至 10， 000 个事件。使用适当的流式细胞术软件分析所得数据。从灌注或 UN 灌注、疟疾感染和幼稚对照小鼠的大脑中回收 BSL 种群，并用 pe、抗 NK 1.1 和 PC 抗 TCR β 抗体染色。
这些点图描述了 NK 细胞、T 淋巴细胞、NK 1.1 阳性 TCR 阳性细胞和双阴性细胞的百分比。灌注或未输注、疟疾感染和幼稚对照小鼠的 NK 1.1 阴性 TCR 阴性与先前的发现一致。在感染后第 6 天，Alpha β TCR 阳性 T 细胞在灌注疟疾感染小鼠大脑中占 BSL 库的高比例。
这个群体在未灌注动物的大脑中似乎明显代表性不足。未灌注大脑中 T 细胞频率的明显降低与这些动物中双阴性细胞的百分比和总数相当高有关。不仅在疟疾感染的小鼠中检测到未灌注大脑中高百分比和数量的双阴性细胞，而且在幼稚的对照中也检测到这些细胞，这表明这些细胞是存在于脑血管中的非炎性白细胞，如果不进行心内灌注，这些细胞会与炎性细胞一起恢复。
在尝试此程序时，重要的是要记住在器官提取之前对受感染的小鼠进行广泛的心脏内充注，以避免隔离的白细胞被非炎症循环细胞污染。观看此视频后，您应该对如何通过流动几何学从疟原虫感染的小鼠中分离和分析脑隔离的白细胞有很好的了解。
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概述
本文描述了一种从Plasmodium berghei ANKA感染小鼠的脑血管中分离粘附性炎症白细胞的方法。该技术能够使用荧光抗体和流式细胞术对这些白细胞进行定量和表型表征。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 传染病学
背景
- 实验性脑疟疾是在感染了Plasmodium berghei ANKA的小鼠中诱导的。
- 了解炎症白细胞在脑中的作用对于研究疟疾病理学至关重要。
- 分离这些细胞允许对它们的特性和行为进行详细分析。
- 流式细胞术是一种用于白细胞免疫表型分析的强大工具。
研究目的
- 开发一种可靠的从脑中分离白细胞的方法。
- 量化和表征疟疾感染期间的炎症反应。
- 增强对脑疟疾免疫机制的理解。
使用的方法
- 通过注射寄生红细胞感染小鼠Plasmodium berghei ANKA。
- 进行口腔灌流以去除疟疾感染小鼠中的循环细胞。
- 收集脑组织并用酶消化以分离白细胞。
- 对分离的细胞进行多色流式细胞术以进行免疫表型分析。
主要结果
- 该方法成功地从脑血管中分离出粘附性炎症白细胞。
- 流式细胞术分析揭示了迁移到脑中的白细胞的百分比和绝对数量。
- 表型表征提供了对疟疾感染期间免疫反应的见解。
- 结果有助于更好地理解脑疟疾的病理生理学。
结论
- 该分离方法对于研究疟疾背景下的炎症白细胞是有效的。
- 研究结果可能为脑疟疾的治疗策略的未来研究提供信息。
- 这种方法可以应用于其他神经炎症模型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation and phenotypic analysis of brain-sequestered leukocytes in Plasmodium berghei ANKA-infected mice addresses a critical need for mechanistic de-risking in neuroinflammatory disease models. This method enables precise quantification and characterization of inflammatory cell migration to the brain vasculature, supporting predictive confidence in target validation and translational research for neuroinflammation and infectious disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell recruitment and phenotype at sites of vascular sequestration.
- Supports biological de-risking by distinguishing inflammatory from non-inflammatory leukocyte populations.
- Facilitates functional target validation for anti-inflammatory or immunomodulatory interventions in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Provides a validated workflow for preparing brain-sequestered leukocytes for downstream flow cytometry analysis.
- Ensures assay reproducibility by standardizing perfusion and tissue processing steps to minimize contamination.
- Generates quantitative outputs suitable for comparative compound evaluation in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of cerebral malaria and neuroinflammation for translational biomarker studies.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical assessment of therapeutic candidates targeting leukocyte migration or activation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust immune cell phenotyping data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven analysis of immune cell dynamics in disease-relevant mouse models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on leukocyte recruitment and phenotype in response to infection or intervention.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative flow cytometry data for immune cell profiling.
- Analytics: Provides absolute and relative leukocyte counts, enabling statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical efficacy studies in neuroinflammatory disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to other neuroinflammatory or infectious disease research pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune cell targeting strategies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of immune cell isolation and analysis workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for immunomodulatory candidates and improves capital allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of assets targeting neuroinflammatory pathways.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in animal perfusion, tissue processing, and flow cytometry.
- Demands access to specialized instrumentation for cell isolation and multicolor flow cytometry analysis.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of perfusion and staining protocols to ensure data comparability.
- Adaptable to other disease models with appropriate validation of tissue processing steps.
- Potential limitations include technical variability in perfusion and cell recovery, impacting downstream analysis.
