单细胞测量液泡破裂引起细胞内病原体

该实验监测单细胞中细胞内病原体引发的 VA 破裂。首先用 CCF 4：00 AM 染料加载细胞，该染料被细胞酯酶裂解。然后准备并将 FL 神经细菌应用于 CCF 上，四个加载的细胞在 37 摄氏度下孵育细胞，以便细菌侵袭宿主细胞。

然后确定在 450 纳米和 535 纳米通道中发射的强度比。结果显示胞质溶胶中存在病原体，因为它对高通量 lys 的适应性。该技术通过解决宿主病原体相互作用过程中细菌亚细胞定位的关键问题来促进新型抗生素的鉴定。

我们与我的同事 Tran Vanu 一起，对开发具有高时间分辨率的细胞内病原体的方法感兴趣。这导致了 CCF 四种 β-内酰胺酶常规 ular 破裂测定的建立。今天，这种方法将由实验室的两名研究生 Nora MellU 和 Charlotte Keller 以实验方式提出 将野生型和突变型细菌菌株接种在含有每毫升 50 微克氨苄青霉素的 8 毫升 TCSB 中，将培养物置于 37 摄氏度摇床中，现在接种 5 次 10 至 3 个 Hela 细胞每孔。

在 100 微升含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素链霉素培养物的 DMEM 中，第二天在 5% 二氧化碳培养箱中，细胞在补充有 50 微克/毫升氨苄青霉素的 TCSB 中以 100 分之一稀释度的细菌传代培养在 37 摄氏度的摇床中生长两个半小时。现在，为了加载 hela 细胞，准备 CCF 4：00 AM 染料，在 em 缓冲液中，用 PBS 洗涤细胞一次。然后在室温下在黑暗中每孔加入 25 微升 CCF 4：00 AM 上样混合物 2 小时 30 分钟，以制备用于感染的细菌，用 500 微升 PBS Resus 洗涤一次后离心沉淀 1 毫升培养物，将细菌悬浮在 500 微升 PBS 中，补充 10 微克/毫升多元醇赖氨酸和 40 微克/毫升 β-内酰胺酶。

在室温下在旋转轮上孵育 10 次，然后用 500 微升 PBS 洗涤一次，并将每个细菌沉淀重悬于 500 微升 1 毫摩尔丙磺舒的 EM 缓冲液中，用 150 微升 1 毫摩尔的 prob 在 EM 缓冲液中洗涤细胞一次。接下来，在 100 微升 1 毫摩尔探测溶液中稀释 10 微升细菌，并将其分配到 Hela 细胞的每个孔中。在室温下避光孵育 15 分钟后，将板转移至 37 摄氏度 1 小时。

用 150 μL 的 1 毫摩尔 probit 溶液洗涤一次。然后在黑暗中用 50 μL 4% 多聚醛的 1 毫摩尔 Pro 溶液固定样品 10 分钟用丙磺舒溶液洗涤一次后，加入 30 μL 10 μL 10 μmol 核染料 drac 5 以实现最佳细胞分割。将细胞孵育 30 分钟，洗涤一次，然后加入 100 μL 的 1 毫摩尔溶液，以使用倒置落射荧光显微镜获取图像。

使用 405 纳米的激发波长。通过 450 纳米和 535 纳米滤光片检测发射，透射光的曝光时间为 5 毫秒。1000 纳米为 535 毫秒，450 纳米为 500 毫秒。

使用与自动显微镜耦合的聚焦校准设备，可以在多个孔中同时采集数十个不同的位置。如果使用共聚焦显微镜，则在 450 纳米处使用 240 毫秒的曝光时间，在 535 纳米处使用 360 毫秒（对于 405 纳米激光）和 640 纳米激光使用 640 毫秒的曝光时间。通过计算机算法分析数据，该算法允许对每个细胞的荧光信号进行自动评分。

例如，使用 metamorph 和 acapella 等软件创建一个脚本，用于测量 450 纳米和 535 纳米发射信号之间的比率。对于此测定，以 2 乘以 10 至第五个细胞开始 HELOC 培养，最终体积为 2 毫升。准备感染细菌并用 CCF 加载 hela 细胞 4：00 AM 在 37 摄氏度的加热室内安排带有 N 平面空气物镜的凸形显微镜。

设置 405 纳米激光并通过 450 纳米和 535 纳米滤光片发射。此外，为透射光输入 5 毫秒的曝光时间。200 纳米为 535 毫秒，100 纳米为 450 毫秒。

在 60 分钟内设置每 90 秒采集一次数据。现在用 2 毫升 1 毫摩尔丙磺舒溶液洗涤细胞一次。在 em 缓冲液中加入 2 毫升 1 毫摩尔 prob。

然后将培养皿安装在显微镜的载物台上，并在 6 分钟后开始采集。暂停收购。在细胞顶部加入 250 微升细菌重悬液，然后重新开始采集以进行采集后分析。

使用 Velocity metamorph 或 image J.获得每个单独细胞的 450 至 535 纳米强度比。CCF 4：00 AM β-内酰胺酶方法是一种稳健而灵敏的方法，用于追踪 HELOC 细胞感染后细胞内病原体（如凝胶福氏菌）的破裂。使用非侵入性 BS 176 AFA 1 菌株 1 小时，CCF 4 品探针保持完整并发出绿色信号。

相比之下，毒性 M 90 TFA I 菌株将信号切换为蓝色，这与胞质溶胶中的探针切割一致，用于确定比率度量信号。我们为 metamorph 和 acapella 软件开发了一个脚本，以自动检测细胞并在 535 和 450 纳米通道中进行测量。使用 DR 5 通道对细胞核和胞质溶胶进行分割。

然后，该算法能够检测和量化 450 纳米和 535 纳米的阳性细胞群。计算的平均比率对于突变菌株来说很低，而对于毒力菌株来说很高。可以在不同的人类细胞类型上进行实验，如 Gila 上皮细胞和 THP 一种巨噬细胞样细胞。

两种细胞类型都通过在感染下将发射的信号从绿色切换到蓝色来响应毒性 M 90 T AFA one cha 菌株。对于非侵入性菌株，绿色信号使用在 metamorph 软件开发的脚本持续定量，并且在 Excel 中开发的宏将 ular 破裂的直方图作为细胞分布的函数表示。该方法可以成功地适应了解不同细菌的传染性。

例如，这个数据集显示了牛分枝杆菌。BCG 在整个实验过程中都驻留在吞噬体中，如持续的绿色信号所示。相比之下，结核分枝杆菌在感染 7 天后在 THP 1 巨噬细胞中引起迷走神经膜破裂，如使用相同的算法感染 7 天后出现 450 纳米信号所强调的那样。

至于研究 Ella 的瓣破裂，我们发现结核分枝杆菌感染的细胞在感染 7 天后比牛分枝杆菌 BCG 显示出更高的 450 至 535 纳米比率。看完这个视频后，您应该对如何使用 CCL 四种β内酰胺酶测定研究病原体的破裂有一个很好的了解。一旦掌握，该方案可以在四个小时内完成，但请记住，您必须在方案期间在每个缓冲液中添加工艺。与现有方法（如电子显微镜或膜分离）相比，该技术的主要优点是无需任何生化处理即可实时进行。

可以进行进一步的分析，如肌动蛋白标记或庆大霉素保护测定，以评估细菌在宿主细胞中的摄取和增殖。