电穿孔法标记鸡胚后脑以示踪轴突投射路径及突触靶点

本实验的总体目标是对鸡胚后脑中特定的神经元亚群进行标记，并示踪其轴突的投射路径及靶区。该目标通过以下步骤实现：首先在胚胎发育第2.75天的蛋壳中央打开一个小型椭圆形窗口，随后将DNA质粒注射至后脑的脑室腔内。

随后对后脑进行单侧电穿孔，以在目标神经元群体中表达相应载体，并将鸡蛋继续孵育。最后，从整个胚胎中解剖出脑干，用于整体封片制备或组织切片。最终，通过免疫荧光染色和显微镜分析，可以获得在不同发育阶段后脑、脑干和小脑中轴突投射及突触靶点的结果。

该方法有助于回答发育神经生物学领域中的关键问题，例如在胚胎发育过程中，特定的神经元细胞如何投射其轴突并形成突触连接。为准备电穿孔，将样本在37至38.5摄氏度下孵育65至70小时，直至达到16至17期。在卵孵化的同时，拉制玻璃毛细管，并使用适配器夹具将弯曲的L形金电极连接至脉冲控制器。

将电穿孔参数设置为25伏、5次脉冲、45毫秒脉冲时长和300毫秒脉冲间隔。准备口吸管、10毫升注射器针头、对苯甲醛条、软毛刷、锋利的解剖剪刀以及25毫升无菌PBS。配制适量的DNA质粒混合物，并加入快绿染料以可视化注射的DNA。

当卵达到适当的发育阶段时，将其从培养箱中取出并保持水平位置。用70%乙醇清洁卵壳。每次操作一个卵，以尽量减少胚胎暴露。

用剪刀尖刺破气室放气。在卵的钝端打一个小孔，用注射器抽出3至4毫升蛋清。使用解剖剪，在蛋壳的上水平极处开一个小型椭圆形窗口。

在整个过程中，需滴加数滴 PBS 液于胚胎表面，以防干燥。使用口吸管将少量 DNA 混合物吸入玻璃毛细管中。随后，将胚胎置于后端朝上的位置进行间接观察。

然后将毛细管保持约45度角，插入胚胎的菱脑区域。操作过程中不得损伤胚胎周围的膜组织，且避免产生任何气泡。小心呼气，将DNA溶液注入菱脑的管腔内。

在注射DNA后，溶液将立即向前扩散。将平行电极准确放置于目标的前后位（AP）和背腹位（DV）的后脑区域。在不接触心脏的情况下，将电极轻微向腹侧推进，并施加电脉冲。

电极上应覆盖气泡以指示导电性，小心取出电极，并滴加数滴 PBS 以冷却胚胎并去除气泡。使用封口条妥善封闭蛋壳开口，防止孵化过程中干燥，用软毛刷蘸 PBS 清洗电极，将蛋放入培养箱中孵育所需时间。电穿孔后两天至三天，胚胎存活率约为 90%，电穿孔后 12 天存活率降至约 50%。

为了制备后脑的平铺切片，需小心解剖胚胎，将其从周围的膜和血管中分离出来。将胚胎置于含有 PBS 的小型硅化培养皿中，使胚胎背面向上。使用钨针将其固定在培养皿上。

然后使用锋利的玻璃毛细管，用尖头镊子和显微剪刀在后脑的背侧顶板上做一个切口。抓住头部的上部，从头端到尾端非常小心地牵拉出后脑组织。

分离后脑后，去除残留的腹侧组织。将后脑置于4%多聚甲醛（PFA）溶液中，在室温下孵育一至两小时。随后用PBT洗涤以去除PFA。

按照文本方案中所述的免疫荧光制备步骤操作后，将后脑背侧朝上放置在载玻片上。在后脑组织上滴加荧光封片介质，并使用玻璃毛细管或钨针将后脑在载玻片上压平。在盖玻片的每个角落添加少量封片油，以防止盖玻片压迫组织。

小心地将盖玻片覆盖在后脑上，避免产生气泡以确保贴合。在盖玻片边缘涂抹指甲油固定。脑干的冷冻切片可在 E 6.5 之后的任何发育阶段进行。

由于在整体胚胎标本中轴突难以观察，且胚胎整体较厚，因此应优先采用切片方法。此外，要观察突触连接，必须对组织进行切片，并在显微镜下使用高倍镜观察。为制备冷冻切片样品，需解剖胚胎并去除脑组织周围的所有其他组织。

用PBS冲洗。然后使用微型剪刀和尖头镊子在延髓的脑桥区域切开胚胎。在小脑与中脑之间做一宽切口，并完整移除整个脑干。

组织应包含延髓、脑桥和小脑。在以下示例中，一个在菱脑检查区中间神经元DA1亚群中表达的增强子元件被克隆至Cre重组酶的上游，并与一个依赖Cre的细胞质GFP报告质粒共电穿孔。在E4.5阶段进行整体装片制备，可观察到两条对侧上行轴突投射模式，用于描绘DA1中间神经元在发育后期的轴突投射路径。

将一个pre-con非条件性GFP报告基因盒克隆到两个piggyback臂之间，同时包含A TOH一个creen增强子和转座子载体。利用该策略，电穿孔后的C precon条件性MG FP被整合到鸡的染色体中，从而仅在D一个神经元中移除终止盒，实现GFP的长期表达。在DA一个细胞中。

GFP 的甲磺酰化形式使其与膜结合，从而定位于轴突膜上，而不是在细胞质中扩散。在 E 13.5 期收集的脑干组织，经矢状切面分析发现，多巴胺能神经元的轴突在小脑中聚集，并向外部颗粒层（EGL）延伸，该层由 ZI-1 阳性细胞标记。

还分析了D型轴突在小脑中的突触靶点。在E2.75胚胎中电转染突触小泡蛋白2报告质粒，同时转入Hone Cree增强子和piggyback转座子。该方法可实现GFP报告基因在DA型轴突终末突触前的表达。

在E 13.5时期对小脑进行切片，并使用通用突触前标记物synaptic taman以及标记bikini层的calbindin进行染色。该切片的高倍镜视野显示，在包括bikini层在内的多个小脑区域中，SV2 GFP阳性突触小泡呈阳性。该结果揭示了小脑中DA1 hind brainin中间神经元的突触连接。

观看本视频后，您应充分了解如何在胚胎发育第2.75天将DNA电穿孔转入禽类哈因克氏区（Hein），以特异性标记一部分神经元细胞。该技术可实现对已标记神经元细胞的轴突投射及突触连接在多个发育阶段进行追踪观察。