电穿孔轴突轨迹跟踪和突触目标的后脑在鸡胚
May 29th, 2013
神经网络是建立在胚胎大脑发育神经生物学的一个基本问题。在这里，我们结合电穿孔技术与新的遗传工具，如酶Cre / LOX-质粒和PiggyBac转介导的DNA换位系统在禽流后脑背中间贴上标签，并跟踪他们的轴突预测和突触在不同发育阶段的目标。
该程序的总体目标是标记雏鸡后脑中神经元的特定子集，并追踪它们的轴突轨迹和目标。这是通过首先在胚胎日的中心打开一个小椭圆形窗口来实现的.2.75。将 EGG 下一个 DNA 质粒注射到后脑腔中。
然后单侧电穿孔后脑，以允许在所需神经元组中表达构建体并孵化卵子。最后，从整个胚胎中解剖脑干以进行平面安装准备或组织切片。最终，通过免疫荧光染色和显微镜分析，可以获得显示不同发育阶段后脑、脑和小脑的轴突投影和突触靶标的结果。
这种方法可以帮助回答发育神经生物学领域的关键问题，例如特定神经元细胞在胚胎发育过程中如何投射其轴突并形成突触连接。为了准备电穿孔，将它们在 37 到 38 摄氏度半的温度下孵育 65 到 70 小时，直到它们达到 16 到 17 阶段。当种蛋孵化时，拉动玻璃毛细管将弯曲的 L 形金电极与适配器支架连接到脉冲解说器。
将电穿孔参数设置为 25 伏特、5 个脉冲数、45 毫秒脉冲长度和 300 个脉冲间隔。准备一个口腔移液器、一个 10 毫升注射器针头、多联瓶、软刷条、锋利的解剖剪刀和 25 毫升无菌 PBS。准备足够的 DNA 质粒混合物并添加快速绿色染料以观察注射的 DNA。
当鸡蛋达到适当的发育阶段时，将它们从孵化器中取出并保持在水平位置。使用 70% 乙醇清洁蛋壳。一次处理一个鸡蛋，以尽量减少胚胎暴露。
是时候用剪刀的尖端晾晒了。在卵杆上打一个孔，然后用注射器取出 3 到 4 毫升白蛋白。使用解剖剪刀，在蛋壳的上水平杆处打开一个小椭圆形窗口。
在整个过程中，在胚胎顶部滴几滴 PBS 以防止干燥。使用口腔移液器将少量 DNA 混合物加载到玻璃毛细管中。接下来，将胚胎与其后端间接视图放置。
然后将毛细血管保持在 45 度左右，穿透 coddle 后脑。不要在不形成任何气泡的情况下去除胚胎周围的任何膜。小心呼气，将 DNA 溶液注入后脑腔。
溶液将在 DNA 注射后立即向前扩散。将平行电极放置在精确的目标 AP 和 DV 后脑位置。在不接触心脏的情况下，将电极稍微推向腹侧并脉冲电。
电极上应覆盖有气泡以指示导电性，小心地取下电极并滴入几滴 PBS 以冷却胚胎并去除气泡。使用 perfil 条正确密封鸡蛋开口，以防止在孵化过程中用软刷和 PBS 清洗电极，将鸡蛋放入培养箱中所需时间。胚胎的存活率在电穿孔后 2 到 3 天约为 90%，在电穿孔后 12 天降低高达 50%。
要制作后脑的平装制剂，请仔细解剖胚胎，将其与周围的膜和血管分开。将胚胎放入含有 PBS 的硅胶涂层小培养皿中，胚胎朝向背面。使用钨针将其连接到培养皿上。
然后使用锋利的玻璃毛细管。用锋利的镊子和微型剪刀在后脑屋顶板上做一个背缝。握住头部的上半部分，非常小心地将后脑组织从喙部拉到蹒跚学步。
分离后脑后，去除剩余的腹侧组织。将后脑在 4% 多聚甲醛或 PFA 溶液中在室温下孵育 1 至 2 小时。然后用 PBT 洗涤以去除 PFA。
遵循文本方案中描述的免疫荧光制备后，将后脑朝背放在载玻片上。将荧光封固剂添加到后脑上，并使用玻璃毛细管或钨针将载玻片上的后脑压平。在每个角添加少量油脂，以防止盖玻片挤压组织。
小心地将盖玻片放在后脑顶部，避免气泡粘附。在盖玻片边缘涂上指甲油。脑干的冷冻切片可以在 E 6.5 之后的任何发育阶段进行。
它们应该是首选方法，因为在平面安装的胚胎中难以观察轴突，而扁平胚胎会变得非常厚。此外，突触的证明需要在显微镜下对组织进行切片和高放大倍率视图。为了准备用于冷冻切片的样品，解剖胚胎并去除大脑周围的所有组织。
用 PBS 冲洗。然后用微型剪刀和锋利的镊子在延髓的圆头区域切开胚胎。在小脑和中脑之间做一个宽切口，切除整个脑干。
组织应包含延髓脑桥和小脑 em。在以下示例中，在 DA 中表达的增强子元件 检查后脑中神经元间的一个亚组被克隆到 Cree 重组酶的上游，并与 Cree 依赖性细胞质 GFP 报告质粒共电穿孔。E 4.5 期的平面安装准备揭示了两个对侧升轴突投射模式，以映射 DA 1 神经元间在发育后期的轴突投射。
在两个背负臂之间克隆了一个 pre-con 无条件 GFP 报告基因盒，以及 A TOH one creen 增强子和转置载体。使用这种策略，电穿孔 C precon 条件 MG FP 被整合到鸡染色体中，因此，仅在 D one 神经元中去除终止盒，从而延长 GFP 的表达。在 DA 一细胞中。
GFP 的甲酯化形式将其拴在膜上，使其位于轴突膜上，而不是在细胞质中稀释。在 E 13.5 处收集的脑茎中，并在矢状切片中进行分析。发现 DA one 轴突在小脑中积累并延伸到外部颗粒层或 EGL，其标志是 ZI one 阳性细胞。
还分析了小脑中 D one 轴突的突触靶标。用突触囊泡蛋白 2 报告质粒、H 1 Cree 增强子和背负转座对 E 2.75 胚胎进行电穿孔。该方法使 GFP 报告基因在突触前 DA 一个轴突末端的表达成为可能。
在E 13.5 处对小脑进行切片，并用一般突触前标志物突触 taman 以及标记比基尼层的钙结合蛋白染色。该切片的高放大倍率视图显示 SV 在多个小脑区域（包括比基尼层）有两个 GFP 阳性突触囊泡。该结果揭示了小脑中 DA 一后脑神经元间的突触连接。
看完这个视频后，您应该对如何在胚胎第 2 天 75 点将 DNA 电作到鸟类 Hein 中，以便特异性标记神经元细胞亚群有一个很好的了解。该程序使人们能够在多个发育阶段跟踪标记神经元细胞的轴突投射和突触连接。
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概览
本研究探讨了神经元网络如何在胚胎大脑中形成，重点关注鸡类后脑。通过使用电穿孔和先进的基因工具，研究人员标记特定神经元并追踪其在发育过程中的连接。
研究的主要组成部分
科学领域
- 发育神经生物学
- 神经科学
- 基因工程
背景
- 理解神经元网络的形成对于发育神经生物学至关重要。
- 标记神经元有助于追踪它们的发育和连接。
- 电穿孔是一种用于将DNA引入细胞的技术。
- Cre/Lox和PiggyBac等基因工具提高了标记精度。
研究目的
- 标记鸡类后脑中的背侧中间神经元。
- 追踪轴突投射和突触靶点。
- 分析各个发育阶段的神经元发育。
使用的方法
- 用于DNA引入的电穿孔技术。
- 将DNA质粒注射到后脑中。
- 孵化鸡蛋以获得神经元表达。
- 通过显微镜进行脑干解剖分析。
主要结果
- 成功标记了后脑中特定神经元子集。
- 可视化了轴突投射和突触靶点。
- 结果展示了不同发育阶段的神经元连接性。
- 免疫荧光染色提供了清晰的神经元结构成像。
结论
- 该研究为神经元网络的建立提供了见解。
- 电穿孔结合基因工具是神经元标记的有效方法。
- 研究结果有助于理解脊椎动物的大脑发育。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise neuronal labeling and axonal tracing in the chick hindbrain enables mechanistic de-risking of neural circuit formation hypotheses during early development. This approach supports predictive confidence in target validation for neurodevelopmental pathway studies and informs risk-adjusted advancement of CNS discovery programs. The method's ability to track synaptic connectivity across developmental stages enhances translational continuity from discovery to preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal subtype-specific projection patterns and synaptic targeting.
- Supports biological de-risking by clarifying developmental connectivity mechanisms.
- Facilitates functional target validation for neural circuit components.
- Provides predictive confidence for prioritizing neurodevelopmental targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neuronal systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative imaging of axonal trajectories and synaptic sites.
- Enables standardization of genetic labeling and tracing protocols for assay development.
- Supports reliable evaluation of candidate interventions affecting neural connectivity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental connectivity mapping with disease-relevant neural circuit models.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of synaptic targets.
- Informs risk-adjusted decisions for advancing CNS therapeutic programs.
- Enhances predictive de-risking of candidate targets in translational neuroscience.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early neuronal target identification through preclinical model validation, supporting both mechanistic studies and translational research in CNS drug discovery.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of neuronal projection and synaptic targeting mechanisms.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging outputs for assay readiness.
- Analytics: Delivers high-resolution measurements of axonal and synaptic patterns for comparative analysis.
- Translational Research: Supports alignment with disease-relevant neural circuit models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neuronal labeling and circuit tracing across multiple CNS programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural circuit studies.
- Operational Value: Standardizes and scales neuronal labeling and tracing workflows for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in CNS portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic manipulation, electroporation, and advanced microscopy.
- Demands access to genetic engineering tools and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of labeling and tracing protocols.
- Adaptation may be needed for different neuronal subtypes or developmental stages.
- Visualization of late-stage axons may require tissue sectioning due to sample thickness.
