Name: 多单位记录方法来描述蝗虫的神经活动（ Schistocerca美洲）嗅觉电路 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学习多单位记录技术以研究美洲蝗虫嗅觉回路中的气味诱发神经活动。该方法通过玻璃微电极和阵列电极记录触角叶与蕈形体中的群体神经元反应，为神经科学研究提供可扩展的电生理框架。

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作者感谢以下机构对本工作的资助：华盛顿大学生物医学工程系提供的丰厚启动资金、系统神经科学麦克唐奈尔中心的资助、美国海军研究办公室的资助（项目编号：N000141210089）给 B.R.。

1. 气味的制备与递送
<ol>
 <li>按体积将气味溶液用矿物油稀释至所需浓度。将20 ml矿物油与气味物质的混合液储存于60 ml玻璃瓶中。将两根注射器针头（19号）插入橡胶塞，一根从底部插入，另一根从顶部插入，分别作为进气口和出气口。用该橡胶塞密封玻璃瓶，并将定制的活性炭过滤器连接至进气管线（图1A）。</li>
 <li>活性炭过滤器由两个6 ml注射器制成。将注射器从中间切开，丢弃带活塞的一端。将剩余部分填充棉花和活性炭后，使用热缩管将其连接在一起。</li>
 <li>使用聚乙烯管（内径0.86 mm）将气味瓶的出气管线连接至塑料管（Nalgene FEP管，内径5.8 mm），该塑料管用于向触角提供持续气流（图1B）。</li>
 <li>通过位于蝗虫触角附近几厘米处的塑料管，向蝗虫输送经活性炭过滤和除湿的空气（载气；流速0.75 L/min）。</li>
 <li>进行气味刺激时，将瓶内气味溶液上方静态顶空气体以恒定体积（0.1 L/min）置换。通过Pico-pump（WPI, PV-820）向瓶内注入等量的除湿空气来实现此操作。气味瓶产生的蒸气经出气管线导入气流管中（图1B）。</li>
 <li>在蝗虫触角后方约10 cm处放置一个真空漏斗，以清除输送后的气味蒸气。</li>
</ol>
2. 蝗虫触角单感器记录的准备工作
<ol>
 <li>从密集饲养的群体中选取一只性成熟但尚未交配、具有完全发育翅膀的成年蝗虫，性别不限。固定蝗虫前，先将其足部截除。使用组织粘合剂（Vetbond, 3M）封闭截肢部位。用一小段电工胶带缠绕蝗虫胸部，将其固定在定制的实验腔室内（图2A）。</li>
 <li>在解剖显微镜下，在蜡质平台（图2A）上为触角制作一个浅槽。将触角放入槽中，并在触角两端使用蜡封固定（图2B；熔化蜡时使用电热蜡笔）。</li>
 <li>将接地电极（氯化银丝）插入蝗虫胸部（距头部约1 cm处）。使用蜡封封闭切口部位，并固定接地导线（图2A）。</li>
</ol>
3. 单感器记录法监测嗅觉受体神经元（ORNs）对气味刺激的反应
<ol>
 <li>将稳定的蝗虫触角置于配备立体显微镜（Leica M205C）的隔振台（TMC）上（图3A）。确保记录用感器的基部清晰可见（图3B）。</li>
 <li>使用微电极拉制仪（Sutter P-1000）和硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.2 mm，内径0.69 mm）制备玻璃电极（充满蝗虫生理盐水时阻抗为3–10 MΩ，尖端直径1–3 μm）9。</li>
 <li>将玻璃电极插入连接至电动显微操作器（Sutter MP-285）的微电极夹持器中。轻柔地将电极插入感器基部（图3B）。注意，每个感器在蝗虫中可包含3–50个嗅觉受体神经元10。</li>
 <li>使用交流放大器（Grass P-55）将信号放大10,000倍。通过数据采集系统（LabView，PCI-MIO-16E-4 DAQ卡；National Instruments）对信号进行0.3–10.0 kHz带通滤波，并以15 kHz采样率采集信号（图3D）。</li>
</ol>
4. 用于触角叶和蘑菇体记录的蝗虫解剖步骤
<ol>
 <li>按照第 2.1 节所述的固定程序进行操作。将蝗虫置于定制设计的实验腔室中，如图 4A和B所示。</li>
 <li>为了在解剖过程中及之后灌注生理盐水，需在蝗虫头部周围构建一个石蜡杯。石蜡杯应从口器上方开始，延伸至复眼以外，并覆盖两根触角之间的区域，如图 4C所示。</li>
 <li>为使触角能够穿过石蜡杯，在两侧使用塑料（聚乙烯）管（长 5 mm，内径 0.86 mm）制作小通道。确保塑料管可穿过石蜡杯。这可通过使用一个橡胶垫圈实现，该垫圈紧密包裹在塑料管上，但固定于石蜡杯上（图 4C）。</li>
 <li>使用环氧树脂将触角基部固定在塑料管的底端。此步骤可确保即使去除周围表皮后，触角仍能保持原位。</li>
 <li>从此时起，保持石蜡杯内充满生理盐水溶液9。首先去除两根触角之间的一个中央矩形区域（矩形的长边与前后轴对齐）。随后去除邻近区域的表皮，但避免扰动复眼以及触角基部的表皮（图 4D）。</li>
 <li>使用精细镊子轻轻去除大脑周围的气囊和脂肪体。此步骤完成后，应能清晰看到蝗虫的大脑（图 4D）。注意，处理嗅觉信息的大脑区域（呈淡黄色色素沉着）位于两根触角之间。</li>
 <li>在蝗虫中，消化道位于大脑下方并沿身体全长延伸。为防止肠道运动可能影响制备的稳定性，应轻轻拉出前肠并用精细剪刀剪断。在直肠上方的腹部做一小切口，用粗镊子拉出后肠以移除整个肠道。为防止生理盐水泄漏，需立即在切口前方用缝合线结扎腹部。</li>
 <li>使用由细金属丝制成并涂有一层薄蜡的小平台，将大脑抬高并在电生理记录期间稳定其位置11，如图 4D所示。</li>
 <li>昆虫大脑表面覆盖有一层薄的绝缘鞘膜，实验前需将其去除。为剥离鞘膜，使用精细镊子将少量酶（0.3–0.4 mg 蛋白酶，Sigma Aldrich）均匀涂抹于大脑表面9。酶作用约 5–10 秒后，用生理盐水彻底冲洗大脑。随后使用超细镊子非常轻柔地夹起并提起鞘膜，并在记录位点（AL 和 MB；如图 4E、F所示）将其撕开。</li>
</ol>
5. 嗅觉叶和蘑菇体的多单元记录
<ol>
 <li>将蝗虫标本放置于图 5A在置于防震台上的悬臂支架下，使用体视显微镜进行操作。</li>
 <li>实验过程中保持恒定的生理盐水灌注速率（约 0.04 L/hr）。将浸没在盛有生理盐水的石蜡杯中的氯化银丝用作接地电极。</li>
 <li>用于PN记录时，使用16通道硅探针（NeuroNexus Technologies，货号#A2x2-tet-3mm-150-150-121-A16， 图5B）。每次实验前，使用金电镀电极，使其阻抗达到200–300 kΩ范围。采用图示电路进行操作 图7 用于电镀。</li>
 <li>将电极置于靠近触角叶表面的位置，并使用手动显微操作器（WPI, M3301R）轻轻插入组织中图 5D).</li>
 <li>以约10 μm的步长推进电极。每步停留2–3分钟，评估所获取信号的质量。在理想的记录位点，多个记录通道将接收到细胞外信号，且信噪比（SNR）较高。 &gt; 3-5 倍噪声标准差（SDs）。</li>
 <li>对于KC记录，使用自制的绞合线四极电极（图5C；第6节中介绍的逐步制备流程）。按照5.3步骤所述对这些电极进行电镀。将四极电极放置在MB表面图5E因为KC神经元胞体仅限于蘑菇体的浅层8.</li>
 <li>同一蝗虫标本上可同时记录PN和KC信号，示意图如下所示 图5A.</li>
 <li>在确定记录位置后，至少等待15分钟，以使电极稳定。</li>
 <li>以15 KHz采集所有细胞外信号，使用16通道交流放大器（Biology Electronics Shop；Caltech，Pasadena，CA）在0.3–6 KHz范围内进行滤波，并放大10,000倍图6A、B).</li>
</ol>
6. 用于KC记录的绞合丝电极制备步骤
<ol>
 <li>为了设计用于KC记录的多通道电极，使用绝缘的镍铬合金丝（RO800，0.0005英寸细丝）8。</li>
 <li>若需要八个电极，则将金属丝在一段10-15厘米长的纸板上缠绕4圈。纸板两端可用塑料套管包裹，以防止边缘割断金属丝。缠绕时应确保无明显松弛，但也不要拉得过紧。操作时需小心处理，因该金属丝易断裂。</li>
 <li>将金属丝在纸板顶部聚拢，并用一段胶带（Time Tape, T-534-RP）固定在一起。在另一端剪断金属丝束。取出金属丝后，同样用另一段胶带将剪断端的金属丝束聚拢固定。</li>
 <li>使用滴定板振荡器（Thermo Scientific, Model 4625Q），将金属丝束绞合在一起（约72转/分钟，持续3分钟），形成一根拧紧的导线。将已贴胶带的金属丝束底端夹在滴定板转子上，顶端夹在支架上。绞合过程中，金属丝应保持轻微张力，但不可过紧。</li>
 <li>使用热风枪（Weller 6966C）加热，使绝缘层熔融，从而将各单股金属丝粘合为单一导线。沿导线长度方向缓慢加热3-4次（每次3-4秒），即可充分加热并融合金属丝。随后松开底部夹具，使导线自然松弛。修剪导线两端，去除胶带。</li>
 <li>将导线一端穿入一段5-6厘米长的玻璃毛细管（外径1.0毫米，内径0.58毫米）。用精细镊子将导线一端的绞合部分小心分开，并用火焰短暂灼烧该端以去除绝缘涂层。此步骤需格外小心；若金属丝暴露于火焰时间过长，会导致金属丝熔化并缠结。</li>
 <li>轻轻分离火焰处理端的8根金属丝，并将每根金属丝分别焊接到一个8针IC插座的引脚上。在IC插座顶部涂覆环氧树脂，以固定金属丝和玻璃毛细管。同时，在毛细管另一端也滴加少量环氧树脂，以固定导线位置（图5C）。</li>
 <li>最后，使用碳化钨剪刀在距离毛细管尖端约0.5厘米处，以45度角剪切导线尖端。</li>
</ol>

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<li>Brown, S. L., Joseph, J., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+a+temporally+structured+stimulus+with+a+temporally+structured+neural+representation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Encoding a temporally structured stimulus with a temporally structured neural representation.</a> Nature Neuroscience. 8, 1568-1576 (2005).</li>
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<li>Wehr, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+afferent+and+central+temporal+patterns+in+the+locust+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Relationship between afferent and central temporal patterns in the locust olfactory system.</a> The Journal of Neuroscience. 19, 381-390 (1999).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

大多数感觉刺激会引发分布在多个神经元集合中的组合式反应。因此，要理解大脑神经回路如何表征和处理特定刺激的信息，必须同时监测多个神经元的活动。本文中，我们展示了细胞外多通道记录技术，用于表征昆虫嗅觉通路中前三个处理中枢对气味刺激的反应。需要指出的是，本文所介绍的技术已在先前多项关于嗅觉编码的研究中得到应用，并逐渐成为该领域的标准实践方法3,6,13-17。结合本文所述技术，可建立系统性研究方法，用于探究无脊椎动物嗅觉系统的设计原理与计算机制。在此，我们必须承认Gilles Laurent、Mark Stopfer及其同事所做出的开创性贡献2,3,8,9,13,16,18-21，他们率先采用这些方法揭示并阐明了嗅觉编码中的若干基本原理。
最后值得注意的是，光学技术也已成功用于研究昆虫嗅觉回路中的群体神经活动22-27。尽管当需要同时监测大量神经元的神经活动时，这些光学技术具有优势，但在需要检测单个动作电位的情况下，电生理学技术仍然是“金标准”。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;电生理设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>交流放大器</td><td>GRASS</td><td>型号 P55</td><td>用于单感器记录</td></tr><tr><td>音频监视器（型号 3300）</td><td>A-M Systems</td><td>940000</td><td></td></tr><tr><td>定制16通道前置放大器和放大器</td><td>加州理工学院生物学电子车间</td><td></td><td>用于触角叶和蘑菇体记录</td></tr><tr><td>数据采集单元</td><td>国家仪器公司</td><td>BNC-2090</td><td></td></tr><tr><td>光纤光源</td><td>WPI</td><td>SI-72-8</td><td></td></tr><tr><td>115 V 光源</td><td>WPI</td><td>NOVA</td><td></td></tr><tr><td>手动显微操作器</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td>用于蝗虫脑部记录</td></tr><tr><td>带臂架的体视显微镜1</td><td>Leica</td><td>M80</td><td>用于蝗虫脑部记录</td></tr><tr><td>体视显微镜2</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>用于单感器记录</td></tr><tr><td>防振台</td><td>TMC</td><td>63-500 系列</td><td></td></tr><tr><td>电动显微操作器</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP285/T</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Tektronix</td><td>TD2014B</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;电极/制作工具&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>16通道电极</td><td>NeuroNexus</td><td>A2x2-tet-3mm-150-121</td><td>用于触角叶记录</td></tr><tr><td>含丝硼硅酸盐毛细管，内径 0.69 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>用于制作玻璃电极</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>万用表仓库</td><td>SG1639A</td><td>用于电极镀金</td></tr><tr><td>镀金液（无氰化物）</td><td>SIFCO Industries</td><td>NC SPS 5355</td><td></td></tr><tr><td>阻抗测试仪</td><td>BAK Electronics Inc.</td><td>IMP-2</td><td>用于电极镀金</td></tr><tr><td>旋转开关</td><td>Electroswitch</td><td>C7D0123N</td><td>用于电极镀金</td></tr><tr><td>脉冲隔离器</td><td>WPI</td><td>A365</td><td>用于电极镀金</td></tr><tr><td>Q系列电极夹持器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1091</td><td></td></tr><tr><td>直径 0.010&quot; 的银丝</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td>接地电极</td></tr><tr><td>8针双列直插式IC插座</td><td>Digikey</td><td>ED90032-ND</td><td></td></tr><tr><td>含丝硼硅酸盐毛细管，内径 0.58 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0787</td><td></td></tr><tr><td>热风枪</td><td>Weller</td><td>6966C</td><td></td></tr><tr><td>Rediohm-800 导线</td><td>Kanthal Precision Technologies</td><td>PF002005</td><td></td></tr><tr><td>滴定板摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>4625Q</td><td>用于绞合导线</td></tr><tr><td>碳化钨剪刀，4.5&quot;</td><td>生物医学研究仪器公司</td><td>25-1000</td><td>用于切割绞合的四极导线</td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>HECO</td><td>91-EF5-SA</td><td>用于分离四极导线</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;气味递送&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>6 ml 注射器</td><td>Kendall</td><td>1180600777</td><td>用于定制的活性炭过滤器</td></tr><tr><td>棕色气味瓶</td><td>Fisher</td><td>08-912-165</td><td></td></tr><tr><td>活性炭</td><td>&lt;a href=&quot;http://BuyActivatedCharcoal.com&quot; target=&quot;_blank">BuyActivatedCharcoal.com&lt;/a&gt;</td><td>GAC-48C</td><td></td></tr><tr><td>干燥剂</td><td>Drierite</td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>Drierite 气体干燥罐</td><td>Fischer Scientific</td><td>09-204</td><td></td></tr><tr><td>热缩管</td><td>3M</td><td>EPS-200</td><td>用于气味过滤器制备</td></tr><tr><td>带铝制接头的皮下注射针头，19号规格</td><td>Kendall</td><td>8881-200136</td><td>用于为气味瓶提供进气和出气管路</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6357-04</td><td>用于稀释气味</td></tr><tr><td>Nalgene 塑料管，890 FEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>8050-0310</td><td>用于载气输送</td></tr><tr><td>气动皮升级泵</td><td>WPI</td><td>sys-pv820</td><td>用于气味递送</td></tr><tr><td>聚乙烯管，内径 0.86 mm</td><td>Intramedic</td><td>427421</td><td>用于气味瓶出口连接和灌流盐溶液管路</td></tr><tr><td>瓶塞</td><td>Lab Pure</td><td>97041</td><td>用于密封气味瓶</td></tr><tr><td>时间标记带</td><td>PDC</td><td>T-534-RP</td><td></td></tr><tr><td>管路鲁尔接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-66</td><td></td></tr><tr><td>真空管</td><td>McMaster-Carr</td><td>5488K66</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;制备/解剖&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>100 x 15 mm 培养皿</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr><tr><td>18 AWG 多股铜线</td><td>Lapp Kabel</td><td>4510013</td><td></td></tr><tr><td>22 AWG 多股连接线</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>脑部支撑平台</td></tr><tr><td>蜡染蜡</td><td>Jacquard</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>牙科边缘蜡</td><td>Henry-Schein Dental</td><td>6652151</td><td></td></tr><tr><td>电热蜡笔</td><td>Almore International</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>5分钟快速固化环氧树脂</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td>带铝制接头的皮下注射针头</td><td>Kendall</td><td>8881-200136</td><td></td></tr><tr><td>来自&lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt;的蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>用于去除蝗虫脑部鞘膜</td></tr><tr><td>非无菌缝合线</td><td>Fisher</td><td>NC9087024</td><td>用于肠道切除后结扎腹部</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>用于封闭截肢部位</td></tr><tr><td>Dumont #1 镊子（粗头）</td><td>WPI</td><td>500335</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 钛合金镊子（细头）</td><td>WPI</td><td>14096</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF 镊子（超细头）</td><td>WPI</td><td>500085</td><td>用于去除蝗虫脑部鞘膜</td></tr><tr><td>10 cm 解剖剪刀</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>用于去除腿和翅膀</td></tr><tr><td>Vannas 剪刀（细头）</td><td>WPI</td><td>500086</td><td>用于去除角质层、切割前肠</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;盐溶液灌流&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>带流速调节器的延长管组</td><td>Moore Medical</td><td>69136</td><td>用于调节盐溶液流速</td></tr><tr><td>带Y型注射口的静脉输液管组</td><td>Moore Medical</td><td>73190</td><td>用于调节盐溶液流速</td></tr></tbody></table>

用于表征蝗虫（schistocerca americana）嗅觉回路中神经活动的多单元记录方法

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

对嗅觉线索的检测与解读对许多生物的生存至关重要。值得注意的是，不同门类的物种具有惊人相似的嗅觉系统，这表明生物体在化学感知方面的策略在进化过程中已得到优化1。在昆虫嗅觉系统中，气味分子由位于触角上的嗅觉感受神经元（ORN）进行转导，这些神经元将化学刺激转化为动作电位序列。来自ORN的感觉输入随后被传递至触角叶（AL；该结构类似于脊椎动物的嗅球）。在AL中，气味的神经表征表现为分布在一群主神经元（PNs；也称为投射神经元）上的时空放电模式2,3。AL的输出随后由下游蘑菇体（MB）中的肯扬细胞（KCs）进行处理，MB是与嗅觉记忆和学习相关的脑区4,5。本文中，我们介绍用于记录这些嗅觉回路中气味诱发神经反应的电生理记录技术。
首先，我们介绍一种单感器记录方法，用于在嗅觉受体神经元（ORN）群体水平上研究气味诱发的反应6,7。我们讨论使用充满生理盐水的尖端玻璃微量移液管作为电极，对外部ORN反应进行胞外记录。接着，我们介绍一种利用商用16通道电极对外周神经元（PN）反应进行胞外记录的方法3。类似地，我们展示了使用自制8通道绞合丝四极电极记录肯扬细胞的方法8。我们提供了实验装置的详细信息，并展示了上述每种技术的代表性记录轨迹。

单个嗅觉受体神经元对两种不同醇类的气味诱发反应如图3D所示。根据记录位置（嗅器类型、电极放置位置），可获得多单位记录信号。
AL记录中的一个原始细胞外波形如图所示 图6A可在此电压记录中观察到来自不同投射神经元（PNs）的、具有不同幅度的动作电位或峰电位。尽管蝗虫触角叶中存在兴奋性投射神经元和抑制性局部神经元，但只有投射神经元能够产生可在细胞外检测到的钠离子峰电位。3这一观察结果表明，本文介绍的多单元记录技术可用于选择性地监测触角叶回路的输出，从而使蝗虫成为研究嗅觉编码的一种理想的无脊椎动物模型。
图 6B 展示了蘑菇体记录的一个示例。与嗅觉受体神经元（ORNs）和投射神经元（PNs）不同，肯尼恩细胞（KCs）具有较低的基础活动水平，并以稀疏且选择性的方式对气味产生反应。
为了从这些多单元记录中分离出单个神经元的反应，我们使用在 IGOR Pro（W...

我们展示了细胞外多单位记录技术的多种变体，用于表征无脊椎动物嗅觉通路前三个阶段中由气味诱发的神经反应。这些技术也可轻松适用于研究其他神经系统中的群体神经活动。

用于表征蝗虫（Schistocerca americana）嗅觉回路中神经活动的多单元记录方法

检测和解读嗅觉信号对许多生物的生存至关重要。值得注意的是，不同门类的物种在嗅觉系统结构和功能上表现出惊人的一致性……

本实验的总体目标是记录昆虫嗅觉通路前三个信号处理中心中由气味诱发的多单位神经电活动。首先，将一只蝗虫固定在定制设计的记录室中，并稳定其一根触角以进行电生理记录。第二步是制备玻璃微电极，并将其插入触角梗基部，以监测气味诱发的神经反应。接下来记录蝗虫大脑的神经活动。通过多步骤的解剖程序暴露神经组织，该组织负责处理来自嗅觉感觉神经元的输入信息。最后一步是将多电极阵列适当地放置在蝗虫的触角叶和蘑菇体，以记录其群体神经活动。最终，本文所展示的细胞外记录方法可用于表征昆虫嗅觉通路中前三个信息处理中枢对气味刺激产生的反应。尽管该方法已被用于研究相对简单的无脊椎动物嗅觉系统中由气味诱发的神经反应，但也可加以改进，用于检测其他神经系统的群体神经活动。该方法的可视化演示至关重要，因为该实验流程中的某些关键环节，例如电极放置和部分解剖步骤，极难通过文字描述掌握。此外，这些方法大多是定性的，不同实验室在长期实践中已发展出各自优化的方案。开始本实验时，从高密度群体中选取一只性成熟前、具有完整翅膀的年轻成年蝗虫，性别不限。接下来，通过截除其腿部来固定蝗虫。使用组织粘合剂封闭截肢部位。然后用一小段电工胶带缠绕蝗虫胸部，将其固定在定制设计的实验腔室内。在解剖显微镜下，于蜡制平台表面刻出浅槽，用于放置触角。将天线放入槽中，并用蜂蜡在天线两端固定以保持稳定。随后，将一根接地电极插入胸部。使用蜂蜡封闭切口部位，并固定接地导线。接下来，将稳定的蝗虫触角置于防震台上的体视显微镜下。将气味瓶的出口管路连接至气味递送管。将气味递送管放置在距离触角几厘米处，同时在蝗虫触角后方约10厘米处放置一个真空抽滤漏斗，用于清除已递送的气味蒸气。然后，使用硼硅酸盐玻璃毛细管在微电极拉制仪上制备玻璃电极，并用蝗虫生理盐水填充玻璃电极。接着，将玻璃电极放入固定在电动显微操作器上的微电极夹持器中。确保在显微镜下能够清晰地看到记录突触的基部。将电极轻轻插入突触的底部，随后使用交流放大器将信号放大10,000倍。将信号在0.3至10.0千赫兹范围内进行滤波，并以15千赫兹的采样率进行采集。使用数据采集系统，当电极位置适当时，可检测到自发性神经活动。通过气味递送管传递气味脉冲，可监测刺激诱发的反应。将电极置于靠近触角的位置，记录细胞外活动的变化，并按照先前所述的固定步骤进行操作。将蝗虫放置于定制设计的记录室中。开始解剖前，先在蝗虫头部周围用石蜡制作一个蜡杯。在蝗虫头部两侧各构建一个蜡塔，使其高度达到触角的位置。接着，将每根触角插入一段紧密贴合在橡胶垫圈内的小段聚乙烯管中。然后将垫圈固定到蜡塔上，使塑料管能够自由地朝向或远离触角基部滑动，同时防止触角移动。然后在显微镜下开始在蝗虫头部周围构建一个石蜡杯，以便在解剖过程中及解剖后进行生理盐水灌注。石蜡杯应从口器上方开始，包围两个石蜡柱，并延伸至复眼之外。石蜡杯完全构建完成后，使用环氧树脂将一根触角的基部固定在塑料管的底端。这将确保即使在去除周围角质层后，触角仍能保持固定。从此刻开始，保持石蜡杯内充满生理盐水。现在，去除两个区域之间的中央矩形部分。一个触角。随后，在不干扰复眼或触角基部角质层的情况下，去除邻近区域的角质层。使用精细镊子，轻轻移除包围大脑的气囊和脂肪体。此时应能清晰看到蝗虫的大脑。处理嗅觉信息的脑区位于两侧之间。用镊子轻轻牵拉触角以牵出消化道，并用精细剪刀将其剪断。然后去除翅膀，并在直肠上方的腹部做一小切口。用粗镊子牵拉后肠以移除肠道。此步骤可确保肠道运动不会影响制备物的稳定性。为防止盐水泄漏，用缝合线在切口部位前方结扎腹部。接着，使用由细金属丝环制成并涂有薄层石蜡的小型平台，将脑组织抬高并固定，以便进行电生理实验。大脑被一层半透明的鞘膜保护，记录前必须将其去除。为削弱鞘膜，先将石蜡槽中的液体部分吸出，然后小心地在脑表面涂抹少量蛋白酶。酶作用约5至10秒后，用生理盐水彻底冲洗大脑。然后用超细镊子非常轻柔地夹住并向上拉动鞘膜，使其撕裂，暴露记录位点。在此操作过程中，将蝗虫标本置于立体显微镜下，并放置在隔振台上。维持约每小时40毫升的恒定生理盐水灌流速度。在整个实验过程中，使用浸入盛有生理盐水的石蜡杯中的氯化银丝作为接地电极。准备气味递送装置，其设置与单传感器记录实验类似。实验前，对电极进行镀金处理，使阻抗达到200至300千欧范围。使用16通道硅探针记录主神经元。在显微镜下，将电极置于触角叶表面附近，利用手动显微操作器轻柔地插入组织。在理想的记录位置，多个记录通道将接收到细胞外信号，并具有较高的信噪比。对于肯尼翁细胞记录，使用自制的绞合金属丝电极，并按照电镀流程对电极进行电镀处理。随后将硅探针上的电极放置在蘑菇体表面。由于肯尼翁细胞的胞体局限于该区域的浅表层，因此可在同一只蝗虫标本上同时记录主神经元和肯尼翁细胞的电活动。确定记录位置后，至少等待15分钟，以使电极稳定。然后以15千赫兹采集细胞外信号，将其过滤在0.3至6千赫兹之间，并使用16通道交流放大器对自发和刺激诱发的信号进行放大。可以观察到触角叶中投射神经元的多单元神经活动。原始的细胞外电压迹线显示了嗅觉感受神经元对两种不同气味的反应。此处展示了两种辛醇和一种乙醇。此处展示了一条来自多单元天线叶记录的代表性细胞外信号轨迹。在此电压轨迹中，可以观察到来自不同主神经元、具有不同振幅的动作电位或尖峰信号。请注意，灰色框所示时间段内施加了持续四秒的气味脉冲。此处展示了一个蘑菇体细胞外记录的示例。与嗅觉感受神经元和主神经元不同，昆虫蘑菇体中的肯扬细胞具有较低的基础放电活动，并以稀疏且选择性的方式对气味产生反应。为了从这些多单元记录中分离出单个神经元的反应，我们采用已发表的软件在离线状态下进行 spike 分选处理。此处展示了主神经元和肯扬细胞的 spike 分类示例。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何进行细胞外多单元记录，以表征昆虫嗅觉通路中前三个嗅觉中枢的神经元群活动。

multi-unit-recording-methods-to-characterize-neural-activity-locust

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

多单位记录方法来描述蝗虫的神经活动（<em&gt; Schistocerca美洲</em&gt;）嗅觉电路

多电极阵列（MEA）记录技术为研究大量神经元群体的电活动提供了一种方法。本文中，我们介绍了在同时刺激组织的条件下，从小鼠副嗅上皮进行记录的多电极阵列制备的详细步骤。...

犁鼻上皮的多电极阵列记录

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来自蛾类嗅觉系统的电生理学测量

嗅觉信号介导昆虫的多种不同行为，通常是由数十至数百种挥发性化合物组成的复杂混合物。我们采用气相色谱结合昆虫触角叶的多通道记录技术，描述了一种用于鉴定生物活性化合物的方法。...

利用气相色谱-多通道记录技术（GCMR）鉴定昆虫触角叶中的嗅觉挥发物

本文介绍了蟑螂腹神经索的解剖方法，以及从尾须神经和神经索连接处进行的细胞外记录。通过电刺激尾须神经或直接机械刺激尾须，可引发诱发电位反应。...

从完整的蟑螂神经系统中记录神经回路活动

植入有序排列的微丝阵列用于单细胞电生理记录面临诸多技术挑战。 本文描述了实施该技术的方法及所需设备。 此外，还讨论了利用有序微丝阵列以高空间选择性记录不同神经亚区活动的优势。...

一种用于在清醒行为动物中植入有序排列的微丝电极阵列以进行单细胞记录的操作流程

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在行为蜜蜂中同时进行两个神经处理阶段的长期记录

分析嗅觉感觉神经元的生理特性仍面临技术上的局限。本文通过在基因靶向小鼠的完整嗅觉上皮组织制备中采用穿孔式膜片钳技术记录这些神经元的活动。该技术可用于表征表达特定嗅觉受体的神经元的膜特性及其对特异性配体的反应。...

完整上皮组织中嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录：表达特定嗅觉受体神经元的功能分析

我们提出三种研究味觉编码的新方法. 使用一种简单的动物——蛾 烟草天蛾（Manduca...

研究味觉编码的新方法

本文介绍了一种针对昆虫口器须状突上的锥形感器进行单感器记录的详细且高效的方法。...

飞蝗触角锥形感器单感器记录技术

对嗅神经进行细胞外多单位记录是评估海洋鱼类嗅觉敏感性的敏感、可靠且可重复的方法。该方法记录初级感觉输入，且不受外界盐度的影响。...

硬骨鱼类嗅神经的细胞外多单位记录

我们介绍一种灵活的化学和多模式刺激方法，可同时对多条秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

自动化多模态刺激与同步记录多种小型生物的神经元活动

学习多单位记录技术以研究美洲蝗虫嗅觉回路中的气味诱发神经活动。该方法通过玻璃微电极和阵列电极记录触角叶与蕈形体中的群体神经元反应，为神经科学研究提供可扩展的电生理框架。

用于表征蝗虫（Schistocerca americana）嗅觉回路中神经活动的多单元记录方法

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