体内 双光子成像技术观察皮层神经元中由经验引起的相关分子变化

神经元中由经验依赖的分子变化对于大脑适应行为挑战的能力至关重要。本文介绍了一种活体双光子成像方法，该方法可通过基因编码的报告分子对单个皮层神经元中的此类分子变化进行追踪。其中一个已被广泛证实的经验依赖基因是即刻早期基因——活动调节细胞骨架相关蛋白（arc）。

ARC 的转录会因神经元活动增强而迅速且高度诱导。为了利用双光显微镜在活体神经元中检测 arc 的表达，我们使用了一种基因敲入小鼠品系，其中绿色荧光蛋白（GFP）报告基因受内源性 arc 启动子的调控。本方案描述了在活体动物中追踪依赖经验的神经元集群中 arc GFP 表达模式所需的手术准备和成像步骤。首先，我们将介绍该技术所需的动物准备步骤。

携带arc GFP的动物将接受颅窗手术，并术后恢复约两周。随后检查颅窗质量，若可通过颅窗清晰成像神经元，则将动物置于夸环境，直至行为学与双光子成像实验开始。之后，这些动物将被反复进行双光子显微成像。

在数天内完成所需的行为学实验范式后，使用热珠灭菌器清洁所有工具。在进行无菌手术前，用70%乙醇清洁手术区域，并铺上干净的手术垫。通过腹腔注射每克体重0.02毫升的1.2%伊弗麻醉溶液对动物进行麻醉。

通过尾部或脚趾夹捏检查麻醉水平，以确保动物完全镇静。用无菌眼用软膏覆盖动物的眼睛，并皮下注射地塞米松 0.2 毫克/千克和卡洛芬 5 毫克/千克。剃除耳间颅骨上方的毛发，使用聚维酮碘擦洗液清洁皮肤，并用 70% 乙醇交替擦拭三次进行消毒。将动物固定于立体定位手术台上，耳杆固定，动物下方放置设定为 37 摄氏度的循环水加热垫。

定期检查动物的麻醉深度，并根据需要追加原始麻醉剂剂量。在头皮皮肤下注射 200 微升 0.5% 布比卡因，以麻醉该区域，切开皮肤，并去除颅骨上方的皮瓣。清除骨膜，并用洁净的棉签将该区域擦干。

根据实验需求，使用高速牙科钻和直径0.5毫米的钻头，在目标脑区表面轻柔地划出一个直径3至5毫米的圆形轮廓。定期用无菌0.9%生理盐水润湿钻孔部位，并用干净的棉签清除骨屑。若骨组织出血，可用预先浸透无菌生理盐水的明胶海绵轻压止血，并等待出血停止。

当到达最深层骨层时，使用尖头镊子抬起并移除骨岛。您可能会遇到骨片底部有硬脑膜附着的情况。如果您的骨窗跨越了骨缝，应轻柔地将其去除。

抬起骨瓣后，用湿润的明胶海绵轻轻擦拭暴露的硬脑膜表面以清洁，并等待任何硬脑膜出血停止。如果目标区域位于硬脑膜特别厚的部位下方，可能需要去除其上方的硬脑膜。若如此，应用精细镊子轻轻将硬脑膜与下方的软脑膜分离。

用另一把精细镊子在抬起的硬脑膜上做一个小切口。然后夹住切开的边缘，轻轻撕开硬脑膜。硬脑膜虽薄但坚韧，因此需小心操作，避免残留的锐利边缘划伤脑组织。

当你从感兴趣区域向后操作时，应使用无菌人工脑脊液（aCSF）或无菌生理盐水充分冲洗该区域。如果周围颅骨在暴露的硬脑膜或软脑膜处有明显曲度，导致某些区域无法与盖玻片紧密贴合且这些区域不会被成像，则可使用快速细胞黏合剂填充这些空隙。随后，将无菌玻璃盖玻片轻柔地覆盖在硬脑膜或软脑膜上。

使用 Sano 丙烯酸凝胶覆盖弹性体粘合剂和玻璃的边缘。加盖盖玻片。用 Sano 氰基丙烯酸酯凝胶或万能胶与牙科水泥的混合物覆盖整个暴露的颅骨。

在颅骨的另一端植入定制的金属头固定杆。给予动物腹腔注射酮洛芬，剂量为5毫克/千克，以进行术后镇痛，并将动物放回温暖的恢复室。术后继续使用镇痛药两天。

术后恢复两周后，使用异氟烷（ISO fluorine）对动物进行麻醉，诱导剂量为5%，维持剂量为1.5%。将动物固定于定制的显微镜载物台上的头部固定框架中，并检查颅窗的光学清晰度。

在蓝光照射下，脑表面血管的清晰度是颅窗质量的重要指标。如果血管边缘清晰分明，则表明颅窗可能可用。在开始行为学实验方案之前，应将动物饲养在稳定一致的家居笼环境中，以尽量减少每日之间的变异。

在基础状态下，GFP表达水平开始进行行为训练或环境刺激范式，具体取决于目标脑区。例如，可在连续数天内使动物暴露于不同的视觉环境中，以成像视觉皮层中不同的神经元群体；神经元中的GFP荧光通常在刺激后两小时达到峰值水平。实验时间线可据此优化，以利于在神经元GFP荧光达到峰值时检测ARC的GFP表达水平。

在完成行为训练或环境刺激后，使用5%异氟烷进行诱导麻醉，1.5%异氟烷维持麻醉。将动物固定于定制的显微镜载物台上，并使用头颅固定框架固定头部。在双光子显微镜下，通过颅骨上植入的金属条将动物头部固定于直接连接载物台的头颅固定框架上。

通过鼻罩持续向小鼠供应异氟烷（ISO）和氧气。使用加热垫维持体温。确保显微镜探测器免受环境光影响。

在暗室中进行双光子激光扫描时，使用20倍或25倍、数值孔径为1.05的水浸物镜进行成像。首先，在落射荧光照明下，用CCD相机获取脑部目标区域表面血管模式的图像。为便于后续图像配准，启动双光子激光扫描以获取三维图像序列。

双光子激光的激发波长设置为920纳米，功率设置为约50毫瓦。发射的荧光同时在绿色和红色通道弧中被检测。GFP荧光仅出现在绿色通道中，而组织自发荧光则在两个通道中均可见。

典型的图像堆栈尺寸约为 320 乘 300，20 乘 100 微米，横向分辨率为每像素 0.5 微米，纵向分辨率为每像素 3 微米。获取图像堆栈后，将动物放回其原有饲养笼中。在下一次行为学和成像实验之前，不要打扰该动物。

根据需要在多天内重复行为学实验和成像操作。利用先前获取的脑表面血管图像，重新定位至相同的成像位置。该技术的优势在于，能够在多个时间点对同一群神经元中的 arc 基因表达变化进行检测。

在活体动物中，标准的组织化学方法可达到单细胞分辨率，但无法在多天内追踪同一神经元的基因表达变化。其他成像技术，如磁共振成像或核成像方法，则缺乏对单个神经元进行成像所需的分辨率。

因此，目前尚无其他现有的基因表达变化检测方法能够同时达到本研究所述成像方法的空间分辨率和时间覆盖范围。该实验流程中的一个关键步骤是颅窗手术，操作时需格外小心，以避免对脑组织造成损伤或在玻璃盖玻片下残留血液。

如有必要，可去除硬脑膜。需要注意的是，采用此方法在脑组织中的最大成像深度将取决于颅窗的透明度、显微镜的配置以及荧光报告分子的亮度。这种活体成像方案是一种高效且通用的方法，可用于获取单个神经元在应对不同行为经验时与神经可塑性相关的分子动态信息，并且很可能广泛适用于携带荧光报告基因的其他经验调控基因的转基因小鼠。