在体内双光子成像的经验依赖的分子在大脑皮质神经元的变化

神经元中经历的依赖性分子变化对于大脑适应行为挑战的能力至关重要。这里描述了一种体内双光子成像方法，该方法允许通过基因编码的报告基因跟踪单个皮层神经元中的这种分子变化。公认的经验依赖基因之一是活性调节的细胞骨架相关蛋白或 arc。

ARC 的转录是由增强的神经元活动快速和高度诱导的为了能够通过两种照片显微镜检查活神经元中的 arc 表达，我们利用敲入小鼠系，其中 GFP 报告基因置于内源性弧启动子的控制下。该方案描述了用于跟踪活体动物神经元集合中经历的依赖性弧 GFP 表达模式的手术准备和成像程序。首先，我们将描述这项技术所需的动物准备。

弧形 GFP 动物将接受颅窗手术并从手术中恢复大约两周。然后检查颅窗质量，如果可以通过它对神经元进行成像，则将动物置于 qua 环境中，直到行为和两个光子成像实验开始。然后通过两个照片显微镜对这些动物重复成像。

在几天内完成所需的行为范式后，在热珠消毒器中清洁所有工具。无菌手术前，用 70% 乙醇清洁手术部位，并放下干净的滴布。用 1.2% Everton 溶液麻醉动物，腹膜内给予 0.02 毫升。

使用尾巴或脚趾捏住检查麻醉水平，以确保完全镇静。用无菌眼药膏覆盖动物的眼睛，皮下注射地塞米松 0.2 毫克/公斤和卡洛芬 5 毫克/公斤。剃掉耳朵之间颅骨上的毛发，并用 Betadine 磨砂膏对皮肤进行消毒，三个交替的 70% 乙醇拭子将动物安装在立体定位手术阶段，耳杆和动物下方的水循环加热垫设置为 37 度。

定期检查动物的麻醉水平，并根据需要补充原始麻醉剂量。在头皮皮肤下注射 200 微升 0.5% 马卡因以麻木该区域，切开皮肤，并去除颅骨上的皮瓣。去除骨膜并用干净的棉签擦干该区域。

根据您的需要，使用带有 0.5 毫米毛刺的高速牙钻在感兴趣的大脑区域上轻轻勾勒出一个直径为 3 到 5 毫米的圆圈。定期用无菌的 0.9% 盐水润湿钻孔现场，并用干净的棉签清除骨尘。如果骨流血，请使用预先浸泡有无菌生理盐水的凝胶泡沫吸干出血并等待其停止。

当到达最后一个骨层时，用细尖镊子提起并去除骨岛。您可能会遇到骨骼底部架上的硬脑膜附件。如果您的窗户与骨缝合线交叉，则应轻轻移除这些缝合线。

当骨瓣被提起时，将湿润的凝胶泡沫轻轻滚动在裸露的硬脑膜上以清洁其表面并等待任何硬脑膜出血停止。如果您感兴趣的区域位于硬脑膜特别厚的位置下，则可能需要去除其上方的硬脑膜。如果是这种情况，请用非常细的镊子轻轻地将硬脑膜与下面的 PIA 分开。

用另一对细镊子在提升的硬脑膜上做一个小切口。然后抓住切边，轻轻劈开硬脑膜。硬脑膜很薄但很结实，所以要小心不要用硬脑膜的完整边缘切开大脑。

当您离开感兴趣的区域时，用无菌 A CSF 或无菌盐水充分冲洗该区域。如果周围的颅骨在暴露的硬脑膜或软脑膜周围明显弯曲，请使用快速细胞粘合剂填充不会与窗盖玻片紧密接触的区域，这些区域不会被成像。然后将无菌玻璃盖玻片轻轻地放在硬脑膜或软脑膜上。

使用 Sano 丙烯酸凝胶覆盖弹性体粘合剂和玻璃边缘。盖玻片。用 Sano 氰基丙烯酸酯凝胶或疯狂的胶水和牙科水泥混合物覆盖整个暴露的头骨。

在颅骨的另一端嵌入定制的金属头固定杆。在腹膜内注射每公斤 5 毫克酮洛芬后，将动物放回温暖的恢复室以控制疼痛。术后继续服用镇痛药两天。

术后恢复两周后，用 ISO 氟麻醉动物。5% 用于诱导，1.5% 用于维持。将其安装在带有头部固定框架的定制显微镜载物台上，并检查颅窗的光学清晰度。

在蓝光照射下，脑表面血管的清晰度高度表明颅窗质量。如果它们的边缘清晰定义，则窗口可能可用。在开始行为协议之前，应将动物饲养在一致的家庭笼子环境中，以尽量减少日常变化。

在基线弧中，GFP 表达水平根据感兴趣的大脑区域开始行为训练或环境刺激范式。例如，动物可以连续几天暴露在不同的视觉环境中，以对视觉皮层弧中独特的神经元群进行成像，神经元中的 GFP 荧光通常在刺激后两小时达到峰值水平。可以优化实验时间表，以促进检测神经元中 ARC GFP 在其峰值荧光水平下的表达。

完成行为训练或环境刺激后，用 5% 的 ISO 氟麻醉动物以进行诱导，用 1.5% 的氟进行维持。将动物安装在带有头部固定框架的定制显微镜载物台上。在双光子显微镜下，动物的头部位置固定在头部固定架上，该固定架使用颅骨上植入的金属棒直接连接到载物台。

ISO 氟和氧气通过鼻锥持续供应给小鼠。使用加热垫保持体温。确保显微镜检测器不受环境光的影响。

通过在暗室中进行双光子激光扫描，使用 20 x 或 25 x 1.05 数值孔径水浸透镜进行成像。首先，在 落射荧光照明下，使用 CCD 相机获取感兴趣大脑区域表面血管图案的图像。为了将来的图像对齐，开始双光子激光扫描以获取 3D 图像堆栈。

双光子激光器的激发波长设置为 920 纳米，功率设置为大约 50。毫瓦级发射的荧光同时在绿色和红色通道弧中检测。GFP 荧光仅出现在绿色通道中，而组织自发荧光出现在两个通道中。

典型的图像堆栈尺寸约为 320 x 300、20 x 100 微米，水平分辨率为每像素 0.5 微米，垂直分辨率为每像素 3 微米。获取图像堆栈后，将动物放回其家笼。在下一次行为和成像会议之前不要打扰动物。

根据需要在几天内重复行为和成像程序。使用先前采集的脑表面血管图像定位回相同的成像位置。这项技术的优势在于它允许检查同一组神经元在多天内的 arc 基因表达变化。

在活体动物中。标准组织化学方法可以实现单细胞分辨率，但无法追踪同一神经元在多天内的基因表达变化。其他成像技术（如磁共振或细胞核成像方法）缺乏对单个神经元进行成像的分辨率。

因此，没有其他现有的测量基因表达变化的方法可以同时匹配此处描述的成像方法的空间分辨率和时间覆盖范围。该程序的一个关键步骤是颅窗手术。应格外小心，以避免对大脑造成创伤或在玻璃盖玻片下方留下血液。

如有必要，可以去除硬脑膜。请记住，使用此程序在大脑中的最大成像深度将取决于颅窗清晰度、显微镜设置和荧光报告基因的亮度。这种体内成像方案是一种有效且通用的方法，可获取有关单个神经元中响应各种行为体验的神经可塑性相关分子动力学的信息，并且可能通常适用于携带其他经验调节基因的荧光报告基因的转基因小鼠。