Name: 在体内双光子成像的经验依赖的分子在大脑皮质神经元的变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习利用双光子显微镜和基因编码报告基因在小鼠大脑皮层神经元中追踪经验依赖的ARC分子变化。该方法可实时观察神经元对行为挑战的适应性反应机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 L. Belluscio 提供手术录像设备，D. Kwon 提供录像协助，K. Liu 提供视频剪辑协助，以及 K. MacLeod 提供所有背景音乐。K.W. 感谢美国国家精神卫生研究所（NIMH）所内研究项目部以及基因、认知与精神病学项目提供的大力支持。本研究得到了美国国家精神卫生研究所所内研究项目（V.C.、Y.Y.、S.M.、K.W.）和美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIAAA）所内临床与生物研究项目部（V.C.、R.M.C.、D.M.L.）的资助。

下述实验程序已获国家心理健康研究所动物护理与使用委员会批准，并符合 美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南.
1. 术前准备
<ol>
 <li>在进行无菌手术前，将所有工具在热珠灭菌器中灭菌，用70%乙醇清洁手术部位，并铺上干净的手术巾。佩戴无菌手套。通过腹腔注射每克体重0.02 ml的新鲜配制的1.2%阿佛丁溶液进行动物麻醉。或者，通过鼻罩使用异氟烷气体麻醉，诱导浓度为5%，维持浓度为1.5%，并配备被动废气清除系统。通过夹捏尾巴或脚趾检查麻醉深度，确保动物完全镇静。</li>
 <li>用无菌眼膏覆盖动物的眼睛，并皮下注射新鲜配制的地塞米松（0.2 mg/kg）和卡洛芬（5 mg/kg），以预防脑肿胀和炎症11。剃除耳间颅骨上方的毛发，并使用聚维酮碘溶液擦洗皮肤，再交替使用70%乙醇擦拭三次进行皮肤消毒。</li>
 <li>将动物固定在立体定位手术台上，使用耳杆固定，并在动物下方放置设定为37 °C的循环水加热垫。定期检查动物的麻醉深度，并根据需要补充初始麻醉剂剂量。</li>
 <li>在头皮皮肤下注射200 μl的0.5% Marcaine以麻醉该区域。切开皮肤并移除覆盖颅骨的皮瓣。清除骨膜，并用干净的棉签将该区域擦干。</li>
</ol>
2. 慢性颅窗手术
<ol>
 <li>使用高速牙科钻和0.5 mm钻头，在目标脑区上方轻轻划出一个直径为3-5 mm的圆形轮廓。定期用无菌0.9%生理盐水润湿钻孔部位，并用干净的棉签清除骨粉。如果骨组织出血，使用预先浸泡过无菌生理盐水的明胶海绵轻压止血，并等待出血停止。</li>
 <li>当到达最内层骨板时，用尖头镊子轻轻抬起并移除骨岛。如果开窗区域跨越骨缝，可能会遇到硬脑膜与骨板底缘的附着结构。在抬起骨瓣时应小心将其分离去除。</li>
 <li>用湿润的明胶海绵轻轻滚动擦拭暴露的硬脑膜表面，并等待任何硬脑膜出血完全停止。关键步骤：在所有硬脑膜出血停止前不得继续操作。血液滞留在颅窗内通常会导致颅窗不透明。</li>
 <li>如果目标区域位于硬脑膜特别厚的部位，可能需要去除其上方的硬脑膜。若需如此，先用极细镊子将硬脑膜与下方软脑膜轻轻分离，再用另一对细镊提起硬脑膜后做一小切口，然后夹住切口边缘，轻轻撕开硬脑膜。硬脑膜虽薄但坚韧，操作时需小心避免其完整边缘切割到脑组织。</li>
 <li>用无菌人工脑脊液（ACSF）或无菌生理盐水冲洗该区域。</li>
 <li>将一片无菌玻璃盖玻片（3-5 mm）覆盖在硬脑膜或软脑膜上。关键步骤：如果周围颅骨曲率较大，应在成像区域以外、硬脑膜或软脑膜无法与盖玻片紧密贴合的间隙处使用Kwiksil12粘合剂填充。</li>
 <li>用氰基丙烯酸酯凝胶覆盖弹性体粘合剂及玻璃盖玻片边缘。将整个暴露的颅骨表面覆盖氰基丙烯酸酯凝胶，或使用Krazy Glue与牙科水泥的混合物。关键步骤：切勿让任何氰基丙烯酸酯凝胶接触脑表面。</li>
 <li>在颅骨的另一端嵌入一个定制的金属头固定杆。</li>
 <li>给予动物腹腔注射酮洛芬（5 mg/kg）以进行镇痛处理后，将其放回温暖的恢复舱中。术后继续给予镇痛药物两天。</li>
 <li>术后恢复两周后，使用异氟烷（诱导浓度5%，维持浓度1.5%）麻醉动物，将其固定于定制的显微镜载物台上并配合头固定框架，然后在蓝光照射下检查颅窗的光学透明度。脑表面血管的清晰程度是评估颅窗质量的重要指标。若血管边缘清晰锐利，则颅窗很可能可用。建议术后恢复两周，以确保动物充分恢复。在此期间，颅窗通常会逐渐变得透明，且可在数周至数月内保持良好的光学透明性，直至颅骨再生或硬脑膜增厚导致窗口质量下降。</li>
</ol>
3. 行为学实验方案与激光扫描双光子显微镜
<ol>
 <li>对具有清晰颅窗的动物施加环境刺激或进行行为训练，随后在 Arc-GFP 表达达到峰值的时间点进行成像。在开始行为学实验方案之前，应将动物维持在稳定的家庭笼具环境中，以最大限度地减少基线 Arc-GFP 表达水平的日常波动。</li>
 <li>根据感兴趣脑区的不同，开始行为训练或环境刺激范式。例如，可在连续数日内使动物暴露于不同的视觉环境，并在每天视觉刺激后进行成像，以识别视觉皮层中与特定刺激相关的反应10。</li>
 <li>神经元中的 Arc-GFP 荧光通常在刺激后两小时达到峰值。可优化实验时间线，以便在荧光强度最高时检测神经元中 Arc-GFP 的表达水平。</li>
 <li>完成行为训练或环境刺激后，使用异氟烷（诱导剂量5%，维持剂量1.5%）对动物进行麻醉，并将其固定于定制的显微镜载物台及头部固定框架上，置于双光子显微镜下进行成像。</li>
 <li>利用颅骨上植入的金属条将动物头部固定在直接连接载物台的头部固定框架上。通过鼻罩持续向小鼠输送异氟烷和氧气。使用加热垫维持动物体温。</li>
 <li>确保在暗室中进行双光子激光扫描，以保护显微镜探测器免受环境光干扰。使用20倍或25倍（数值孔径1.05）的水浸物镜进行成像。首先在反向荧光照明下，利用CCD相机采集感兴趣脑区表面血管模式的图像，用于后续图像配准。</li>
 <li>启动双光子激光扫描以获取三维图像序列。本实验系统采用 Olympus FV1000MPE 多光子显微镜。双光子激光的激发波长设定为920 nm，物镜端输出激光功率约为50 mW。使用紧邻样本位置的外置双通道光电倍增管探测系统，同时在绿色和红色通道中检测发射荧光（分色镜570 nm，滤光片分别为495–540 nm 和 570–625 nm）。Arc-GFP 荧光仅出现在绿色通道，而组织自发荧光在两个通道中均有信号13, 14。</li>
 <li>典型的图像序列尺寸约为 320×320×100 μm（宽×长×深），横向分辨率为 0.5 μm/像素，纵向分辨率为 3 μm/像素。</li>
 <li>完成图像序列采集后，将动物放回其家庭笼具中。在下一次行为与成像实验前避免干扰动物。根据需要在多日内重复行为与成像流程。利用先前获取的脑表面血管图像，重新定位至相同的成像区域。</li>
</ol>

<ol><li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li>
<li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li>
<li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li>
<li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li>
<li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+growth+factor+and+activity-regulated+gene%2C+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li>
<li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li>
<li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+Arc%2C+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680(2008).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+Mice.+Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Nucl.+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li>
<li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li>
<li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li>
<li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述的活体成像方法能够在活体动物中对同一群神经元连续多日重复检测Arc基因表达的变化。该方法是一种高效且多功能的技术，可用于获取个体神经元在不同行为经历下与神经可塑性相关的分子动态信息。传统的组织化学方法如原位杂交和免疫染色可达到单细胞分辨率3,，但无法在多日内追踪同一神经元中的基因表达变化。生物发光、磁共振或核成像方法可通过适当的报告基因在同一个体中追踪基因表达变化15,，但缺乏足够的空间分辨率以区分单个神经元的表达水平。因此，目前尚无其他现有方法在空间分辨率和时间覆盖范围上能够同时与本文所述的成像方法相媲美。
该操作中的一个关键步骤是颅窗手术。进行此手术时必须格外小心，以避免对脑组织造成损伤或在玻璃盖片下残留血液，否则会引起炎症并降低颅窗的清晰度。如果颅窗手术操作得当，窗口可保持清晰数周，直到硬脑膜增厚或颅骨从窗口边缘再生而影响进一步成像为止。必要时可去除硬脑膜，正如在大鼠和猴的慢性光学成像实验中所采用的方法16,17,，以提高颅窗的光学透明度。
<p class=...

<table><tbody><tr><td>FV1000 多光子激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td>成像</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Omano</td><td>555V107</td><td>手术</td></tr><tr><td>小鼠立体定位手术台</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726335</td><td>手术</td></tr><tr><td>20X 或 25X 水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>成像</td></tr><tr><td>带头部固定架的显微镜载物台</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>成像</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>手术</td></tr><tr><td>牙科钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>手术</td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>QImaging</td><td>QICAM 12-bit</td><td>成像</td></tr></tbody></table>

体内 双光子成像技术观察皮层神经元中由经验引起的相关分子变化

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

大脑根据经验而改变的能力对于正常的大脑功能至关重要，这一过程的异常会导致多种脑部疾病1,2。为了更深入地理解脑回路如何响应动物经验的机制，需要能够在活体动物中长期监测特定神经元群体中与经验相关的分子变化。尽管已知经验和相关的神经活动会触发神经元中的基因表达变化1,2，但目前大多数检测此类变化的方法无法在多天内对同一群神经元进行重复观察，或缺乏足够的分辨率以识别单个神经元3,4。本文中，我们描述了一种方法，该方法结合了体内双光子显微镜与基因编码的荧光报告系统，用于在日常经验过程中追踪单个皮层神经元中与经验相关的基因表达变化。
一个被广泛证实的依赖经验的基因为突触可塑性相关细胞骨架蛋白（Activity-regulated cytoskeletal associated protein，Arc）5,6Arc 基因的转录在神经元活动增强时被迅速且强烈地诱导3, 其蛋白质产物可调节谷氨酸受体的内吞作用及长时程突触可塑性7Arc 的表达被广泛用作分子标记，以绘制参与特定行为的神经环路3在大多数这些研究中，Arc 表达通过以下方法检测到 原位 在固定脑切片中进行杂交或免疫组织化学染色。尽管这些方法揭示了行为经历后Arc的表达定位于一部分兴奋性神经元，但尚未研究在数天内经历多次重复或不同刺激后，Arc表达的细胞模式可能发生怎样的变化。 
体内双光子显微镜技术为研究活体大脑中与经验相关的细胞变化提供了一种强大的手段8,9。为了实现通过双光子显微镜观察活神经元中Arc基因的表达，我们此前构建了一种基因敲入小鼠品系，其中绿色荧光蛋白（GFP）报告基因受内源性Arc启动子的调控10。本实验方案描述了在活体动物中追踪神经元群体内与经验依赖性相关的Arc-GFP表达模式所需的手术准备和成像操作流程。在该方法中，首先在Arc-GFP小鼠感兴趣皮层区域上方植入慢性颅窗。随后，在特定行为范式干预后，于数天内多次利用双光子显微镜对其进行重复成像。该方法也可广泛适用于携带其他荧光报告基因、用于标记经验依赖性分子变化的动物模型4。

本方案描述了一种在活体动物中追踪单个皮层神经元依赖于经验的分子变化的方法。首先在携带基因表达荧光报告基因的小鼠大脑感兴趣皮层区域上建立慢性颅窗。随后可将双光子显微镜与多种行为范式相结合，以观察行为诱导的单个神经元分子变化，并在连续多天内对同一群神经元中的这些变化进行追踪（图1）。
在 Arc-GFP 小鼠中，使用本方案可对单个皮层神经元中 Arc 基因表达的依赖经验变化进行连续多天的可靠成像。该转基因 Arc-GFP 基因敲入小鼠在即刻早期基因 Arc 的内源性启动子控制下表达一种不稳定的绿色荧光蛋白（d2EGFP，蛋白半衰期约为两小时）（图 2）。
以往描述慢性颅窗的实验方案已概述了成功实施颅窗手术的关键步骤11。本方案进一步提供了在需要时去除硬脑膜的附加指导，这有助于在颅骨缝合线区域上方建立颅窗时获得更清晰的光学视野（见步骤2.4）。
颅窗手术恢复后，将动物固定于定制的头部固定架...

神经元中依赖于经验的分子变化对于大脑应对行为挑战时的适应能力至关重要。 体内 此处描述了一种双光子成像方法，该方法可通过基因编码的报告分子实现对单个皮层神经元中此类分子变化的追踪。

大脑根据经验而改变的能力对于正常的脑功能至关重要，这一过程中的异常会导致多种疾病……

神经元中由经验依赖的分子变化对于大脑适应行为挑战的能力至关重要。本文介绍了一种活体双光子成像方法，该方法可通过基因编码的报告分子对单个皮层神经元中的此类分子变化进行追踪。其中一个已被广泛证实的经验依赖基因是即刻早期基因——活动调节细胞骨架相关蛋白（arc）。ARC 的转录会因神经元活动增强而迅速且高度诱导。为了利用双光显微镜在活体神经元中检测 arc 的表达，我们使用了一种基因敲入小鼠品系，其中绿色荧光蛋白（GFP）报告基因受内源性 arc 启动子的调控。本方案描述了在活体动物中追踪依赖经验的神经元集群中 arc GFP 表达模式所需的手术准备和成像步骤。首先，我们将介绍该技术所需的动物准备步骤。携带arc GFP的动物将接受颅窗手术，并术后恢复约两周。随后检查颅窗质量，若可通过颅窗清晰成像神经元，则将动物置于夸环境，直至行为学与双光子成像实验开始。之后，这些动物将被反复进行双光子显微成像。在数天内完成所需的行为学实验范式后，使用热珠灭菌器清洁所有工具。在进行无菌手术前，用70%乙醇清洁手术区域，并铺上干净的手术垫。通过腹腔注射每克体重0.02毫升的1.2%伊弗麻醉溶液对动物进行麻醉。通过尾部或脚趾夹捏检查麻醉水平，以确保动物完全镇静。用无菌眼用软膏覆盖动物的眼睛，并皮下注射地塞米松 0.2 毫克/千克和卡洛芬 5 毫克/千克。剃除耳间颅骨上方的毛发，使用聚维酮碘擦洗液清洁皮肤，并用 70% 乙醇交替擦拭三次进行消毒。将动物固定于立体定位手术台上，耳杆固定，动物下方放置设定为 37 摄氏度的循环水加热垫。定期检查动物的麻醉深度，并根据需要追加原始麻醉剂剂量。在头皮皮肤下注射 200 微升 0.5% 布比卡因，以麻醉该区域，切开皮肤，并去除颅骨上方的皮瓣。清除骨膜，并用洁净的棉签将该区域擦干。根据实验需求，使用高速牙科钻和直径0.5毫米的钻头，在目标脑区表面轻柔地划出一个直径3至5毫米的圆形轮廓。定期用无菌0.9%生理盐水润湿钻孔部位，并用干净的棉签清除骨屑。若骨组织出血，可用预先浸透无菌生理盐水的明胶海绵轻压止血，并等待出血停止。当到达最深层骨层时，使用尖头镊子抬起并移除骨岛。您可能会遇到骨片底部有硬脑膜附着的情况。如果您的骨窗跨越了骨缝，应轻柔地将其去除。抬起骨瓣后，用湿润的明胶海绵轻轻擦拭暴露的硬脑膜表面以清洁，并等待任何硬脑膜出血停止。如果目标区域位于硬脑膜特别厚的部位下方，可能需要去除其上方的硬脑膜。若如此，应用精细镊子轻轻将硬脑膜与下方的软脑膜分离。用另一把精细镊子在抬起的硬脑膜上做一个小切口。然后夹住切开的边缘，轻轻撕开硬脑膜。硬脑膜虽薄但坚韧，因此需小心操作，避免残留的锐利边缘划伤脑组织。当你从感兴趣区域向后操作时，应使用无菌人工脑脊液（aCSF）或无菌生理盐水充分冲洗该区域。如果周围颅骨在暴露的硬脑膜或软脑膜处有明显曲度，导致某些区域无法与盖玻片紧密贴合且这些区域不会被成像，则可使用快速细胞黏合剂填充这些空隙。随后，将无菌玻璃盖玻片轻柔地覆盖在硬脑膜或软脑膜上。使用 Sano 丙烯酸凝胶覆盖弹性体粘合剂和玻璃的边缘。加盖盖玻片。用 Sano 氰基丙烯酸酯凝胶或万能胶与牙科水泥的混合物覆盖整个暴露的颅骨。在颅骨的另一端植入定制的金属头固定杆。给予动物腹腔注射酮洛芬，剂量为5毫克/千克，以进行术后镇痛，并将动物放回温暖的恢复室。术后继续使用镇痛药两天。术后恢复两周后，使用异氟烷（ISO fluorine）对动物进行麻醉，诱导剂量为5%，维持剂量为1.5%。将动物固定于定制的显微镜载物台上的头部固定框架中，并检查颅窗的光学清晰度。在蓝光照射下，脑表面血管的清晰度是颅窗质量的重要指标。如果血管边缘清晰分明，则表明颅窗可能可用。在开始行为学实验方案之前，应将动物饲养在稳定一致的家居笼环境中，以尽量减少每日之间的变异。在基础状态下，GFP表达水平开始进行行为训练或环境刺激范式，具体取决于目标脑区。例如，可在连续数天内使动物暴露于不同的视觉环境中，以成像视觉皮层中不同的神经元群体；神经元中的GFP荧光通常在刺激后两小时达到峰值水平。实验时间线可据此优化，以利于在神经元GFP荧光达到峰值时检测ARC的GFP表达水平。在完成行为训练或环境刺激后，使用5%异氟烷进行诱导麻醉，1.5%异氟烷维持麻醉。将动物固定于定制的显微镜载物台上，并使用头颅固定框架固定头部。在双光子显微镜下，通过颅骨上植入的金属条将动物头部固定于直接连接载物台的头颅固定框架上。通过鼻罩持续向小鼠供应异氟烷（ISO）和氧气。使用加热垫维持体温。确保显微镜探测器免受环境光影响。在暗室中进行双光子激光扫描时，使用20倍或25倍、数值孔径为1.05的水浸物镜进行成像。首先，在落射荧光照明下，用CCD相机获取脑部目标区域表面血管模式的图像。为便于后续图像配准，启动双光子激光扫描以获取三维图像序列。双光子激光的激发波长设置为920纳米，功率设置为约50毫瓦。发射的荧光同时在绿色和红色通道弧中被检测。GFP荧光仅出现在绿色通道中，而组织自发荧光则在两个通道中均可见。典型的图像堆栈尺寸约为 320 乘 300，20 乘 100 微米，横向分辨率为每像素 0.5 微米，纵向分辨率为每像素 3 微米。获取图像堆栈后，将动物放回其原有饲养笼中。在下一次行为学和成像实验之前，不要打扰该动物。根据需要在多天内重复行为学实验和成像操作。利用先前获取的脑表面血管图像，重新定位至相同的成像位置。该技术的优势在于，能够在多个时间点对同一群神经元中的 arc 基因表达变化进行检测。在活体动物中，标准的组织化学方法可达到单细胞分辨率，但无法在多天内追踪同一神经元的基因表达变化。其他成像技术，如磁共振成像或核成像方法，则缺乏对单个神经元进行成像所需的分辨率。因此，目前尚无其他现有的基因表达变化检测方法能够同时达到本研究所述成像方法的空间分辨率和时间覆盖范围。该实验流程中的一个关键步骤是颅窗手术，操作时需格外小心，以避免对脑组织造成损伤或在玻璃盖玻片下残留血液。如有必要，可去除硬脑膜。需要注意的是，采用此方法在脑组织中的最大成像深度将取决于颅窗的透明度、显微镜的配置以及荧光报告分子的亮度。这种活体成像方案是一种高效且通用的方法，可用于获取单个神经元在应对不同行为经验时与神经可塑性相关的分子动态信息，并且很可能广泛适用于携带荧光报告基因的其他经验调控基因的转基因小鼠。

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在体内双光子成像的经验依赖的分子在大脑皮质神经元的变化

为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体双光子钙成像技术是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。...

活体小鼠第2/3层双光子钙成像

一种微创方案，用于稳定小鼠脊柱并进行重复性操作 体内...

体内 使用双光子显微镜对小鼠脊髓进行成像

来源： Mizuno, H., et al. In Vivo 新生小鼠皮层神经元的双光子成像. J. Vis. Exp.

双光子显微镜用于成像小鼠幼崽的神经元形态

来源： Kamei, R. 等, 体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像 视频实验杂志 (2022)该视频展示了活体海马体CA1区（Cornu ammonis...

活体双光子成像观察小鼠海马区小胶质细胞动态

本文描述了一种在新皮层预定义的功能微区中用荧光染料标记神经元的方法。首先，利用内在信号光学成像获取功能图谱；然后，采用双光子显微镜对图谱中特定微区内的神经元进行标记和成像。...

结合内在信号成像与双光子成像技术实现新皮层特定功能微区神经元的靶向标记

在活体动物中进行延时成像可为完整大脑内的结构重组提供重要信息。本文介绍一种颅骨减薄制备方法，该方法可通过双光子显微镜对活体小鼠大脑皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像。...

双光子 体内 使用颅骨变薄制备法对小鼠皮层树突棘进行成像

本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠压后皮层神经元的长期成像 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠中进行双光子显微成像，并结合向背侧海马注射表达 mCherry...

双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

体内双光子成像技术在新生小鼠皮层神经元中的应用

本方法描述了一种慢性制备技术，可实现对活体小鼠海马体的光学观察。该技术可用于在数周时间内对神经元结构可塑性以及活动诱导的细胞可塑性进行纵向光学成像。...

活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像

本文介绍了一种通过精确控制的手术和双光子显微镜技术，对小鼠海马CA1区静息态小胶质细胞进行慢性体内观察的方法。...

体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像

学习利用双光子显微镜和基因编码报告基因在小鼠大脑皮层神经元中追踪经验依赖的ARC分子变化。该方法可实时观察神经元对行为挑战的适应性反应机制。

体内双光子成像技术观察皮层神经元中由经验引起的相关分子变化

探索更多视频

体内 双光子成像技术观察皮层神经元中由经验引起的相关分子变化

探索更多视频

体内双光子成像技术观察皮层神经元中由经验引起的相关分子变化