RNA改编为海洋软骨鱼类杂交整装胚胎发育和细胞组织学

该程序的总体目标是监测发展中的码头边缘的基因表达和硫酸盐决策。这是通过首先杂交，即家庭胚胎中的基因特异性 RNA 探针来实现的。该程序的第二步是在切片和染色后可视化胚胎中的基因表达 Sian 蓝和核固红，检查组织是否有基因特异性信息的表达和是否存在产生酸性粘蛋白的杯状细胞。

大家好，我是 Nicole the Dosio，是联合学院的生物学助理教授。与现有的 RNA 全安装和原位杂交方法相比，该技术的主要优点是该方案特别适用于海洋 SMA 等级。从储存在零下 20 摄氏度的甲醇中的暂存鳐鱼胚胎和用于暂存胚胎的制备 RNA 探针开始此协议。

在 29 30 或更晚时，可以在显微镜下从胚胎中取出表皮体。小心解剖表皮层，以最大限度地提高探针的穿透力。该协议最关键的步骤是确保探针完全穿透老年胚胎。

这包括从胚胎中去除外表皮层和适当的蛋白酶 K 处理。将胚胎转移到干净的玻璃闪烁瓶中，并使用反向甲醇系列再水化，在室温下轻轻摇动每种溶液 5 至 30 分钟，在 PBT 中洗涤两次 10 分钟，每次用轻轻摇动漂白剂和 6% 过氧化氢 PBT 摇动 1 小时。然后用摇晃重复 PBT 洗涤。

接下来，用 PK 处理胚胎，以便在杂交过程中穿透探针。孵育的持续时间和使用的酶量必须根据经验确定。最好使用经过滴度和测试的新鲜 PK 酶。

接下来，在 PBT 中快速冲洗胚胎以洗去 pk。然后，为了使 PK 失活，用 4% PFA、0.2% 戊二醛的 PBT 溶液固定胚胎 20 分钟。轻轻摇晃，去除 PFA 溶液，洗涤两次，PBT 每次 10 分钟。

对于预杂交，添加足够的预热杂交溶液以覆盖胚胎，通常为 2 到 3 毫升。然后将胚胎在 70 摄氏度下孵育 1 小时，轻轻搅拌。要制备杂交溶液，请将 RNA 探针预热至 70 摄氏度 10 分钟，然后在冰上冷却。

我们用新鲜的预热杂交溶液替换预杂交溶液，刚好足以覆盖 15 至 20 微升 RNA 探针到小瓶中的胚胎。拧紧盖子，并在 70 摄氏度下轻轻摇晃过夜。从小瓶中的胚胎中取出探针溶液，继续该方案。

然后，通过溶液 1 和溶液 2 进行一系列的六次洗涤，所有洗涤都轻轻摇晃。将胚胎转移到六孔组织培养板中的网孔中，然后用 TBST 洗涤 3 次以预封闭胚胎。在 TBST 中制备 10% 热灭活绵羊血清的溶液。

将溶液加入板中后，在室温下摇动胚胎 1 小时以添加抗体。将胚胎从网孔转移到玻璃小瓶中，该玻璃瓶中含有 1% 加热和 1% 活性绵羊血清 TBST 中的 1 至 5， 000 个抗 DIG fab 片段。第二天将它们在 4 摄氏度下摇晃过夜。

早上，去除抗体，并在一天中将胚胎放回网孔中。在 TBST 中进行一系列洗涤，最后进行过夜洗涤。抗体洗涤完成后，将胚胎转移到装有新鲜 NTMT 的玻璃保温瓶中。

在新鲜的 NTMT 中洗涤 3 次，每次洗涤 10 分钟。用 NBT 加 BCIP 反应混合物替换最后一次 NTMT 洗涤。因为这些反应物对光敏感。

用箔纸盖住样品瓶，然后在室温下摇动。每 15 分钟监测一次颜色反应，直到清晰可见所需的基因表达反应完成后，在 PBT 中洗涤胚胎两次，然后将胚胎在 4% 多聚醛加 0.1% 葡萄糖醛中固定一小时。最后，用解剖立体显微镜观察胚胎。

包埋和切片 EMA 曲柄组织后，将切片朝上的载玻片放在载玻片加热器上。融化 45 分钟。接下来，将载玻片架中的载玻片带到通风橱中。

通过在二甲苯中洗涤载玻片两次，每次洗涤 5 分钟来溶解石蜡。然后以乙醇系列的形式对玻片进行再水化，每种溶液 1 分钟。现在，将再水化的组织在 pH 值为 2.5 的葱蓝溶液中染色 15 分钟。

用流动的自来水冲洗纸巾 3 分钟，以显影。然后将冲洗纸巾和蒸馏水浸入 10 分钟的核固红复染溶液中。再次冲洗载玻片和流动的自来水三分钟，然后将它们浸入蒸馏水中。

现在，在乙醇系列中对组织进行脱水，每种溶液使用 20 次浸入。脱水后，用二甲苯洗涤玻片两次，每次洗涤 5 分钟。在作载玻片之前，用 DPX 封固剂和盖玻片封固准备好的组织。

让封固剂在引擎盖中干燥并硬化 48 小时。溜冰鞋胚胎 C 2 中的 RNA 孔安装描述了声波刺猬和 hox 的表达。声刺猬和高等脊椎动物的 8 个 13 表达存在于非索和肠道内胚层中，并且这种表达模式在滑板海洋 sma 中是保守的。

Brinks 有一种独特的渗透调节方法，利用直肠腺分泌盐 hox。A 13 在发育中的直肠腺中表达很高，但其在这里的作用仍然未知。用 alium blue 染色消化道显示含有酸性粘蛋白的 cot 细胞。

酸性粘蛋白在整个消化道中的分布不同，反映了酸性粘蛋白功能的差异。酸性粘蛋白在螺旋肠和阴沟梭菌中稀疏产生，而在远端肠道中，它们的浓度较高。在尝试此程序时，请务必遵循处理 RNA 的常见做法，以避免核酸酶污染。

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