Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

该程序的总体目标是使用两种平行实验方法从神经元付款人斑块中分离和免疫染色淋巴细胞和树突状细胞。首先，从小鼠、小肠中切除新鲜的付款人贴片。然后物理解离付款人的贴片，收集组织并通过网状过滤器，生成用于流式细胞术分析的单细胞悬液。

通过离心收获细胞，并将等分试样分配到 96 孔圆底板中。接下来，用针对细胞类型特异性表面标志物的抗体标记细胞。立即进行流式细胞分析以列举特定细胞类型：同时分离付款人贴剂并快速冷冻组织样品。

在 OCT 块、冷冻切片中，样品用针对细胞类型特异性表面标志物的抗体标记，然后通过共聚焦扫描激光显微镜一起可视化。这些方法将量化付款人贴片组织内特定隔室中的 B 细胞、T 细胞和树突状细胞。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为 PI 的贴片组织非常脆弱并且很容易损坏。

在处理过程中。将新鲜分离的小肠放在湿纸巾或 Kim 湿巾床上。然后用生理盐水轻轻润湿小肠，以防止组织脱水。

现在，直观地识别位于肠道抗肠系膜侧的单个付款人斑块。通常，一只小鼠有 5 到 10 个可见的付款人斑块，这些斑块从十二指肠到回肠均匀分布。使用弯曲的手术剪刀通常会切除个人付款人的贴片。

将它们置于冷的 Hank 天平分选溶液中，将组织保持在 4 摄氏度以保持细胞活力。接下来，将付款人的贴剂转移到 5 毫升脾解离培养基中，并在 37 摄氏度下以 250 RPM 摇动 15 至 20 分钟。然后，为了生成单细胞悬液，将样品放在无菌的 70 微米尼龙网状细胞过滤器上，并使用 one cc 注射器的柱塞底部将组织强行研磨到网状物中，以去除剩余的细胞聚集体。

通过第二个 70 微米比色皿倒出细胞悬液，过滤并收集在 15 或 50 mL 锥形管中。将 10 个细胞分装到每孔 5 个细胞中，以 1000 次离心 5 分钟，分装到 96 孔圆底板沉淀细胞中。G.然后轻轻倒置板，倒出上清液。

现在将细胞重悬于 FC 块缓冲液中，并在冰上孵育 15 分钟。接下来，将 Fluor 偶联抗体以所需稀释度直接添加到细胞悬液中，并在含有 100 μL 流式缓冲液的冰洗细胞上孵育。然后将细胞重悬于 400 μL 固定缓冲液中，通过流式细胞术分析细胞，以分离付款人斑块进行冷冻切片。

切下 0.5 厘米的小肠横段，包含一个付款人补丁。将组织转移到含有 PBS 的培养皿中。然后将肠道组织段垂直放置在含有 OCT 的基模内。

将模具浸入液氮中，让组织完全冻结。使用镊子从液氮中取出冷冻的基模。让模具升温室温，刚好足以使 OCT 块的边缘软化。

然后从模具中取出冻结的 OCT 块。倒置模具并轻轻按压背面，将块顶出到一块干净的 4 x 4 厘米的铝箔上。立即将组织包裹在铝箔中，并放入储存在液氮中的贴有标签的标本袋中，或使用 LI a CM 3 0 5 0 s 冷冻切片机或等效物将组织冷冻切片。

将低温恒温器上的腔室温度设置为零下 21 摄氏度。理想情况下，切割厚度为 12 至 14 微米的切片。将切片收集到 Supercross plus 玻璃显微镜载玻片上。

使用标准低倍光学显微镜目视检查样品。将玻片浸入丙酮中 2 分钟。请注意，长时间孵育可能会导致组织从载玻片上脱落。

用 PBST 洗涤样品 3 次。然后用图像疏水笔圈出这些部分。现在将样品在封闭缓冲液中孵育，用一抗溶液覆盖组织切片。

使用 Kim 湿巾或其他吸收性组织擦干切片周围的区域，不要接触实际的组织切片。使用移液管或滴管，轻轻地将一滴加长金封固剂直接滴在切片上。盖上玻璃盖玻片，避免气泡并吸干任何多余的镶样。

对总付款人斑片细胞的单分散悬浮液进行中等传真分析，揭示了良好细胞制备中良好和不良细胞制备之间的明显区别。凭借超过 80% 的活力，绝大多数细胞表现出高前向散射，表明高细胞体积和低侧向散射与低细胞颗粒度一致。在本实验中，特意制备了不良的细胞制备，以证明在不良群体中，大多数细胞表现出低 FSC、高 SSC，并且超出指示的步态 R。

这些细胞可能正在经历细胞凋亡和/或坏死。这里有多达四种不同 Fluor 的混合物。四种偶联单克隆抗体，用于区分多种细胞类型。

在付款人斑块中，使用带有一组分化标志物的标记单细胞悬液。CD 19 和 B two 20 显示 B 细胞约占门控支付者的 60%。斑片细胞群特异性 T 细胞亚群可以通过用针对 CD 3 和 CD 4 或 CD 3 和 CD 8、CD 4 阳性和 CD 8 阳性 T 细胞的抗体双重标记轻松计数，分别约占总付款人斑片细胞的 23% 和 9%。

DC 的子集，它们将 CD 11 C 阳性和 CD 1 0 3 阳性也可以用这种方法枚举。CD 11 C 阳性 dc 约占总门控人口的 8%，大约相当于每个付款人补丁 10， 000 个 dc。在 CD 11 C 阳性细胞群中，约 4.7% 的 B 2 20 阳性双阳性。

当从 C 57 black 6 小鼠中收集付款人修补细胞时，可以获得类似的结果。不良的细胞制备会导致高度误导的结果，主要是因为死亡或垂死的细胞往往会非特异性地结合抗体。通常，这些导致 B 2 2 0 阳性细胞和 CD 3 阳性双阳性细胞以及 B 2 个 20 阳性 B 细胞和 CD 4 阳性 T 细胞双阳性细胞的过度表达。

小鼠付款人贴片冷冻切片适用于组织病理学分析和免疫标记。虽然当被 h 和 e 染色时，in 切片的功能在细胞水平上提供了更高的分辨率，但付款人斑块生发中心的明暗区域在冷冻切片中更容易划分。在这个典型的付款人贴片冷冻切片中，抗 CD 三种抗体，标记 T 细胞抗 CD 11 C 抗体。

突出显示树突状细胞和抗 B 20 抗体。突出 B 细胞 发育后。这项技术为该领域的研究人员了解特定细胞类型（如肠道相关淋巴组织中的树突状细胞）如何对肠道抗原和微生物病原体做出反应铺平了道路。

这些信息影响了粘膜疫苗的设计和开发。