从小鼠派伊尔集合淋巴结中分离并免疫染色淋巴细胞与树突状细胞

本实验的总体目标是通过两种并行的实验方法，从小鼠小肠的派伊尔结中分离并进行免疫染色淋巴细胞和树突状细胞。首先，从小鼠小肠中切除新鲜的派伊尔结组织，然后通过物理方法解离派伊尔结，收集组织并通过细胞筛网过滤，以获得单细胞悬液用于流式细胞术分析。

通过离心收集细胞，并将等分试样分装至96孔圆底板中。随后，使用针对细胞类型特异性表面标志物的抗体对细胞进行标记。立即进行流式细胞术分析，以计数特定的细胞类型；同时平行分离派伊尔结并快速冷冻组织样本。

在OCT包埋块中进行冷冻切片，然后用针对细胞类型特异性表面标志物的抗体对样本进行标记，并通过共聚焦激光扫描显微镜联合成像。这些方法可定量分析派尔集合淋巴结组织特定区域中的B细胞、T细胞和树突状细胞。通常，初次接触该技术的研究者会遇到困难，因为派尔集合淋巴结组织极为脆弱，容易受损。

操作过程中，将新分离的小肠置于湿润的纸巾或Kimwipe上，然后用生理盐水轻轻润湿小肠，以防止组织脱水。

现在，通过肉眼识别位于肠管对系膜侧的单个派伊尔结（Peyer's patches）。通常，一只小鼠具有5到10个可见的派伊尔结，从十二指肠至回肠均匀分布。使用弯头手术剪，通常可将单个派伊尔结切除。

将组织置于冰冷的Hank's平衡盐溶液中，保持组织在4°C条件下以维持细胞活性。接着，将Peyer's斑块转移至5毫升脾脏解离培养基中，在37°C下以250转/分钟振荡15至20分钟。然后，为了获得单细胞悬液，将样品置于无菌的70微米尼龙网细胞滤器上，使用1毫升注射器活塞底部用力研磨组织，使其通过滤网，以去除残留的细胞团块。

将细胞悬液通过第二个70微米细胞滤网过滤，并将细胞收集到15或50毫升的锥形管中。以每孔10⁵个细胞的密度将细胞悬液分装至96孔圆底培养板中，于1000 × g离心5分钟形成细胞沉淀。然后通过轻轻倒置培养板去除上清液。

现在将细胞重悬于FC封闭缓冲液中，冰上孵育15分钟。接着，将荧光标记的抗体按所需稀释比例直接加入细胞悬液中，冰上孵育，然后用100微升流式缓冲液洗涤细胞。随后将细胞重悬于400微升固定缓冲液中，用于流式细胞术分析，并分离派尔集合淋巴结以进行冷冻切片。

切取包含单个派尔集合淋巴结的0.5厘米小肠横切段。将组织转移至含有PBS的培养皿中。然后将肠组织段垂直置于含有OCT包埋剂的底模内。

将模具浸入液氮中，使组织完全冷冻。使用镊子取出已冻结的基底模具。让模具在室温下回温至 OCT 包埋块边缘刚好软化即可。

然后从模具中取出冷冻的OCT包埋块。将模具倒置，轻轻按压背面，使包埋块脱模并落入一张洁净的4 cm × 4 cm铝箔上。立即用铝箔包裹组织样本，并放入已标记的样本袋中，置于液氮或干冰中保存，随后使用Leica CM3050 S冷冻切片机或同等设备对组织进行冷冻切片。

将切片机的腔室温度设置为零下21摄氏度。理想情况下，切取厚度为12至14微米的切片。将切片收集到Supercross plus载玻片上。

使用标准的低倍光学显微镜对样本进行肉眼观察。将载玻片浸入丙酮中两分钟。注意，长时间孵育可能导致组织从载玻片上脱落。

用PBST洗涤样本三次。然后用免疫组化疏水笔在组织切片周围画圈。接着将样本在封闭缓冲液中孵育，并在组织切片上覆盖一抗溶液。

使用 Kim 擦拭纸或其他吸水纸擦干组织切片周围的区域，注意不要触碰到实际的组织切片。使用移液器或滴管，轻轻将一滴抗淬灭封片剂（prolonged gold mounting medium）直接滴加到切片上。盖上玻璃盖玻片，避免产生气泡，并吸去多余的封片剂。

对单分散的全贴壁细胞悬液进行中等流式分析，可清晰区分优质与劣质细胞样本。在优质细胞样本中，细胞存活率超过80%，绝大多数细胞表现出较高的前向散射光信号，表明细胞体积较大，同时侧向散射光信号较低，提示细胞颗粒度小。本实验中特意制备了劣质细胞样本，以显示在不良细胞群体中，大多数细胞表现为低FSC、高SSC，且位于所示门控R1范围之外。

这些细胞可能正在经历凋亡和/或坏死。此处使用多达四种不同荧光素标记的单克隆抗体组合，以区分多种细胞类型。

在派尔集合淋巴结（Peyer's patches）中，使用单细胞悬液进行分化簇标记物染色。CD19和B220的染色结果显示，B细胞约占门控后的派尔集合淋巴结细胞的60%。通过使用抗CD3和CD4抗体或抗CD3和CD8抗体进行双重标记，可轻松计数派尔集合淋巴结细胞群中特异性的T细胞亚群。CD4阳性与CD8阳性T细胞分别约占派尔集合淋巴结总细胞的23%和9%。

DC 的亚群中，CD11c 阳性和 CD103 阳性的细胞也可通过此方法进行计数。CD11c 阳性 DC 占总门控细胞群体的约 8%，相当于每个 Peyers 小结中约 10,000 个 DC。在 CD11c 阳性细胞群体中，约 4.7% 为 B220 阳性双阳性细胞。

当从C57黑鼠（C57 black six小鼠）获取贴壁细胞时，也可得到类似结果。细胞制备效果较差可导致严重误导性的结果，主要原因在于死亡或濒死细胞倾向于非特异性地结合抗体。这类情况通常会导致B220阳性与CD3阳性双阳性细胞，以及B220阳性B细胞和CD4阳性T细胞双阳性细胞的比例被高估。

小鼠派尔集合淋巴结的冷冻切片适用于组织病理学分析以及免疫标记。尽管石蜡切片在经苏木精和伊红（H&E）染色后可在细胞水平上提供更高的分辨率，但派尔集合淋巴结生发中心的明区与暗区在冷冻切片中更易于区分。在此典型的派尔集合淋巴结冷冻切片中，抗CD3抗体标记T细胞，抗CD11c抗体标记树突状细胞。

标记树突状细胞和抗B细胞CD20抗体。在其发育后标记B细胞。该技术为该领域研究人员阐明肠道相关淋巴组织中特定细胞类型（如树突状细胞）如何响应肠道抗原和微生物病原体奠定了基础。

这些信息影响了黏膜疫苗的设计与开发。