Name: 隔离和免疫淋巴细胞和树突状细胞的小鼠Peyer氏斑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习从小鼠Peyer氏斑分离和免疫染色淋巴细胞与树突状细胞的方法。本方案结合流式细胞术与冷冻切片技术，可定量分析B细胞、T细胞及树突状细胞亚群，为肠道免疫研究提供可靠实验基础。

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我们感谢Renjie Song（Wadsworth中心流式细胞术核心实验室）在细胞分析方面的协助，以及Helen Johnson（Wadsworth中心动物组织病理学核心实验室）在石蜡切片制备方面的帮助。我们感谢Richard A. Cole博士（Wadsworth中心光学显微镜核心实验室）在共聚焦显微镜使用和图像采集方面的协助。我们谨向Andy Bentley（Wadsworth中心摄影与插图实验室）在动画制作方面的帮助表示感谢。
	MDJ 由生命科学研究基金会和霍华德·休斯医学研究所（HHMI）博士后奖学金资助。SA 由瓦兹沃思中心-健康研究公司内部博士后奖学金资助。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 HD061916 和 GM082978 资助。

动物饲养在常规的无特定病原体条件下，并完全遵循瓦兹沃思中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行处理。
 1. 口服灌胃
 <ol>
 <li>（可选）使用22 G ×1.5英寸钝端饲喂针（Popper Scientific，New Hyde Park，NY）对选定的小鼠品系进行抗原或目标微生物的灌胃。每只小鼠的给药体积不应超过400 μl。</li>
</ol>
 2. 用于流式细胞术的PP细胞分离
 <ol>
 <li>根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南，通过 CO2 窒息法对小鼠实施安乐死。</li>
 <li>手术前用 70% 乙醇或碘伏清洁腹部。沿腹中线进行标准剖腹手术，从肋骨基底部约 1.5 cm 处开始，使用外科剪做一单个（1 cm）切口。暴露腹腔并识别盲肠。在回肠-盲肠交界处剪断末端小肠，并轻柔地完整取出肠道。在将肠道从腹腔取出时，注意不要过度拉伸肠组织。</li>
 <li>将小肠置于湿润的纸巾或 Kimwipe 上。用生理盐水轻轻润湿小肠，以防止组织脱水。在小肠对系膜侧肉眼识别各个派伊尔结（PP）（图 1）。通常，单只小鼠有 5 至 10 个可见的派伊尔结，从十二指肠（近端）到回肠（远端）均匀分布。平均而言，四只小鼠可获得 23 个派伊尔结。</li>
 <li>使用弯头外科剪，轻柔地切除各个派伊尔结，并将其放入冷的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中。注意，剪刀应弯曲面朝上，置于派伊尔结上方，然后轻柔地施加于组织。仅切除派伊尔结（不包括周围组织），并转移至冷的 HBSS 中。 
 注意：从本节第 2 部分起，所有孵育和离心步骤均应在 4 °C 下进行，以保持细胞活力。</li>
 <li>将派伊尔结转移至 5 ml 脾脏解离培养基中，在 37 °C 下孵育 15–20 分钟，同时以 250 rpm 剧烈振荡。过长的孵育时间会负面影响细胞活力。</li>
 <li>为获得单细胞悬液，将派伊尔结置于无菌（经高压灭菌）的 70 μm 尼龙网细胞筛上，使用 1 ml 注射器推杆底部用力研磨组织使其通过滤网。或者，将派伊尔结夹在两张无菌磨砂玻璃载玻片（经高压灭菌并封装于纸袋中）之间，以来回轻柔研磨组织。使用无菌移液管将细胞悬液转移至 5 ml Falcon 管中。</li>
 <li>向细胞悬液中加入 EDTA，使其终浓度为 1 mM。在室温下于摇床上孵育 5 分钟。</li>
 <li>将细胞悬液倾倒通过第二个 70 μm 细胞筛，以去除任何残留的细胞聚集体或组织碎片。将细胞收集至 15 或 50 ml 锥形管中。</li>
 <li>对细胞进行轻柔离心（500 × g 离心 5 分钟）。弃去上清液，并将细胞重悬于流式缓冲液中，该缓冲液为含 1% 胎牛血清（FCS）的磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
 <li>为测定细胞数量和活力，将细胞以 1:10 比例稀释于台盼蓝溶液中，并使用光学显微镜和血细胞计数板进行显微观察。或者，可使用 Countess 细胞计数仪（Invitrogen）或类似仪器自动计数细胞数量并评估细胞活力。 
 起始使用 20–25 个派伊尔结时，本方案应可获得 &gt;2.5 × 106 个总细胞。相当于每只小鼠约 0.8–1.2 × 106 个细胞。 </li>
 </ol>
 用于流式细胞术的细胞抗体标记
 <ol start="11">
 <li>将细胞（每孔 105 个）加入 96 孔圆底板的各孔中。</li>
 <li>将板进行轻柔离心（1,000 × g 离心 5 分钟），然后通过轻轻翻转板去除上清液。</li>
 <li>用 Fc 封闭缓冲液重悬细胞，在冰上孵育 15 分钟。尽管市面上有多种商用 Fc 封闭缓冲液（例如 大鼠抗小鼠 CD16/CD32，BD Biosciences），我们在此步骤中仅使用来自大鼠 B 细胞杂交瘤（ATCC 2.4.G2）的用过培养基，该细胞系可分泌针对小鼠 Fcγ 受体的单克隆 IgG1 抗体。</li>
 <li>同上，将板进行轻柔离心（1,000 × g 离心 5 分钟），并通过轻轻翻转板去除上清液。</li>
 <li>将荧光标记抗体直接按所需稀释比例加入细胞悬液中，在冰上持续振荡孵育 30 分钟。</li>
 <li>将板进行轻柔离心（1,000 × g 离心 5 分钟），并通过轻轻翻转板去除上清液。</li>
 <li>用 100 μl 流式缓冲液洗涤细胞。</li>
 <li>以 1,000 × g 离心 5 分钟，然后通过轻轻翻转板去除上清液。</li>
 <li>用 400 μl 固定缓冲液重悬细胞，该缓冲液由 300 μl 流式缓冲液与 100 μl 含 1% 多聚甲醛的 PHEM 缓冲液（60 mM PIPES、25 mM HEPES、10 mM EGTA、4 mM MgCl2，pH 6）组成。</li>
 <li>使用 FACSCalibur 或同等仪器对细胞进行流式细胞术检测，并使用 Cell Quest Pro 软件 5.2 版本分析结果。</li>
 </ol>
 3. PP 冷冻切片的制备
 <ol>
 <li>在组织取材前，将最佳切割温度（OCT）包埋剂加入7x7x5 mm的塑料底模中。同时准备一个液氮池（&gt;750 ml），置于杜瓦瓶或冰桶中。</li>
 <li>处死小鼠并按上述方法进行剖腹手术。取出肠道并置于湿润的纸巾上。</li>
 <li>为分离派伊尔结（Peyer's patches, PPs）以进行冷冻切片，截取包含单个PP的长约0.5 cm的小肠横段，并将组织转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。用PBS轻轻冲洗这些肠段的管腔，以去除不必要的粪便残渣。</li>
 <li>将肠组织段垂直放入含有OCT的底模中。将模具浸入液氮中，使组织完全冻结（1–2分钟）。当OCT由透明变为白色时，表明组织已完全冻结。若需更缓慢的冷却过程（例如，以减少OCT开裂），可将模具浸入由液氮蒸气冷却的异戊烷浴中。注意：操作液氮时应佩戴合适的安全护目镜。</li>
 <li>用镊子将已冻结的底模从液氮中取出，于室温下放置片刻（约10–15秒），直至OCT块边缘略微软化。随后将模具翻转，轻压底部，使冻结的OCT组织块脱模并落入一张洁净的4×4 cm铝箔上。立即用铝箔包裹组织，并放入标记好的样本袋中，储存于液氮或干冰中。或者，可将组织转移至冷冻冰箱（&lt;-20 °C）。组织应在一周内使用，否则随着时间推移，组织块会变脆。</li>
</ol>
冷冻切片
 <ol start="6"> 
 <li>使用 Leica CM3050S 冷冻切片机或同等设备对组织进行冷冻切片。冷冻切片机舱内温度应设定为 -21 °C。</li>
 <li>力求获得厚度为 12–14 μm 的切片。</li>
 <li>将切片转移至 Fisher SuperFrost Plus（或同等）载玻片上，并使用标准低倍光学显微镜进行肉眼观察。若在同一张载玻片上收集多个切片，应确保切片紧密聚集，以便后续染色操作。</li>
 <li>将载玻片置于室温下的玻片盒中保存，并尽量在数日内使用。</li>
</ol>
冷冻切片的抗体标记及共聚焦显微镜分析
<ol start="10">
 <li>将载玻片浸入组织染色缸或支架中的丙酮（或甲醇）中，孵育 2 分钟。长时间孵育可能导致组织从载玻片上脱落。</li>
 <li>将载玻片转移至新的染色缸中，用 PBS-T（含 0.05% Tween-20 的 1× PBS）洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
 <li>使用 ImmEdge 疏水笔在组织切片周围画圈。这可确保在孵育过程中试剂和抗体局限于该区域。</li>
 <li>在加湿孵育盒中，将载玻片与封闭缓冲液（含 2% 山羊血清的 PBS）于 37 °C 孵育 30 分钟，并避光。</li>
 <li>在加湿孵育盒中，将载玻片与 Fc 封闭缓冲液（见上文）于 37 °C 孵育 10 分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入 PBS-T 中漂洗，并用 Kimwipes 或其他吸水纸擦干切片周围区域。注意不要触碰实际的组织切片。</li>
 <li>在组织切片上覆盖一抗溶液，并在加湿孵育盒中于 37 °C 孵育 30 分钟。一抗通常用封闭缓冲液稀释至终浓度为 20 μg/ml。建议使用直接标记的一抗，因为在此步骤中最多可直接混合三种抗体。直接标记的一抗还可省去额外的二抗孵育步骤。</li>
 <li>将载玻片浸入 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
 <li>如有必要，在湿盒中加入相应的二抗，于 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
 <li>按照上述方法，在 PHEM 缓冲液中加入 1% 多聚甲醛，将载玻片孵育 4 分钟。</li>
 <li>用 PBS 冲洗载玻片 1 分钟。</li>
 <li>使用 Kimwipes 或其他吸水纸擦干切片周围区域。注意不要触碰实际的组织切片。用移液器或滴管，将一滴 Prolong Gold 封片剂轻轻滴加在切片上。将盖玻片覆盖在封片剂上，注意避免产生气泡。用吸水纸吸去多余的封片剂。</li>
 <li>用市售指甲油将盖玻片密封固定在显微载玻片上，并静置晾干。</li>
 <li>使用 Leica TCS SP5 或同等性能的共聚焦显微镜观察载玻片。</li>
 </ol>

<ol><li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA%27s+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li>
<li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li>
<li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li>
<li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GALT%3A+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li>
<li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+distinct+Peyer%27s+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+%28MIP%29-3alpha%2C+MIP-3beta%2C+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li>
<li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li>
<li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peyer%27s+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li>
<li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer%27s+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li>
<li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li>
<li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li>
<li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer%27s+patch%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li>
<li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer%27s+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225(2011).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040(2012).</li>
<li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer%27s+patches+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文提供了用于流式细胞术和功能分析的PP单细胞悬液制备，以及用于免疫染色的冷冻切片制备的平行实验方案。只要具备流式细胞仪和冷冻切片机，这两种方法均具有高度可重复性且易于实施。对于初次进行该实验的研究人员需特别指出，与脾脏相比，派伊尔结（PP）的总细胞得率相对较低。尽管如此，我们所描述的方案通常可从单只小鼠获得0.8–1.2 × 106个总PP细胞。虽然可以扩大样本量，但我们通常不汇集超过20–25个PP，因为根据我们的经验，过度汇集会导致细胞聚集，且细胞得率（及活力）显著下降。另一方面，我们也不建议使用少于15个PP进行本实验方案，因为需要达到一定的细胞数量阈值，才能成功完成整个细胞分离流程。如果下游功能实验对细胞活力要求较高，我们建议取少量分离后的细胞进行碘化丙啶染色，以便更准确地从总PP细胞群体中圈定活细胞群。最后需要指出的是，若需对特定细胞亚群进行过继转移或in vitro分析，本方法同样适用于细胞分选应用。
用于冷冻切片的PP组织收集相对简单，但PP组织的实际切片过程可能具有挑战性。例如，必须确保PP组织在模具中正确摆放（即垂直于模具...

派尔集合淋巴结（Peyer's patches，PPs）是人类和小鼠小肠中遍布的、由有序排列的淋巴滤泡组成的肉眼可见的集合体。图1是启动针对饮食抗原、共生细菌、微生物病原体以及口服疫苗黏膜免疫应答的主要部位 1-4与其他外周淋巴组织（如肠系膜淋巴结）不同，派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）缺乏输入淋巴管。因此，PPs中的适应性免疫应答是由来自肠腔的抗原所驱动的。肠腔抗原的取样由滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）完成，FAE由肠上皮细胞和一类称为M细胞的抗原取样细胞共同组成。在FAE下方的上皮下穹隆区（sub-epithelial dome, SED），分布着树突状细胞（dendritic cells, DCs）的网络，其间混杂有巨噬细胞、B细胞和CD4⁺ T细胞。+ T细胞 5-9每个派伊尔集合淋巴结（PP）淋巴滤泡的核心是滤泡树突状细胞（FDCs）和富含B细胞的中央生发中心，其周围为富含T细胞的滤泡间区。PP对抗原的摄取可诱导产生IgA+ B细胞浆母细胞和CD4+ 效应细胞和记忆细胞定植于周围的固有层，为抵御多种黏膜病原体提供免疫保护。
 解析与抗原取样、加工及呈递相关的复杂免疫事件在派伊尔集合淋巴结（PPs）中是一项艰巨的任务，考虑到PP细胞仅占肠黏膜中总淋巴细胞的极小部分。为协助这一研究 体外 在此环境中对细胞进行表征，我们提供了一种制备小鼠PP细胞总悬液用于流式细胞术和功能分析的方案，以及一种制备PP冷冻切片用于免疫荧光显微镜和免疫组织化学的方案。我们关于小鼠PP细胞的分离、表征及免疫染色的方案并非新颖 本身，这一点已得到充分证明，因为有大量可追溯至25年多前的文献均引用了这些技术 5,6,9-11相反，我们的方案为首次收集PPs的研究人员提供了一种简化的（且可视化的）方法。我们所描述的技术易于掌握，可快速获得大量细胞，且具有 &gt;90% 细胞活力。该冷冻切片方案可获得高度可重复的连续切片，非常适合免疫荧光染色和共聚焦成像。此外，本方案还补充了另外两种近期 JoVE 文章。第一篇由Fukuda及其同事撰写，描述了使用结扎回肠环实验来评估病原菌被派伊尔集合淋巴结M细胞摄取的情况 12另一种方法由Geem及其同事描述，介绍了从小鼠肠道黏膜中分离和鉴定树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的技术，但其分析中明确排除了派伊尔集合淋巴结（PPs）。 13.

<table><tbody><tr><td>OCT包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>7x7x5 毫米底模</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-552</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge笔</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4951</td><td></td></tr><tr><td>Edge Rite 刀片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c-PE</td><td>eBioscience</td><td>17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45R/B220-APC</td><td>BD Pharmigen</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3-FITC</td><td>BD Pharmigen</td><td>561798</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD4-PE</td><td>BD Pharmigen</td><td>553652</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD8-PE</td><td>BD Pharmigen</td><td>553032</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD19-PercP</td><td>BioLegend</td><td>115531</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的汉克平衡盐溶液（HBSS） </td><td>Fisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m细胞滤筛</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>脾脏解离培养基</td><td>干细胞技术</td><td>7915</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清 </td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Fc阻断</td><td>ATCC 2.4.G2</td><td>HB-197</td><td>来自2.4.G2细胞系的上清液</td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14061-09</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机 </td><td>Leica</td><td>3050S</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Richard Allan</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Richard Allan</td><td>71304</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Starplex Scientific</td><td>3661</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表1. &lt;/strong&gt; 本研究中使用的试剂与设备。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

从小鼠派伊尔集合淋巴结中分离并免疫染色淋巴细胞与树突状细胞

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）是肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues, GALT）的重要组成部分，在肠道免疫监视和稳态维持中发挥核心作用。肠道腔内的颗粒性抗原和微生物持续被滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）中的PP M细胞取样，并转运至下方的树突状细胞（dendritic cells, DCs）、巨噬细胞和淋巴细胞构成的网络中。本文描述了小鼠PPs的两种实验方案：（i）将PPs解离为单细胞悬液并进行流式细胞术分析；（ii）制备冷冻切片用于免疫染色。对于流式细胞术，PPs通过机械法解离后，经70 μm细胞筛过滤，以获得不含上皮细胞和大块碎片的单细胞悬液。从20–25个PPs（来自四只小鼠）开始，这一快速且可重复的方法可得到一群细胞 &gt;2.5 × 106 细胞与 &gt;90%细胞活力。对于冷冻切片，新鲜分离的派伊尔结（Peyer's patches）需浸入最佳切割温度（OCT）包埋剂中，置于液氮中速冻，随后使用冷冻切片机进行切片。组织切片（5–12 μm）经空气干燥后，用丙酮或甲醇固定，再进行免疫标记。

对总胰岛细胞（PP细胞）的单分散悬浮液进行流式细胞术分析，可明确区分细胞样品质量的优劣。在细胞活力超过80%的良好制备样品中，绝大多数细胞表现出较高的前向散射（FSC），表明细胞体积较大，同时侧向散射（SSC）较低，表明细胞颗粒度较小（图2A）。在本实验中，我们还通过在室温下（而非冰上）进行胰岛细胞分离步骤，并在最后一步使用含1% FCS的PBS（而非PHEM缓冲液）孵育细胞，人为制备了“质量较差的细胞样品”。在这些质量较差的样品中，大多数细胞表现出低FSC和高SSC，且位于设定门控R1之外（图2B）。这些细胞可能正在经历凋亡和/或坏死。
	图3展示了使用多达四种不同荧光染料偶联的单克隆抗体混合物，以区分派伊尔集合淋巴结（PP）单细胞悬液中的多种细胞类型。通过分化群（CD）标记物CD19和B220进行标记显示，B细胞约占门控PP细胞群体的60%（图3A）。通过CD3与CD4（图3B）或CD3与CD8（<strong...

人们对了解派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）中特定细胞亚群的免疫学功能日益关注，PPs 是肠道相关淋巴组织的主要诱导部位。本文概述了制备 PP 单细胞悬液用于流式细胞术分析以及制备 PP 冷冻切片用于免疫染色的并行实验方案。

派尔集合淋巴结（Peyer's patches，PPs）是肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues，GALT）的重要组成部分，在肠道免疫监视和……中发挥核心作用。

本实验的总体目标是从神经元派尔集合淋巴结中分离并进行免疫染色淋巴细胞和树突状细胞，采用两种并行的实验方法。首先，从小鼠的小肠中切除新鲜的派尔集合淋巴结。然后通过物理方法解离派尔集合淋巴结，收集组织并将其通过筛网过滤，以获得用于流式细胞术分析的单细胞悬液。通过离心收集细胞，并将等分试样分装至96孔圆底板中。接着，使用针对细胞类型特异性表面标志物的抗体对细胞进行标记。立即进行流式细胞术分析，以计数特定的细胞类型；同时平行分离派伊尔结并快速冷冻组织样本。在OCT包埋块中进行冷冻切片，然后用针对细胞类型特异性表面标志物的抗体对样本进行标记，并通过共聚焦激光扫描显微镜联合成像。这些方法可定量分析派尔集合淋巴结组织特定区室中的B细胞、T细胞和树突状细胞。通常，初次接触该技术的研究者会遇到困难，因为派尔集合淋巴结组织极为脆弱，容易受损。操作过程中，将新分离的小肠置于湿润的纸巾或Kim擦拭纸上，然后用生理盐水轻轻润湿小肠，以防止组织脱水。现在，通过肉眼识别位于肠管对系膜侧的单个派伊尔结（Peyer's patches）。通常，一只小鼠具有5到10个可见的派伊尔结，均匀分布于十二指肠至回肠之间。使用弯头手术剪，通常可将各个派伊尔结逐一切除。将组织置于冰冷的Hank's平衡盐溶液中，保持组织在4°C条件下以维持细胞活性。接着，将Peyer's斑块转移至5毫升脾脏解离培养基中，在37°C下以250转/分钟振荡15至20分钟。然后，为了获得单细胞悬液，将样品置于无菌的70微米尼龙网细胞滤器上，使用1毫升注射器活塞底部用力研磨组织，使其通过滤网，以去除残留的细胞团块。将细胞悬液通过第二个70微米细胞滤网过滤，并用15或50毫升锥形管收集细胞。以每孔10的5次方个细胞密度将细胞悬液分装至96孔圆底培养板中，于1000 × g离心5分钟形成细胞沉淀。然后通过轻轻倒置培养板去除上清液。现在将细胞重悬于FC封闭缓冲液中，冰上孵育15分钟。接着，按所需稀释比例将荧光标记抗体直接加入细胞悬液中，冰上孵育，然后用100微升流式缓冲液洗涤细胞。随后将细胞重悬于400微升固定缓冲液中，用于流式细胞术分析，并分离派尔集合淋巴结以进行冷冻切片。切取包含单个派尔集合淋巴结的0.5厘米小肠横断段。将组织转移至含有PBS的培养皿中。然后将小肠组织段垂直置于含有OCT包埋剂的底模内。将模具浸入液氮中，使组织完全冷冻。使用镊子取出已冻结的基底模具。让模具在室温下回温至 OCT 包埋块边缘刚好软化即可。然后从模具中取出包埋在OCT中的冻存组织块。将模具倒置，轻轻按压背面，使组织块脱模并落入一张洁净的4 cm × 4 cm铝箔上。立即用铝箔包裹组织，并放入已标记的样本袋中，置于液氮或干冰中保存，随后使用Leica CM3050 S冷冻切片机或同等设备对组织进行冷冻切片。将切片机的腔室温度设置为零下21摄氏度。理想切片厚度为12至14微米。将切片收集到Supercross plus载玻片上。使用标准的低倍光学显微镜对样本进行肉眼观察。将载玻片浸入丙酮中两分钟。注意，长时间孵育可能导致组织从载玻片上脱落。用PBST洗涤样本三次。然后用免疫组化疏水笔在组织周围画圈。接着将样本置于封闭缓冲液中孵育，并在组织切片上覆盖一抗溶液。使用 Kim 擦拭纸或其他吸水纸擦干组织切片周围的区域，注意不要触碰到实际的组织切片。使用移液器或滴管，轻轻将一滴抗淬灭封片剂（prolonged gold mounting medium）直接滴加到切片上。盖上玻璃盖玻片，避免产生气泡，并吸去多余的封片剂。对单分散的全贴壁细胞悬液进行中等流式分析，可清晰区分优质与劣质细胞样本。在优质细胞样本中，细胞存活率超过80%，绝大多数细胞表现出较高的前向散射（FSC），表明细胞体积较大，同时侧向散射（SSC）较低，符合细胞颗粒度小的特征。本实验中特意制备了劣质细胞样本，以证明在质量差的细胞群体中，大多数细胞表现为低FSC、高SSC，且位于所示门控R1范围之外。这些细胞可能正在经历凋亡和/或坏死。此处使用多达四种不同荧光素标记的单克隆抗体组合，以区分多种细胞类型。在派尔集合淋巴结中，使用单细胞悬液进行分化簇标记物染色。CD19和B220的染色结果显示，B细胞约占门控后派尔集合淋巴结细胞的60%。通过使用抗CD3和CD4抗体或抗CD3和CD8抗体进行双重标记，可轻松计数派尔集合淋巴结细胞群中特异性的T细胞亚群。CD4阳性与CD8阳性T细胞分别约占派尔集合淋巴结总细胞的23%和9%。DC 的亚群中，CD11c 阳性和 CD103 阳性的细胞也可通过此方法进行计数。CD11c 阳性 DC 占总门控细胞群的约 8%，相当于每个 Peyers 小结中约 10,000 个 DC。在 CD11c 阳性细胞群中，约 4.7% 为 B220 阳性双阳性细胞。当从C57黑鼠（C57 black six小鼠）获取贴壁细胞时，也可得到类似结果。细胞制备效果较差可导致严重误导性的结果，主要原因在于死亡或濒死细胞倾向于非特异性地结合抗体。这类情况通常会导致B220阳性与CD3阳性双阳性细胞，以及B220阳性B细胞和CD4阳性T细胞双阳性细胞的比例被高估。小鼠Peyer结的冰冻切片适用于组织病理学分析以及免疫标记。尽管石蜡切片在经苏木精和伊红（H&E）染色后可提供更高的细胞水平分辨率，但Peyer结生发中心的明区与暗区在冰冻切片中更易于区分。在此典型的Peyer结冰冻切片中，抗CD3抗体标记T细胞，抗CD11c抗体标记树突状细胞。标记树突状细胞和抗B细胞20抗体。在B细胞发育后标记B细胞。该技术为研究人员探索肠道相关淋巴组织中特定细胞类型（如树突状细胞）如何响应肠道抗原和微生物病原体奠定了基础。这些信息已影响了黏膜疫苗的设计与开发。

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科研

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Immunology and Infection

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