高分子基因传递纳米粒子的纳米粒子跟踪分析和高通量流式细胞仪评价
2013年3月1日
纳米粒子跟踪分析（NTA）和高通量流式细胞仪来评价聚合物纳米基因传递的协议。 NTA用于表征的纳米粒子的粒径分布和每个粒子分布的质粒。高通量的基因传递的生物材料库，流式细胞仪，定量的转染效率评价。
该程序的总体目标是使用非病毒聚合物纳米颗粒进行和评估基因递送实验。这是通过首先用基因递送颗粒横切细胞来实现的。然后通过显微镜和高通量流式细胞术分析评估转染效率。
接下来，使用纳米颗粒跟踪分析仪测定纳米颗粒尺寸分布、浓度和每个颗粒的质粒。最终，该方法允许使用纳米颗粒进行纳米颗粒粒度表征和转染效率。使用可生物降解的聚合物纳米颗粒进行基因递送的主要优点是它们比其他基因转移方法更安全、更有效。
与动态光散射等现有方法相比，纳米粒子跟踪分析的主要优势在于纳米粒子跟踪分析直接给出数量、平均分布和颗粒浓度。这种方法将有助于回答非病毒基因递送领域的关键问题，例如每个颗粒的质粒数量，这对于共表达研究很重要。使用人视网膜内皮细胞或 hre 作为模型细胞，使用聚 β 氨基酯或 PBA AE 作为模型聚合物来演示以下方案。
请注意，可能需要根据 24 小时前使用的细胞和聚合物调整培养条件和溶剂。转染。使用多通道移液器将 hre 接种到经过平坦处理的透明组织培养物中。底部 96 孔板，浓度为 25 至 50 个细胞/μL。
这将在转染当天提供 70% 至 80% 的共流度，准备并标记经过处理的透明非组织培养物。96 孔板用作母板，用于制备和稀释 PBA 和 DNA。将准备两个相同的盘子。
一个用于评估毒性，一个用于评估转染效率。在室温下遵循聚 β 氨基酯或 PVAE 聚合物和 P-E-G-F-P-N 1D NA 储备液。研磨后，使用 12 通道移液器在 25 毫摩尔乙酸钠缓冲液中制备一个含有 50 微升 0.06 毫克/毫升 DNA 的孔，用于每种条件。
接下来，在同一板上，用乙酸钠缓冲液将 PBAE 聚合物稀释至 10 毫克/毫升。然后进一步将 PBAE 聚合物稀释成 30 和 60 以及 50 μL 乙酸钠缓冲液的聚合物重量与 DNA 重量比。对于纳米颗粒的形成，使用 12 通道移液器将 50 微升稀释的 PBA 与 50 微升稀释的血浆 DNA 混合，通过上下移液剧烈混合。
然后让混合物在室温下孵育 10 分钟，以便自行组装。自组装后，使用 12 通道移液器将 20 微升纳米颗粒溶液滴加到含有培养基的接种细胞的每个孔中，每个条件转染四个孔，如下图所示。对于每个板，为每个阴性对照和阳性对照至少保留四个孔。
阴性对照由未处理的细胞和阳性对照组成，由用市售试剂（如 lipo 2000 或 Fuge hd）转染的细胞组成。将板与转染的细胞在 37 摄氏度下孵育 4 小时孵育孵育后，使用 12 通道移液器从细胞中去除培养基，并用每孔 100 μL 的新鲜 hre 替换。培养基再孵育 24 至 48 小时。
第二天，从培养箱中取出一块板。通过荧光显微镜评估细胞转染和毒性，并使用细胞滴度 96 水性 One 测定法定量细胞毒性，如随文所述。48 小时后，从培养箱中取出另一块板。
如随文所述，通过荧光、显微镜和流式细胞术评估转染效率。使用此处获得的毒性和转染数据来确定 PBA 的最佳浓度，以用于未来的实验。纳米位点 NS 500 是一种纳米粒子跟踪分析仪器，可以通过跟踪单个纳米粒子的扩散，然后在使用 0.5 毫升微量离心管中灌注纳米位点的流体系统之前，提供有关纳米颗粒样品粒度分布的信息。
像以前一样，以本视频上一节中使用的相同浓度制备用于分析的 PBA 和血浆 DNA。自组装后，在新的 1.5 毫升试管中将纳米颗粒溶液在 PBS 中稀释 100 倍，以获得至少 500 微升的最终体积。这将产生纳米颗粒浓度在纳米颗粒跟踪分析的适当范围内。
接下来，将样品加载到纳米位点。确保不要引入气泡，目视检查以确保屏幕上有 20 到 100 个颗粒。纳米粒子跟踪的理想数量约为 50 个粒子。
如果样品过多或过少，请冲洗 NS 500，将稀释度调整为 PBS 并重新加载样品。如果屏幕上的粒子数在 20 到 100 之间，则捕获视频。捕获视频后，通过在同一软件中打开视频文件进入处理阶段。
然后，一旦文件打开，增加屏幕增益。通过单击相应的框选择图像参数的自动调整。如果软件识别到屏幕上的粒子，则会用红叉标记它。
标记完所有粒子后，单击 处理 软件中的按钮处理视频文件。然后将显示颗粒粒径、分布粒径平均值和颗粒浓度，以验证颗粒计数是否准确。使用稀释 2 x 和 4 的相同样品重复此过程。
PBS apre 中的 Forex 用 E-G-F-P-P-B-A-E 纳米颗粒转染，如本视频所示。为了直观地评估转染效率，进行了荧光显微镜成像。这些图像显示了转染细胞的荧光明场和合并图像，如合并图像所示，大多数细胞表达 EGFP 并保持正常形态。
为了量化转染效率，在对活细胞群设门后进行流式细胞术，如图所示。未切除的群体不含 EGFP 阳性细胞。然而，71.6% 的处理细胞对 EGFP 纳米位点呈阳性，然后使用纳米颗粒跟踪分析来确定纳米颗粒尺寸分布和浓度。
对于此分析，粒度分布为单分散分布非常重要。利用此信息，可以通过将溶液中质粒的浓度除以 NS 500 确定的颗粒浓度来计算每个颗粒的平均质粒数。每个颗粒的质粒数量是反映粒径分布的分布。
在样品中，将存在每粒子质粒值大于平均值的较大颗粒，以及每粒子质粒值低于平均值的较小颗粒。在尝试此过程时，重要的是要记住，在将纳米颗粒添加到细胞中以使用 ncy 之前，不要让可降解聚合物在水性溶剂中停留太久，调整适合大小的稀释度。观看本视频后，您应该对如何使用非病毒基因递送聚合物转染贴壁细胞类型，以及测量转染功效以及粒径分布有很好的了解。
不要忘记，与人体细胞一起工作是有害的。执行此程序时，请始终佩戴个人防护设备并在生物安全柜中工作。
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概述
本文描述了一种评估非病毒聚合物纳米粒子基因递送的协议。该方法包括用基因递送粒子转染细胞，并通过显微镜和高通量流式细胞术评估转染效率。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因递送
- 纳米粒子技术
- 生物材料
背景
- 正在探索非病毒基因递送方法的安全性和有效性。
- 聚合物纳米粒子可以为基因转移提供一种生物降解选项。
- 纳米粒子的表征对于理解其递送能力至关重要。
- 高通量技术增强了对转染效率的评估。
研究目的
- 评估聚合物纳米粒子在基因递送中的有效性。
- 表征纳米粒子尺寸分布和质粒含量。
- 利用先进技术评估转染效率。
使用的方法
- 用聚合物基因递送纳米粒子转染细胞。
- 显微镜用于转染的视觉评估。
- 高通量流式细胞术用于定量分析。
- 纳米粒子跟踪分析用于尺寸和质粒分布。
主要结果
- 使用生物降解聚合物纳米粒子成功转染细胞。
- 实现了纳米粒子尺寸分布的表征。
- 在各种生物材料中评估了定量转染效率。
- 展示了使用聚合物纳米粒子进行基因递送的优势。
结论
- 聚合物纳米粒子是一种有前景的基因递送工具。
- 所描述的方法允许对纳米粒子性能进行全面评估。
- 进一步的研究可能增强基因转移技术的安全性和有效性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles using nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry addresses critical challenges in non-viral gene therapy development. This workflow enables precise characterization of particle size, plasmid loading, and transfection efficacy, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. The approach enhances portfolio decision-making by enabling scalable, quantitative assessment of novel delivery systems across diverse cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene delivery hypotheses using defined nanoparticle formulations.
- Supports mechanistic de-risking by correlating particle characteristics with functional transfection outcomes.
- Facilitates functional target validation through reproducible, high-content transfection data.
- Improves predictive confidence for advancing delivery platforms in the pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nanoparticle systems for high-throughput screening of transfection efficacy.
- Standardizes assay conditions using 96-well plate formats for reproducibility and scalability.
- Generates quantitative outputs on transfection and toxicity for reliable compound evaluation.
- Enables rapid comparison of polymeric carriers and cell types for platform optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nanoparticle characterization with disease-relevant cell models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by linking in vitro efficacy to preclinical model selection.
- Provides mechanistic insight into delivery efficiency and safety for preclinical de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting iterative optimization of gene delivery vehicles and their biological performance.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on nanoparticle-mediated gene transfer and pathway engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative transfection and toxicity data for candidate prioritization.
- Analytics: Provides particle size, concentration, and plasmid loading metrics for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical model selection when disease-relevant cells are used.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable workflow for evaluating diverse nanoparticle and cell type combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene delivery studies.
- Operational Value: Standardizes nanoparticle and transfection assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of delivery platforms and gene therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle formulation, cell culture, and flow cytometry analysis.
- Needs access to nanoparticle tracking instruments and high-throughput flow cytometry platforms.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various polymer chemistries and cell types with protocol adjustments.
- Careful handling of degradable polymers and human cells is necessary for data integrity and safety.
