利用定量实时 PCR 检测在竞争性小鼠骨髓移植模型中供体细胞的植入情况
2013年3月7日
在缺乏明确表型标志物的小鼠骨髓移植模型中，确定供体细胞植入情况具有挑战性。我们描述了一种定量分析雄性供体细胞在雌性移植受体小鼠中植入程度的方法。该方法适用于所有小鼠品系，可用于造血干细胞（HSC）功能的研究。
本实验的总体目标是采用基于 PCR 的技术，在竞争性小鼠骨髓移植模型中定量供体细胞的植入情况。该目标首先通过在雌性受体小鼠中移植雄性供体细胞完成骨髓移植来实现。随后在不同时间点采集受体小鼠的外周血，并提取基因组 DNA。接着为样品制备标准曲线。
最后，使用标准样品和待测样品进行实时 PCR。最终，通过与已知雄性与雌性 DNA 比例的标准曲线比对计算，可以获得结果，显示雄性供体来源的细胞在雌性受体小鼠中的植入情况。该技术相较于现有的流式细胞术等方法的优势在于，其灵敏度更高、成本更低，且样品可长期保存。
最重要的是，我们的技术具有高度的遗传背景无关性，可用于任何基因型的小鼠，例如利用明确的细胞表面标志物来区分供体细胞与受体细胞。在层流罩内处死FVB/nJ品系的雄性供体小鼠和雌性小鼠后，使用小型剪刀和镊子分离出股骨和胫骨，并将其置于含有6毫升冰上预冷的含5%热灭活FBS的RPMI 1640培养基的60毫米组织培养皿中。用Kimwipe纸巾去除肌肉及其他组织，然后在培养皿中将每根骨两端切断。接着，将骨的两端连接至装有含5%热灭活FBS的RPMI 1640培养基的3毫升注射器（连接23号针头）上，冲洗出骨髓。
使用同一根针头通过反复吹打来解离骨髓组织。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在400 ×g条件下离心5分钟。去除上清液后，将细胞重悬于1毫升室温的红细胞裂解缓冲液中，室温孵育5分钟，随后加入5至10毫升含5%热灭活FBS的RPMI 1640培养基，将细胞悬液通过细胞筛滤器，收集滤过液至新的离心管中。再次在400 ×g条件下离心5分钟并去除上清液，此时沉淀应无红色，表明红细胞已完全去除。将细胞沉淀重悬于10毫升含5%热灭活FBS的RPMI 1640培养基中，轻轻涡旋混匀后，取少量细胞悬液加入血细胞计数板进行细胞计数。
计算用于与竞争性雌性细胞以5:2比例混合进行骨髓移植的细胞体积。在细胞注射前的最后一步，将供体细胞与竞争性细胞混合，离心沉淀细胞，用PBS洗涤，并重悬于PBS中，最终浓度为每毫升5×10⁶个供体细胞和每毫升2×10⁶个竞争性细胞，在骨髓移植前4至6小时完成。使用铯-137 γ射线对雌性受体小鼠进行单次11 Gy剂量的照射。
将照射后的雌性小鼠放入小鼠固定器中，通过尾静脉注射混合的供体细胞和竞争细胞，总体积为 0.1 毫升，使每只小鼠接受 5 × 10⁵ 个供体细胞和 2 × 10⁵ 个竞争性骨髓细胞，用于采集血样。麻醉后，通过眶后静脉丛采血，将约 50 微升血液收集至 EDTA 包被的采血管中。同时采集年龄相匹配的雄性和雌性小鼠的样本。
接下来从实验小鼠和小鼠中分离基因组DNA。对于标准曲线，向每份血液样本中加入约200微升室温的红细胞裂解缓冲液，孵育5分钟。加入1毫升PBS，离心以去除大部分裂解的红细胞。
然后使用血液DNA提取试剂盒提取DNA，并将洗脱缓冲液预热至37摄氏度。为提高得率，测定每个样本的DNA浓度。OD260/280比值在1.8至2.0之间的样本用于后续分析。
为建立标准曲线，将男性和女性的DNA稀释至每微升4纳克的浓度，并根据以下指南配制DNA混合物。通过将Cyber Green Super Mix试剂与所示引物及基因组DNA混合，设置PCR反应板。每个20微升的反应体系包含每种引物400纳摩尔以及5微升血液细胞基因组DNA，每样本设三个复孔。
根据文本方案中提供的条件进行PCR，并获得循环阈值（CT值）。计算ΔCT，即CT的ZY1次方减去CT的BCL2次方，然后计算ZY1的表达水平，即2的负ΔCT次方。通过将三个重复样本的2的ΔCT次方的平均值对混合物中已知的男性DNA百分比作图，并进行线性回归拟合，生成标准曲线。以下是将2的ΔCT次方的平均值对男性DNA百分比作图所得的标准曲线示例。
该图显示了 BCL2 和 ZFY1 扩增片段的特异性熔解温度，分别位于 78.5 和 88.5 摄氏度。BCL2 作为参考基因，用于标准化每次 PCR 反应中上样 DNA 的总量。各标准样品的 BCL2 扩增曲线相互重合，不受男性 DNA 浓度影响，表明上样 DNA 量相等。
然而，随着样本中雄性DNA含量的增加，ZFY基因的扩增曲线向左迁移。来自PIM三敲除（TKO）小鼠的造血干细胞在重建致死性照射小鼠方面存在缺陷，与移植野生型细胞的小鼠相比，移植PIM TKO细胞的受体小鼠体内雄性细胞的比例显著降低，这与预期结果一致。为了验证我们的方法，我们检测了雄性供体细胞在移植后雌性小鼠体内的植入情况，这些雌性小鼠分别接受了来自野生型小鼠与PIM三敲除（TKO）小鼠的骨髓细胞，并在移植后的不同时间点进行分析：移植后6周采集外周血，16周采集骨髓样本。观看本视频后，对这些样本进行了分析。
应充分了解如何在竞争性小鼠骨髓移植模型中采用基于PCR的方法来定量供体细胞的植入情况。
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概述
本研究介绍了一种基于PCR的方法，用于定量雌性小鼠在接受骨髓移植后供体雄性细胞的植入情况。该技术具有高灵敏度、经济性，并适用于多种小鼠品系。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 移植生物学
背景
- 在小鼠模型中，供体细胞植入的定量具有挑战性。
- 现有方法可能缺乏灵敏度，或需要特定标记物。
- 实时 PCR 为定量提供了可靠的替代方案。
- 该方法可应用于多种基因组背景。
研究目的
- 建立一种可靠的供体细胞植入率定量方法。
- 相较于流式细胞术，提高检测灵敏度并降低经济成本。
- 在不同小鼠品系中验证该方法的有效性。
使用的方法
- 使用雄性供体细胞对雌性小鼠进行骨髓移植。
- 采集外周血并分离基因组DNA。
- 制备PCR分析用标准曲线。
- 采用实时PCR定量雄性供体来源细胞。
主要结果
- 该方法成功量化了雌性受体中雄性细胞的移植水平。
- 结果表明，与传统方法相比，该技术具有更高的灵敏度。
- 建立了标准曲线，以关联DNA浓度与移植水平。
- 该技术已在不同小鼠品系中得到验证。
结论
- 基于PCR的方法可有效定量供体细胞的植入情况。
- 该方法可促进造血干细胞功能相关研究。
- 它为移植生物学领域的研究人员提供了一种多功能工具。
常见问题
行业重要性概述
在小鼠骨髓移植模型中，用于供体细胞植入检测的定量实时PCR技术满足了对敏感、不依赖标记物的造血干细胞功能检测的关键需求。该方法能够在早期发现和临床前研究中实现可靠的靶点验证和机制性风险降低，尤其适用于传统流式细胞术因品系特异性标记物受限而难以开展的情况。该技术可提高预测可信度，支持在造血及基因治疗研发管线中进行基于风险评估的项目组合决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在不同遗传背景下对造血干细胞植入进行定量评估。
- 支持对调控造血干细胞生物学功能的候选基因或分子进行功能验证。
- 通过直接测量供体细胞的贡献，促进机制层面的风险降低。
- 提高在造血研究项目中推进靶点的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供一种标准化、可重复的检测方法，用于测量供体细胞植入，无需依赖细胞表面标志物。
- 支持在多种小鼠品系和遗传模型中实现检测的可扩展性及平台重复使用。
- 提供适用于遗传修饰或治疗干预的比较分析和筛选的定量结果。
- 与基于流式细胞术的方法相比，降低了操作复杂性和成本。
转化与临床前研究
- 与疾病相关模型相一致，可用于评估造血重建和基因治疗的疗效。
- 通过实现一致的植入率测量，确保从发现到临床前验证的连续性。
- 基于定量且可重复的数据，支持经风险调整的推进决策。
- 促进造血细胞治疗的转化生物标志物开发。
流程与工作流整合
这种基于 PCR 的移植量化方法可融入从发现到临床前研究的连续流程中，支持在造血和基因治疗研发管线中进行早期假设验证、候选分子确证以及转化医学研究。
- 发现生物学：通过在竞争性移植模型中量化供体细胞的贡献，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供具备检测就绪性和可重复性的实验方案，用于评估基因或药物干预效果。
- 分析：提供基于定量测量和标准曲线的输出结果，支持稳健的统计学比较。
- 转化研究：在造血重建研究中实现临床前研究的连续性以及生物标志物的一致性。
- 企业级复用：提供一种广泛适用、不依赖标记物的技术能力，适用于多种小鼠模型。
运营与企业影响
- 科学价值：提高造血干细胞功能研究的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：标准化移植效率的测量，增强实验可重复性，并降低设备成本。
- 战略价值：通过提供可靠且定量的数据，优化决策流程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的优先排序，推动造血及基因治疗项目的进展。
实施注意事项
- 需要具备定量 PCR 和基因组 DNA 提取方面的专业知识。
- 需要能够使用实时 PCR 仪器以及经过验证的引物组合。
- 要求不同团队之间在样本制备和数据分析方案上实现标准化。
- 可适用于缺乏特定表面标志物的小鼠品系和遗传背景。
- 依赖于准确的标准曲线生成和归一化对照。
