Name: 采用实时定量PCR检测供体细胞植入一个具有竞争力的小鼠骨髓移植模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学习使用实时定量PCR技术在小鼠骨髓移植模型中定量检测供体细胞植入水平的方法。该技术具有高灵敏度、经济实用且适用于不同遗传背景小鼠的优势，为造血干细胞功能研究提供了可靠工具。

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感谢 Charles Greenberg 博士提供实时 PCR 仪的使用。本工作由南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心启动基金、霍林斯癌症中心美国癌症学会独立研究资助、ASCO 征服癌症基金会职业发展奖、NIH 1K08HL 103780-01A1 和 NIH 3P30CA138313-01S3 资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院或其他资助机构的官方观点。

1. 骨髓细胞分离
<ol>
	<li>使用 CO2 法处死雄性供体 FVB/NJ 小鼠和雌性 FVB/NJ 小鼠，随后进行颈椎脱位。雌性 FVB/NJ 小鼠的骨髓细胞将用作竞争性细胞。</li>
	<li>使用小型剪刀和镊子从小鼠体内分离股骨和胫骨，并将其置于含有 6 ml 冰冷 RPMI1640 培养基（含 5% 热灭活 FBS）的 60 mm 组织培养皿中。用纸巾擦除肌肉和其他组织，并在培养皿中将每根骨两端剪断。</li>
	<li>将 3 ml 注射器上安装 23G 针头，针头插入骨端，用含 5% 热灭活 FBS 的 RPMI1640 冲洗骨髓至培养皿中。用同一针头反复吹打，使骨髓组织充分分散。将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。</li>
	<li>以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，加入 1 ml 室温红细胞裂解缓冲液（155 mM 碳酸氢钾、10 mM 氯化铵、0.1 mM EDTA，pH = 7.4），室温孵育 5 分钟，然后加入 5–10 ml 含 5% 热灭活 FBS 的 RPMI1640 培养基。</li>
	<li>将细胞悬液过细胞滤器，收集滤过液至新管中。以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清；细胞沉淀中不应残留红色。无红色表明红细胞已完全去除。将细胞沉淀重悬于 10 ml 含 5% 热灭活 FBS 的 RPMI1640 培养基中，轻轻涡旋以确保细胞悬液均匀。取适量样品，用血细胞计数板计数细胞。根据骨髓移植所需量计算所需细胞体积，分装足够数量的细胞，并按 5:2 的比例混合雄性供体细胞与竞争性雌性细胞。以 400 × g 离心 5 分钟，用 PBS 洗涤，最后重悬于 PBS 中，使供体细胞终浓度为 5×106/ml，竞争性细胞终浓度为 2×106/ml。</li>
</ol>
2. 竞争性骨髓移植
<ol>
	<li>在骨髓移植前4-6小时，使用137Cs γ射线照射器对雌性受体小鼠（8-12周龄）进行单次11 Gy剂量的照射。</li>
	<li>将经照射的雌性小鼠放入小鼠固定器中，通过尾静脉注射0.1 ml总体积的混合供体细胞和竞争细胞，使每只小鼠接受5×105个供体细胞和2×105个竞争性骨髓细胞。</li>
</ol>
3. 样本采集
在骨髓移植后数周，于麻醉条件下通过小鼠眼后静脉采集体积约为 50 μl 的雌性受体小鼠外周血样本。样本收集至含 EDTA 涂层的采血管中。通常在实验结束时（移植后至少 4 个月）也可采用与前述相同的方法（步骤 1）收集骨髓样本；通常取单侧胫骨骨髓细胞的 20–40% 即可获得足量 DNA。同时采集年龄匹配的正常雌性和雄性小鼠的血液或骨髓样本，用于制备标准曲线。
4. 基因组DNA提取
<ol>
	<li>加入4&times; 室温红细胞裂解缓冲液体积（约 200 &mu;l) 向每份血液样本中加入适量溶液，充分混匀，在室温下孵育5分钟。加入1 ml PBS，然后离心以去除大部分裂解的红细胞。</li>
	<li>使用血液DNA提取试剂盒（QIAmp DNA Blood extraction kit）提取DNA。将洗脱缓冲液（AE）在37℃预热。 &deg;C以提高洗脱DNA的产量。标准曲线所用的雄性和雌性DNA以相同方法进行分离。</li>
	<li>（可选）在存在 3 M 醋酸钠（pH=5.5）的条件下，可采用乙醇沉淀法进一步纯化或浓缩基因组 DNA。随后将 DNA 沉淀重悬于 40–50 &mu;l 用于分析的蒸馏水，立即使用或于 -20℃ 保存 &deg;用于将来使用。</li>
	<li>使用 Nanodrop ND-1000 分光光度计测定 DNA 浓度。OD 260/280 在 1.8–2.0 之间的样品用于后续分析。</li>
	<li>用无DNA酶的H稀释DNA20 至 4 ng/&mu;l，总体积为50 &mu;l.</li>
</ol>
5. 标准曲线制备
将雄性DNA和雌性DNA稀释至浓度为4 ng/μl，并根据表1配制DNA混合物
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>女性背景中男性DNA的百分比</td>
			<td>4ng/μl 男性DNA体积（μl）</td>
			<td>4ng/μl 女性DNA体积（μl）</td>
			<td>总体积（μl）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>1</td>
			<td>499</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
			<td>199</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>195</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>175</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>87.5</td>
			<td>175</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>0</td>
			<td>200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 标准曲线的样品制备。处死8-12周龄的正常雄性和雌性FVB/NJ小鼠，收集血液和骨髓细胞。分别提取雄性和雌性细胞的DNA，并重悬于浓度为4 ng/μL的溶液中。将雄性和雌性DNA以不同比例混合，制备DNA标准样品混合物。
6. 实时荧光定量 PCR
<ol>
	<li>通过将SYBR Green supermix试剂与引物和基因组DNA混合来设置PCR反应板。每个反应的总体积为20 μl，包含每种引物各400 nM，以及5 μl血液细胞基因组DNA（4 ng/μl × 5 μl = 20 ng）。DNA样本和标准品均设置三个重复。引物序列见表2。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>基因名称</td>
			<td>正向引物</td>
			<td>反向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl2</td>
			<td>5′-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA</td>
			<td>5′- CAGGCTGGAAGGAGAAGATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zfy1</td>
			<td>5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA</td>
			<td>5'- CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 小鼠 Bcl2 和 Zfy1 的 RT-PCR 引物序列。
<ol start="2">
	<li>使用 Biorad iQ5 PCR 仪进行 PCR 反应，反应条件如下：95 °C 预变性 3 分钟，随后进行 42 个扩增循环（95 °C 变性 10 秒，58 °C 退火 25 秒，72 °C 延伸 15 秒），最后进行熔解曲线分析。</li>
	<li>通过 Bio-Rad iQ5 2.1 标准版光学系统获取循环阈值（Ct）值。计算 δCt 值（CtZfy1 - CtBcl2），Zfy1 的表达水平以 2-δCt 的数值表示。</li>
	<li>利用已知性别比例的男性/女性标准混合样本的 2-δCt 读数，为每组反应建立标准曲线。标准曲线通过将三个重复样本的 2-δCt 值的平均值对混合物中已知的男性 DNA 百分比作图，并采用线性回归拟合生成。</li>
</ol>

<ol><li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%2C+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li>
<li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316(2010).</li>
<li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li>
<li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FVB%2FN%3A+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li>
<li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li>
<li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum%3A+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li>
<li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894(2008).</li>
<li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li>
<li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li>
<li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+%28Zfy-1+and+Zfy-2%29+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes & development. 4, 63-74 (1990).</li>
<li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+PIM+serine%2Fthreonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li>
</ol>

我们没有需要披露的竞争性财务利益。

本研究的目的是向读者提供一种基于PCR的技术，用于在竞争性小鼠骨髓移植模型中定量供体细胞的植入情况。已有若干研究报道使用RT-PCR在移植模型中检测供体细胞9-10。Schwarzenberger博士的研究团队首次建立了一种利用实时PCR扩增Y染色体特异性序列的小鼠骨髓移植模型8。该方法曾被用于研究Gli-1在造血干细胞活性中的功能11。随后，我们对该方案进行了进一步优化，并以可视化形式提供了详细、分步的实验操作流程。本方案的可视化呈现有助于读者更轻松地遵循操作步骤。我们还比较了使用骨髓样本基因组DNA与外周血DNA所得的PCR结果。骨髓样本与血液样本的供体植入数据基本一致，但通常骨髓样本中的变异较小。这可能是由于外周血红细胞裂解后残留的血红蛋白影响了血液样本中基因组DNA的纯度或质量所致。
我们基于 PCR 的技术在定量供体细胞植入方面具有多个优势。首先，该技术可在大多数实验室中开展，除实时荧光定量 PCR 仪外，无需其他特殊且昂贵的设备。我们进一步优化了 PCR 反应体系，采用 SYBR Green 超级混合液替...

小鼠骨髓（BM）移植模型最早于20世纪60年代建立1。该模型被广泛用于研究供体造血干细胞（HSC）在受体小鼠体内的生物学特性。小鼠骨髓移植模型为我们提供了关于HSC功能及其调控机制的宝贵知识，在HSC研究中具有不可替代的作用。许多实验室采用同种异体骨髓移植模型（如C57Bl/6JH2b-Balb/CH2d）或同源移植模型（如C57Bl/6JCD45.2-B6.SJLCD45.1），用于研究基因对HSC活性的功能影响2、药物处理对HSC功能的作用3，以及移植物抗宿主病（GvHD）等与移植相关的疾病4。
细胞表面标志物（如MHC单倍型或CD45.1）常用于区分供体来源的细胞与受体来源的细胞。C57Bl/6JH2b, CD45.2、Balb/CH2d 和 B6.SJLCD45.1 是骨髓移植中最常用的小鼠品系，因为可通过流式细胞术检测CD45.1 vs. CD45.2 或 H2b vs. H2d 来轻松评估供体细胞的贡献。然而，其他许多品系（如FVB/NJ5 和 C3H）也常用于构建基因工程转基因或基因敲除小鼠。这些小鼠可能被回交至近交系，并维持在混合的遗传背景/MHC背景下。在此类情况下，由于可能缺乏供体特异性的细胞表面标志物，确定供体细胞的植入情况及造血干细胞（HSC）功能可能会较为困难。
利用Y染色体特异性DNA探针通过Southern印迹法在性别不匹配的骨髓移植中检测供体雄性细胞，最初由Miwa博士的研究团队建立6。随后，针对Y染色体性别决定区的实时PCR被发现是一种准确且高特异性的方法，可用于定量母体血液系统中的雄性胎儿细胞7。Schwarzenberger博士的研究团队将此概念应用于小鼠骨髓移植模型，开发出一种实时PCR技术以测定供体细胞的植入情况8。我们进一步改进了该方法，用于FVB/NJ小鼠骨髓移植模型中供体细胞植入的检测。目前，本课题组广泛采用该方法研究Pim1激酶在造血干细胞生物学中的作用。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30255.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>16140-017</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>MP Biomedicaals</td><td>194806</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾</td><td>Fisher</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网</td><td>BD bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green 超级混合液</td><td>Biorad</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>iQ5 实时 PCR 仪</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Nanodrop ND-1000</td><td>ND-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

利用定量实时 pcr 检测在竞争性小鼠骨髓移植模型中供体细胞的植入情况

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

小鼠骨髓移植模型是评估造血干细胞（HSC）功能以及鉴定调控HSC的基因/分子的重要工具。在这些移植模型系统中，HSC的功能通过其细胞植入并重建经致死剂量照射的受体小鼠的能力来确定。通常，通过流式细胞术使用针对供体特异性细胞表面蛋白的抗体来检测供体细胞的贡献/植入情况。然而，该方法高度依赖于细胞表面标志物的特异性及其区分供体来源细胞与受体来源细胞的能力，而这类标志物并非在所有小鼠品系中都可用。考虑到市场上存在的多种遗传修饰小鼠品系背景，这种基于细胞表面标志物/流式细胞术的方法在缺乏明确表面标志物以区分供体细胞与同源受体细胞的小鼠品系中存在显著局限性。本文报道了一种基于PCR的技术，用于测定移植受体小鼠中供体细胞的植入/贡献情况。我们将雄性供体骨髓HSC移植至经致死剂量照射的同源雌性小鼠体内。在移植后不同时间点采集外周血样本，实验结束时获取骨髓样本。提取基因组DNA，并利用定量实时PCR扩增Y染色体特异性基因Zfy1。通过已知雄性细胞比例的标准曲线，计算雌性受体小鼠中雄性供体来源细胞的植入水平。 与 女性DNA。以Bcl2作为参考基因以标准化总DNA量。我们的数据表明，该方法可可靠地测定供体细胞的植入情况，为评估小鼠骨髓移植模型中造血细胞重建提供了一种简便且实用的检测手段。由于无需流式细胞术等昂贵设备，本方法可在大多数实验室常规开展。

图1和图2 展示了使用2的平均值绘制的标准曲线示例-δCt 针对男性DNA百分比。 图1A 显示 Bcl2 和 Zfy1 扩增子的特异性熔解温度，定位于 78.5 °C 和 88.5 °C，分别。Bcl2 用作参考基因，以标准化每次 PCR 反应中上样 DNA 的总量。各标准样品的 Bcl2 扩增曲线（对数视图）相互重合，不受男性 DNA 浓度影响，表明上样 DNA 量相等图1B）。然而，随着样本中雄性DNA含量的增加，Zfy1扩增曲线向左迁移（图1C）。为了验证我们的方法，我们检测了接受来自野生型（WT）小鼠骨髓细胞移植的小鼠体内雄性供体细胞的植入情况 与 Pim 三重敲除（TKO）小鼠在移植后不同时间点的分析。分别对移植后6周的外周血和16周的骨髓样本进行了检测。Pim TKO小鼠的造血干细胞在重建经致死剂量辐照的小鼠过程中存在缺陷（An, N 等，稿件正在修订中）。与移植了野生型（WT）细胞的小鼠相比，移植了Pim三重敲除（TKO）细胞的受...

在缺乏明确表型标志物的小鼠骨髓移植模型中，确定供体细胞植入情况具有挑战性。我们描述了一种定量分析雄性供体细胞在雌性移植受体小鼠中植入程度的方法。该方法适用于所有小鼠品系，可用于造血干细胞（HSC）功能的研究。

利用定量实时 PCR 检测在竞争性小鼠骨髓移植模型中供体细胞的植入情况

小鼠骨髓移植模型是评估造血干细胞（HSC）功能以及确定基因/分子作用的重要工具……

本实验的总体目标是采用基于 PCR 的技术，在竞争性小鼠骨髓移植模型中定量供体细胞的植入情况。该目标首先通过在雌性受体小鼠中移植雄性供体细胞完成骨髓移植来实现。随后在不同时间点采集受体小鼠的外周血，并提取基因组 DNA。接着为样品制备标准曲线。最后，使用标准样品和待测样品进行实时 PCR。最终，通过与已知雄性与雌性 DNA 比例的标准曲线比对计算，可以获得结果，显示雄性供体来源的细胞在雌性受体小鼠中的植入情况。该技术相较于现有的流式细胞术等方法的优势在于，其灵敏度更高、成本更低，且样品可长期保存。最重要的是，我们的技术具有高度的遗传背景无关性，可用于任何基因型的小鼠，例如利用明确的细胞表面标志物来区分供体细胞与受体细胞。在层流罩内处死FVB/nJ品系的雄性供体小鼠和雌性小鼠后，使用小型剪刀和镊子分离出股骨和胫骨，并将其置于含有6毫升冰上预冷的含5%热灭活FBS的RPMI 1640培养基的60毫米组织培养皿中。用Kimwipe纸巾去除肌肉及其他组织，然后在培养皿中将每根骨两端切断。接着，将骨的两端连接至装有含5%热灭活FBS的RPMI 1640培养基的3毫升注射器（连接23号针头）上，冲洗出骨髓。使用同一根针头通过反复吹打来解离骨髓组织。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在400 ×g条件下离心5分钟。去除上清液后，将细胞重悬于1毫升室温的红细胞裂解缓冲液中，室温孵育5分钟，随后加入5至10毫升含5%热灭活FBS的RPMI 1640培养基，将细胞悬液通过细胞筛滤器，收集滤过液至新的离心管中。再次在400 ×g条件下离心5分钟并去除上清液，此时沉淀应无红色，表明红细胞已完全去除。将细胞沉淀重悬于10毫升含5%热灭活FBS的RPMI 1640培养基中，轻轻涡旋混匀后，取少量细胞悬液加入血细胞计数板进行细胞计数。计算用于与竞争性雌性细胞以5:2比例混合进行骨髓移植的细胞体积。在细胞注射前的最后一步，将供体细胞与竞争性细胞混合，离心沉淀细胞，用PBS洗涤，并重悬于PBS中，最终浓度为每毫升5×10⁶个供体细胞和每毫升2×10⁶个竞争性细胞，在骨髓移植前4至6小时完成。使用铯-137 γ射线对雌性受体小鼠进行单次11 Gy剂量的照射。将照射后的雌性小鼠放入小鼠固定器中，通过尾静脉注射混合的供体细胞和竞争细胞，总体积为 0.1 毫升，使每只小鼠接受 5 × 10⁵ 个供体细胞和 2 × 10⁵ 个竞争性骨髓细胞，用于采集血样。麻醉后，通过眶后静脉丛采血，将约 50 微升血液收集至 EDTA 包被的采血管中。同时采集年龄相匹配的雄性和雌性小鼠的样本。接下来从实验小鼠和小鼠中分离基因组DNA。对于标准曲线，向每份血液样本中加入约200微升室温的红细胞裂解缓冲液，孵育5分钟。加入1毫升PBS，离心以去除大部分裂解的红细胞。然后使用血液DNA提取试剂盒提取DNA，并将洗脱缓冲液预热至37摄氏度。为提高得率，测定每个样本的DNA浓度。OD260/280比值在1.8至2.0之间的样本用于后续分析。为建立标准曲线，将男性和女性的DNA稀释至每微升4纳克的浓度，并根据以下指南配制DNA混合物。通过将Cyber Green Super Mix试剂与所示引物及基因组DNA混合，设置PCR反应板。每个20微升的反应体系包含每种引物400纳摩尔以及5微升血液细胞基因组DNA，每样本设三个复孔。根据文本方案中提供的条件进行PCR，并获得循环阈值（CT值）。计算ΔCT，即CT的ZY1次方减去CT的BCL2次方，然后计算ZY1的表达水平，即2的负ΔCT次方。通过将三个重复样本的2的ΔCT次方的平均值对混合物中已知的男性DNA百分比作图，并进行线性回归拟合，生成标准曲线。以下是将2的ΔCT次方的平均值对男性DNA百分比作图所得的标准曲线示例。该图显示了 BCL2 和 ZFY1 扩增片段的特异性熔解温度，分别位于 78.5 和 88.5 摄氏度。BCL2 作为参考基因，用于标准化每次 PCR 反应中上样 DNA 的总量。各标准样品的 BCL2 扩增曲线相互重合，不受男性 DNA 浓度影响，表明上样 DNA 量相等。然而，随着样本中雄性DNA含量的增加，ZFY基因的扩增曲线向左迁移。来自PIM三敲除（TKO）小鼠的造血干细胞在重建致死性照射小鼠方面存在缺陷，与移植野生型细胞的小鼠相比，移植PIM TKO细胞的受体小鼠体内雄性细胞的比例显著降低，这与预期结果一致。为了验证我们的方法，我们检测了雄性供体细胞在移植后雌性小鼠体内的植入情况，这些雌性小鼠分别接受了来自野生型小鼠与PIM三敲除（TKO）小鼠的骨髓细胞，并在移植后的不同时间点进行分析：移植后6周采集外周血，16周采集骨髓样本。观看本视频后，对这些样本进行了分析。应充分了解如何在竞争性小鼠骨髓移植模型中采用基于PCR的方法来定量供体细胞的植入情况。

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医学

采用实时定量PCR检测供体细胞植入一个具有竞争力的小鼠骨髓移植模型

小鼠骨髓移植是一种广泛使用的技术，用于研究调控人类移植物抗宿主病的免疫学机制。体内监测T细胞迁移模式的能力，使得能够对移植物抗宿主病过程中T细胞反应的发生与发展进行详细分析。...

移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

骨髓移植提供了一种改变骨髓来源细胞基因型的方法。如果目的基因在骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中均有表达，骨髓移植可以在不改变非骨髓来源细胞基因型的情况下，将骨髓来源细胞的基因型转变为另一种基因型。...

通过骨髓移植区分免疫细胞与非免疫细胞中基因表达在小鼠结肠炎中的功能作用

本视频展示了如何利用同种异体造血干细胞和可诱导移植物抗宿主病（GvHD）的脾源性异反应性T淋巴细胞，在经致死剂量照射的受体小鼠中诱导肠道移植物抗宿主病。该实验方案有助于建立严重的急性肠道GvHD模型，以深入理解该疾病的发病机制，并开发创新的治疗策略。...

通过同种异体骨髓与脾细胞移植在小鼠模型中诱导移植物抗宿主病

复杂的组织团块，从器官到肿瘤，均由多种细胞成分构成。我们利用多重荧光标记的转基因小鼠，结合多参数免疫荧光染色及光谱解混技术，解析了组织内不同细胞表型的贡献，从而根据蛋白质表达情况确定细胞来源及其特性。...

荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

我们提出了一种基于逆转录病毒的单个T细胞受体（TCR）快速且灵活的实验方案 体内 表达系统。逆转录病毒载体用于转导骨髓前体细胞，以研究单个TCR的T细胞发育与功能 体内...

逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成T细胞受体逆转录转基因小鼠

通过颅骨的活体荧光显微镜（IVFM）结合遗传性动物模型，用于研究造血细胞归巢并植入骨髓（BM）微环境的过程。...

结合活体荧光显微镜（IVFM）与遗传模型研究造血细胞向骨髓微环境植入的动态过程

本方案提供了建立竞争性小鼠骨髓移植实验的逐步指南，用于研究造血干细胞/祖细胞功能，而无需通过细胞分选对干细胞进行预先纯化。...

竞争性移植评估造血干细胞适应性

本文描述了建立转导-移植小鼠模型所使用的方法学。详细阐述了进行骨髓移植时应避免的技术性错误。读者应清楚理解高病毒滴度、转染/转导以及照射的重要性。...

骨髓增殖性肿瘤的转导-移植小鼠模型

本文介绍了一种在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中诱导并评估疾病发生的方法。xenoGVHD...

异基因小鼠模型中移植物抗宿主病的诱导与评分及使用数字PCR定量小鼠组织中的人源T细胞

我们描述了三种骨髓移植（BMT）方法：全身照射骨髓移植、屏蔽照射骨髓移植以及无预处理的骨髓移植方法（过继性BMT），用于小鼠模型中克隆性造血的研究。...

小鼠骨髓移植操作用于克隆性造血研究

本方案描述了在小鼠异种移植模型中向股骨内注射少量造血干细胞或白血病干细胞（包括基因编辑细胞）的方法，该方法不仅能够实现细胞的快速安全移植，还可进行骨髓的系列分析。...

利用活体小鼠进行简化的股骨内注射以实现连续骨髓分析

学习使用实时定量PCR技术在小鼠骨髓移植模型中定量检测供体细胞植入水平的方法。该技术具有高灵敏度、经济实用且适用于不同遗传背景小鼠的优势，为造血干细胞功能研究提供了可靠工具。

利用定量实时 PCR 检测在竞争性小鼠骨髓移植模型中供体细胞的植入情况

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