Name: 高分辨率基因表达谱RNA的合成，加工和衰变的新转录RNA在细胞培养的代谢标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习使用4-硫尿苷代谢标记技术分离真核细胞培养中的新转录RNA，通过硫醇特异性生物素化和链霉亲和素磁珠捕获，实现RNA合成、加工和降解动力学的高灵敏度检测，为基因表达调控机制研究提供精确方法。

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我们感谢Amie Regan对稿件的仔细审阅。本工作获得了NGFN Plus基金项目#01GS0801、MRC研究员基金项目G1002523、NHSBT基金项目WP11-05（授予L.D.）以及DFG基金项目FR2938/1-1（授予C.C.F.）的支持。

1. 使用4-硫代尿苷进行代谢标记
制定详细的实验设置/时间安排计划，例如何时向细胞培养物中添加4sU，以及何时收集样品。每种处理条件之间至少预留5分钟。每次仅处理一种条件的细胞。每次操作最多处理3至5个培养皿。尽可能快速地操作细胞，以尽量减少温度和CO2水平的变化。在加入4sU后，避免将细胞暴露于强光下，因为这可能导致4sU标记的RNA与细胞内蛋白质发生交联。
标记开始
<ol>
	<li>使用前将4-硫代尿苷（4sU）解冻，并将各实验条件下所需的4sU体积移取至无菌Falcon管中。</li>
	<li>从培养皿中取出所需体积的细胞培养基（每10 cm培养皿5 ml），加入含4sU的Falcon管中，充分混匀；随后移除并弃去培养皿中剩余的培养基。</li>
	<li>将含4sU的培养基重新加入培养皿中。</li>
</ol>
标记结束
<ol start="4">
	<li>从细胞中移除细胞培养基。向每块培养板中加入 5 ml Trizol。对于包含多个时间点或条件的复杂实验，此步骤最好由两人协作完成：一人负责移除培养基，另一人负责添加 Trizol 并收集裂解液。</li>
	<li>室温孵育 5 分钟，以确保细胞完全裂解。</li>
	<li>使用 10 ml 移液管用已加入的 Trizol 轻柔冲洗培养板。此操作有助于实现完全的细胞裂解和样本回收。操作时需格外小心，因为 Trizol 接触皮肤或眼睛时具有极高危险性！应备有酚灼伤的解毒剂（例如 工业甲基化酒精中含 70:30 的聚乙二醇 300 或 400）。将样本转移至聚丙烯管中。（请注意，标准 Falcon 管无法耐受如此高的离心力。）样本可在 -20 °C 下保存至少一个月，直至进行总 RNA 提取。</li>
</ol>
2. 使用改良Trizol法进行RNA制备
<ol>
	<li>加入1 ml氯仿（每毫升Trizol加0.2 ml），剧烈振荡15秒。室温孵育2–3分钟。</li>
	<li>4 °C 条件下，以 13,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将含有RNA的水相上层转移至新的15 ml聚丙烯管中。</li>
	<li>加入等体积的RNA沉淀缓冲液和异丙醇，总体积为反应体积的½（例如 向3 ml上清液中加入1.5 ml RNA沉淀缓冲液和1.5 ml异丙醇。</li>
	<li>充分混匀。室温孵育10分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>短暂离心（5,000 × g，30 秒），用 200 μl 移液器去除残留的异丙醇。</li>
	<li>加入等体积的75%乙醇，振荡试管直至沉淀物脱落。避免将沉淀物打碎成许多小块，以免难以去除残留乙醇。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 13,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>短暂离心RNA样品，用200 μl移液器去除残留乙醇。重复该步骤，用20 μl移液器去除残留乙醇。完成上述两步后，切勿进一步干燥沉淀。</li>
	<li>加入 100 μl 的 H2每100 μg预期RNA产量，用移液器上下吹打5–6次，充分混匀以促进RNA溶解。</li>
	<li>65 °C 加热 10 分钟（振荡器）使 RNA 溶解并变性，立即置于冰上。</li>
	<li>使用NanoDrop分光光度计，按照制造商说明书在260 nm处测定RNA浓度。该RNA可在-80 °C保存至少一个月。</li>
</ol>
3. 新转录RNA的巯基特异性生物素标记
<ol>
	<li>从60 - 80 μg总细胞RNA开始。</li>
	<li>配制标记反应液。按以下顺序移取（每μg RNA）：
	<ol class="lalpha">
		<li>1 μl 10x 生物素标记缓冲液</li>
		<li>7 μl RNA（含1 μg RNA，用无核酸酶的H2O稀释）</li>
		<li>2 μl 生物素-HPDP（1 mg/ml DMF）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
始终最后加入生物素-HPDP，并立即用移液器混匀。若出现生物素沉淀，可将DMF含量提高至终浓度40%。
<ol start="3">
	<li>室温下旋转孵育 1.5 小时。</li>
	<li>加入等体积的氯仿，剧烈混匀。孵育 2 - 3 分钟，直至相层开始分离且气泡逐渐消失。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 5 分钟，小心将上层水相转移至新离心管中。</li>
	<li>重复步骤 3.4 和 3.5 一次。建议在 2 ml Phase Lock Gel Heavy 管中进行此步骤，以减少 RNA 损失。</li>
	<li>RNA 沉淀：向水相中加入 1/10 体积的 5 M NaCl 和等体积的异丙醇。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 20 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入等体积的 75% 乙醇，在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>短暂离心，用 200 μl 移液器去除残留乙醇。</li>
	<li>短暂离心，用 20 μl 移液器去除残留乙醇。</li>
	<li>切勿让 RNA 完全干燥。将其重悬于 50 - 100 μl H2O 中（约每 1 μg 输入 RNA 使用 1 μl 水），通过上下吹打 5 - 6 次充分混匀。</li>
	<li>通过电泳分析检测 RNA 质量，以排除 RNA 降解情况。</li>
</ol>
4. 4sU 掺入的点印迹分析（可选）
通过生物素化RNA的点印迹分析可轻松确定4sU的掺入情况。此为可选步骤，可用于故障排查，并相对于生物素化DNA寡核苷酸对照来估算4sU的掺入率。在步骤3.2中，我们建议使用碘乙酰基生物素（iodoacetyl-biotin）而非生物素-HPDP对4sU标记的RNA进行生物素化。这将导致4sU-RNA发生不可逆的生物素化。因此，可采用基于柱的方法（例如 RNeasy）回收更少量的生物素化RNA（例如 5 μg）。尽管使用生物素-HPDP标记的RNA也适用于本实验，但其信号较弱，信噪比较差（图3）。
<ol>
	<li>按照第1和第2节所述的4sU标记及总细胞RNA分离方案进行操作。</li>
	<li>用碘乙酰-生物素替代第3节中所述的生物素-HPDP，对4sU标记的RNA进行生物素标记，并进行两次氯仿抽提以彻底去除过量的碘乙酰-生物素残留物。</li>
	<li>通过异丙醇/乙醇沉淀法回收生物素标记的RNA，方法如前所述，或采用基于柱的方法（例如 RNeasy）以防RNA微量（&lt;10 μg）被使用。</li>
	<li>将Zeta膜置于无核酸酶的水中，摇动孵育10分钟。</li>
	<li>将膜从无核酸酶水中取出，置于两张干净的纸巾之间并用力按压，以去除多余液体。将膜在空气中干燥5分钟，可使点样更清晰。</li>
	<li>每个样本使用冰上预冷的点杂交结合缓冲液（10 mM NaOH，1 mM EDTA）配制 20 μl 含 200 ng/μl RNA 的溶液。取 5 μl 该稀释液即 1 μg RNA）以及后续三次10倍稀释（即 分别将 100、10 和 1 ng 的 RNA 通过移液加样至 Zeta 膜上。可通过将移液枪在空的移液枪头架上依次移液，以实现均匀分布的点样间距。或者，按照制造商说明书使用点印迹装置。</li>
	<li>加入5 μl生物素标记的DNA寡核苷酸，浓度范围为20 ng/μl至20 pg/μl（即 通过移液将100至0.1 ng寡核苷酸作为阳性对照加到膜上。使用生物素标记的、未经4sU处理的样本作为阴性对照。</li>
	<li>将膜在空气中干燥5分钟。</li>
	<li>将膜置于 40 ml 封闭缓冲液中，室温摇动孵育 30 分钟。</li>
	<li>将膜与10 ml 1:1,000稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶溶液于室温孵育15分钟（5 ml PBS + 5 ml 20% SDS + 10 μl streptavidin-horseradish peroxidase）</li>
	<li>用 40 ml PBS + 10% SDS（20 ml PBS + 20 ml 20% SDS）洗涤膜 2 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 40 ml PBS + 1% SDS（38 ml PBS + 2 ml 20% SDS）洗涤膜 2 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 40 ml PBS + 0.1% SDS（40 ml PBS + 200 μl 20% SDS）洗涤膜 2 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>通过将膜夹在两张干净的纸巾之间并用力按压，以去除多余的液体。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用ECL显色法可视化膜结合的HRP。</li>
	<li>将膜放入塑料膜/袋中，去除气泡，并在避光条件下孵育 2 分钟。</li>
	<li>将膜暴露于胶片 1 - 5 分钟。</li>
</ol>
5. 使用链霉亲和素包被的磁珠分离标记与未标记的 RNA
<ol>
	<li>将洗涤缓冲液（每个样品 3 ml）在水浴中加热至 65 °C。</li>
	<li>在无核酸酶的 H2O 中配制新鲜的 100 mM 二硫苏糖醇（DTT）。方法是将 15 - 30 mg DTT 粉末倒入置于超精细天平上的洁净 50 ml Falcon 管中，称重后加入所需量的无核酸酶 H2O。</li>
	<li>将生物素标记的 RNA 样品在 65 °C 加热 10 分钟以变性，随后立即置于冰上。</li>
	<li>将 μMacs 柱放入磁力架中。建议每次处理不超过 12 个样品（6 - 8 个样品为最佳）。</li>
	<li>用 1 ml 室温洗涤缓冲液预平衡 Miltenyi 柱。此过程约需 15 分钟。</li>
	<li>同时，向 50 - 100 μl 生物素标记的 RNA 中加入 100 μl 链霉亲和素磁珠，在室温下旋转孵育 15 分钟。</li>
	<li>如果此时任何柱子尚未开始流下，可用戴手套的手指轻轻按压柱子顶部以促进流下。一旦开始流动，柱子将迅速排空。</li>
	<li>将 RNA/磁珠混合物上样至柱子中。弃去穿流液，除非您希望回收未标记的 RNA 组分（参见第 7 节）。</li>
	<li>用 0.9 ml 65 °C 的洗涤缓冲液洗涤三次（在 65 °C 下移取缓冲液时，1 ml 吸头会收缩）。</li>
	<li>用 0.9 ml 室温洗涤缓冲液再洗涤三次。</li>
	<li>将 700 μl RLT 缓冲液（RNeasy MinElute 清洁试剂盒，Qiagen）移入新的 2 ml 管中，并将这些管置于柱子下方。</li>
	<li>通过向柱子中加入 100 μl 100 mM DTT，将新转录的 RNA 洗脱至 RLT 缓冲液中。</li>
	<li>3 分钟后，向同一管中再加入 100 μl 100 mM DTT，进行第二次洗脱。</li>
</ol>
6. 新转录RNA的回收
按照 RNeasy MinElute Cleanup（Qiagen）试剂盒的制造商说明书继续操作。用 25 μl 无核酸酶的 H2O 洗脱。使用 Nanodrop 分光光度计测定 RNA 浓度。为避免在进行高通量检测前反复冻融 RNA，建议在新转录的 RNA 纯化后立即进行 cDNA 合成。取 2.5 μl 新转录的 RNA 加入 20 μl cDNA 合成体系中，按照制造商说明书进行 cDNA 合成。使用 cDNA 体系的 1:10 稀释液进行 qRT-PCR 对照实验。将 RNA 储存于 -80 °C。
7. 未标记、未结合 RNA 的回收（可选）
如果需要回收未结合的RNA，则收集并合并流穿液（在将RNA-链霉亲和素珠溶液加入柱子后）与第一次洗涤液，用于后续沉淀。通常仅沉淀50%的未结合RNA即可，因为其中已包含起始材料的&gt;80%。
<ol>
	<li>加入等体积异丙醇（无需添加盐，因为洗涤缓冲液中已含有 1 M NaCl）。</li>
	<li>在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入等体积 75% 乙醇，在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>短暂离心，用 200 μl 移液器去除残留乙醇。</li>
	<li>短暂离心，用 20 μl 移液器去除残留乙醇。</li>
	<li>切勿让 RNA 干燥。将其重悬于 100 μl H2O 中，通过上下吹打 5–6 次充分混匀。在 65 °C 下振荡孵育 10 分钟，随后立即置于冰上。</li>
	<li>通过电泳分析检测 RNA 质量，以排除 RNA 降解。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

对新转录的RNA进行代谢标记显著增强了微阵列和RNA测序等高通量技术的分析能力，通过提供更合适的模板来解答特定的生物学问题。本实验方案经过了 extensive 优化，可实现新转录RNA超过&gt;1,000倍的富集，并获得高度可重复的结果。
4sU标记实验的实验设计至关重要，因为新转录的RNA仅在细胞暴露于4sU期间反映实时的转录活性。如果刺激后转录速率的实际变化已经消退，那么即使总RNA水平的变化仍可被检测到，在分析新转录的RNA时仍会遗漏这些变化。因此，充分理解潜在的生物学过程对于确定实验设置以及4sU处理的最佳时间窗口非常重要。以下，我们针对最关键的步骤提供一些建议和避免常见陷阱的方法。
储备液与塑料器皿的准备
所有储备液必须使用无核酸酶的水配制。如果自制纯化的去离子水中含有还原剂，则可能引发问题。曾有案例因此导致所有标记的RNA完全丢失。因此，我们强烈建议购买预制成的无核酸酶NaCl、Tris-Cl、EDTA、柠檬酸钠和水。务必始终维持无核酸酶的操作环境。二甲基甲酰胺...

基因表达谱分析是研究细胞过程及其相关复杂相互作用网络的关键工具。对mRNA丰度的研究通常是获得潜在分子机制基本认识的首选方法。全转录组微阵列技术1的发展，以及近期RNA高通量测序（RNA-seq）2-4的应用，推动了这一研究策略的广泛应用。尽管这些技术极大地深化了我们对细胞基因表达复杂性的理解，但由于其模板样本——即总细胞RNA——固有的特性，这些方法仍存在重大局限性。例如，总RNA水平的短期变化并不能反映转录速率的变化，而是本质上依赖于相应转录本的RNA半衰期。一个短寿命转录本（例如编码转录因子的mRNA）即使被五倍诱导，也能在1小时内于总RNA中明显检测到；而相同倍数诱导的长寿命转录本（例如编码代谢酶的mRNA）则几乎无法察觉。此外，即使某个中等半衰期为5小时的基因其转录速率完全关闭（&gt;1,000倍下调），其总RNA水平也需要5小时才能下降两倍。因此，总RNA分析更有利于检测短寿命转录本的上调，而许多这类转录本编码的是转录因子和具有调控功能的基因5。此外，真实的调控动力学级联过程被掩盖，无法区分初级信号事件与次级响应事件。这两点都可能导致下游生物信息学分析产生显著偏差。第二，总RNA水平的变化无法归因于RNA合成或降解的改变。对后者的测量需要侵入性细胞实验方法，例如使用放线菌素D阻断转录6，并长时间监测RNA持续降解的过程。由于哺乳动物细胞中mRNA的平均半衰期为5–10小时5,7，在转录抑制数小时后，大多数基因的mRNA水平仅下降不到两倍。由于基础数学模型呈指数关系，这些微小差异导致绝大多数细胞基因的mRNA半衰期测量结果极不精确。最后，尽管基于总细胞RNA的RNA-seq研究显示，人类约一半基因会经历可变剪接事件8，但指导组织特异性和情境特异性RNA加工的动力学过程及其动态机制仍不清楚。此外，RNA加工在差异基因表达中的贡献，特别是对于非编码RNA的作用，仍有待阐明。总体而言，这些局限性构成了对潜在分子机制进行生物信息学动力学建模的主要障碍。
我们近期开发了一种称为高分辨率基因表达谱分析的方法，以解决上述问题5,7,9。该方法基于利用4-硫尿苷（4sU标记）——一种天然存在的尿苷衍生物——对新转录的RNA进行代谢标记，可直接获取新转录的RNA转录本，同时对细胞生长和基因表达的干扰极小（见图1）5,10-12。将真核细胞暴露于4sU后，4sU会迅速被细胞摄取，磷酸化为4sU-三磷酸，并掺入新合成的RNA中。在提取总细胞RNA后，可通过硫醇特异性的生物素化反应，使生物素与新转录的RNA之间形成二硫键，从而标记4sU掺入的RNA组分。随后，“总细胞RNA”可利用链霉亲和素包被的磁珠被定量分离为标记的（“新转录”）和未标记的（“预先存在”）RNA，且纯度较高。最后，只需加入还原剂（例如二硫苏糖醇），切断二硫键，即可从磁珠上回收标记的RNA，释放出新转录的RNA。
新转录的RNA反映了在4sU暴露时间段内每个基因的转录活性。以分钟为时间尺度的4sU标记因此能够提供真核基因表达的快照图像，并为下游生物信息学分析（例如 启动子分析）提供理想的模板。在可假设为稳态条件的情况下，新转录RNA/总RNA、新转录RNA/未标记RNA以及未标记RNA/总RNA的比值可无创地获得精确的RNA半衰期7,13。此外，需要注意的是，经过仅5分钟4sU标记后纯化的新转录RNA（5分钟4sU-RNA）比15分钟和60分钟4sU-RNA更“年轻”。当在单个实验体系中结合RNA-seq同时进行超短时间和逐步延长的4sU标记时，可在核苷酸分辨率上揭示RNA加工的动力学过程9。最后，对新转录RNA和总RNA进行时间序列分析，并结合计算建模，可实现对RNA合成与降解的整合性分析14。
总之，该方法能够直接分析真核细胞中RNA合成、加工及降解的动力学过程。该方法适用于包括哺乳动物、昆虫在内的所有主要模式生物黑腹果蝇）、两栖动物（非洲爪蟾，以及酵母 5,15,16可直接与微阵列分析兼容 5,17，RNA测序 9,13,14，且适用 体内12,15在此，我们详细阐述了在培养的哺乳动物细胞中标记、分离和纯化新转录RNA的方法。此外，还讨论了可能遇到的问题和注意事项。

<table><tbody><tr><td>4-硫代尿苷</td><td>Carbosynth</td><td>T4509</td><td>配制50 mM的无菌H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，于 -20 储存 &amp;deg;C，分装为50-500份 &amp;mu;弃去未使用的试剂，切勿重新冷冻。</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026（100 ml），15596018（200 ml）</td><td>&lt;强&gt;警告——具有腐蚀性，危害健康！&lt;/strong&gt; 确保立即获取苯酚解毒剂（PEG-甲醇）；4 ℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>372978</td><td>&lt;强&gt;警告——对健康有害&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td>&lt;em&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>柠檬酸钠，无核酸酶</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td>使用无核酸酶水配制1.6 M的储存液。</td></tr><tr><td>5 M 无核酸酶 NaCl</td><td>Sigma</td><td>71386</td><td>储备液</td></tr><tr><td>无核酸酶水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td>在无核酸酶的离心管中分装成每份1 ml。</td></tr><tr><td>RNA 沉淀缓冲液</td><td></td><td></td><td>1.2 M NaCl，0.8 M 柠檬酸钠溶于无核酸酶水中。需在严格无核酸酶条件下提前配制。置于50 ml Falcon管中，室温保存。</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>使用无核酸酶水配制80%乙醇，并于-20℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1 M 无核酸酶 Tris Cl，pH 7.5</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>储备液</td></tr><tr><td>500 mM 无核酸酶 EDTA，pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>储备液</td></tr><tr><td>10倍生物素标记缓冲液（BB）</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA 溶于无核酸酶水中，分装为每份 1 ml。</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link 生物素-HPDP</td><td>皮尔斯</td><td>21341</td><td>配制1 mg/ml储备液：将50 mg生物素-HPDP溶解于50 ml DMF中。轻微加热可促进溶解。4 ℃保存 &amp;deg;C，分装为每份1 ml。</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 管（2.0 ml）</td><td>Eppendorf</td><td>0032 005.152</td><td>氯仿抽提步骤的可选操作。</td></tr><tr><td>Zeta 膜</td><td>BIORAD</td><td>162-0153</td><td></td></tr><tr><td>10x 点印迹结合缓冲液</td><td></td><td></td><td>100 mM NaOH，10 mM EDTA</td></tr><tr><td>生物素-寡核苷酸</td><td></td><td></td><td>5'-生物素，25个核苷酸，任意序列</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Fisher</td><td>BPE9738</td><td>对于100 ml 20%的储存液，将20 g SDS加入80 ml pH 7–8的PBS中，并调节体积至100 ml。所有高浓度SDS溶液均需保存在20℃以上 &amp;deg;C. 若SDS析出沉淀，可将溶液略微加热。</td></tr><tr><td>EZ-Link 碘乙酰基-LC-生物素</td><td>皮尔斯</td><td>21333</td><td>将50 mg碘乙酰基生物素溶于50 ml DMF中，配制成1 mg/ml的储存液。轻微加热可促进溶解。4 ℃保存。 &amp;deg;C，分装为每份1 ml。可产生不可逆的、特异性针对巯基的生物素标记。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>点印迹封闭缓冲液</td><td></td><td></td><td>将20 ml 20% SDS与20 ml 1×PBS（pH 7–8）混合，并加入EDTA至终浓度为1 mM。</td></tr><tr><td>链霉亲和素-辣根过氧化物酶 </td><td>Vector Laboratories</td><td>SA5004</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C. 将10 ml 20% SDS与10 ml 1 x PBS混合。加入20 &amp;mu;使用前将链霉亲和素-HRP稀释。 </td></tr><tr><td>ECL 试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RNP2109</td><td>按照制造商的说明使用。</td></tr><tr><td>Super RX，X-RA 胶片，18×24 厘米</td><td>富士胶片</td><td>47410 19236</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;Macs 链霉亲和素试剂盒</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>将珠子在 4 ℃ 下保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20，溶于无核酸酶的H₂O中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>43817</td><td>将DTT配制成100 mM的无核酸酶水溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，使用前务必新鲜配制。</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>4℃下保存层析柱 &amp;deg;C，将试剂盒的其余组分置于室温下。</td></tr><tr><td>1.5 ml 螺口聚丙烯管</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td>与二甲基甲酰胺兼容</td></tr><tr><td>2.0 ml 螺口聚丙烯管</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td>与二甲基甲酰胺兼容</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>与二甲基甲酰胺兼容</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>与二甲基甲酰胺兼容</td></tr><tr><td colspan="4">所有溶液/试剂均应室温保存，除非另有说明。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>紫外/可见分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NanoDrop 1000</td><td>或同等体积。使用低体积（1-2 &amp;mu;l) 用于低浓度 RNA 的测量，以避免样品过度损失。</td></tr><tr><td>聚丙烯15 ml离心管</td><td>VWR International</td><td>525-0153</td><td>与标准的15 ml离心管相比，这些可耐受高达15,000 &amp;#215; g</td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Avanti J-25</td><td>或可达到13,000的同等设备&amp;#215;g</td></tr><tr><td>高速转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>JLA-16250</td><td>或能够达到13,000的同等设备&amp;#215;g</td></tr><tr><td>15 ml 离心管适配器</td><td>Laborger&amp;#228;te Beranek</td><td>356964</td><td>或可达到13,000的同等设备&amp;#215;g</td></tr><tr><td>冷藏台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>或同等产品。</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer compact</td><td>或同等物。</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>一个支架可容纳8个 &amp;mu;Macs 柱</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>资助</td><td>SUB Aqua 5</td><td>或同等物。</td></tr><tr><td>超精细尺度</td><td>A&amp;研发</td><td>GR-202</td><td>或同等产品。</td></tr><tr><td>E-Gel iBase 电源系统</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>用于RNA凝胶；或同等用途。</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% 琼脂糖预制凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>用于RNA凝胶；或同等用途。</td></tr></tbody></table>

细胞培养中新生转录rna的代谢标记：用于高分辨率rna合成、加工与降解的基因表达谱分析

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

全基因组转录组微阵列与下一代测序技术的发展极大地革新了我们对细胞基因表达复杂性的理解。随着对相关分子机制的认识不断深入，精确测量其基础动力学参数的重要性也日益凸显。然而，这些强大方法在应用中因所研究模板样本的固有特性而面临重大局限性。 即 总细胞RNA。在许多情况下，总细胞RNA的变化发生得过慢或过快，难以以足够的分辨率反映潜在的分子事件及其动力学过程。此外，RNA合成、加工和降解变化的各自贡献也难以明确区分。
我们近期开发了高分辨率基因表达谱分析技术，以克服这些局限性。该方法基于利用4-硫代尿苷（4-thiouridine）对新转录的RNA进行代谢标记（因此也称为4sU标记），随后通过硫醇特异性生物素化及链霉亲和素包被的磁珠严格纯化新转录的RNA。该技术适用于多种生物体，包括脊椎动物、Drosophila和酵母。我们已成功应用4sU标记技术研究转录因子活性的实时动力学，精确测定RNA的半衰期，并深入揭示RNA加工过程的动力学特征。最后，还可结合计算建模，对潜在的分子机制进行系统性、综合性的分析。

1. 起始材料及预期产量
经过1小时（hr）4sU暴露后，新转录的RNA约占总细胞RNA的1%–4%。在生长停滞的细胞中，该比例会更低，因为这些细胞不再合成用于细胞生长/复制的RNA。当标记时长为1小时时，我们建议从60– 80 μg 总RNA。起始材料少于 30 μg 总RNA的提取会导致在生物素标记步骤后产生难以观察的小RNA沉淀，因此容易丢失。输入RNA的量可增加至最多 150 μg 对于极短时间的标记（例如 5 - 10 分钟）。当RNA标记时间从1小时缩短至5分钟时，新转录RNA中短寿命的内含子序列所占比例从约60%增加至约80% 9由于内含子的长度显著长于编码序列以及5'-和3'-非翻译区（UTR），在进行短时间甚至超短时间（4sU标记）标记后所纯化的新生转录RNA的量并不会线性下降。因此，我们获得了 &gt;非黏附性人 B 细胞系中经 5 分钟 4sU 标记后总 RNA 的 0.5% 9需要注意的是，贴壁细胞中要达到相似的4sU掺入率，可能需要更高的4sU浓度和稍长的标记时间。尽管较低的4sU掺入率仍足以有效捕...

总细胞RNA作为研究RNA合成与降解的短期变化以及RNA加工动力学的模板效果较差。本文介绍了一种利用4-硫代尿苷对新转录RNA进行代谢标记，随后通过巯基特异性生物素化并纯化新转录RNA的方法，从而克服上述局限性。

细胞培养中新生转录RNA的代谢标记：用于高分辨率RNA合成、加工与降解的基因表达谱分析

全基因组转录组微阵列和下一代测序技术的发展彻底改变了我们对细胞基因复杂性的理解……

该方法旨在直接且精确地测量真核细胞培养物中RNA合成、加工及降解的动力学过程。在细胞中加入4-硫代尿苷以对新转录的RNA进行代谢标记，随后裂解标记后的细胞并纯化总细胞RNA，接着进行巯基特异性的生物素标记，从而选择性地标记新转录的RNA分子。然后，利用链霉亲和素包被的磁珠将4-硫代尿苷标记的新转录RNA转录本从预先存在的RNA中分离出来，获得包含总RNA、新转录RNA以及未标记的预先存在RNA的RNA组分。随后可对RNA进行下游分析，包括定量逆转录聚合酶链反应（Q-R-T-P-C-R）、微阵列或高通量测序。与全细胞RNA分析相比，对新转录RNA的分析在检测基因表达短期变化方面灵敏度提高约十倍。此外，该方法有助于精确测定RNA半衰期，并首次真实揭示RNA加工的动态过程。对新合成转录本的代谢标记可成功应用于解析基因表达的调控分子机制。该方法也可应用于其他模式生物，如 ops、oph 和酵母。实验开始前应制定详细的计划，确保每种条件之间至少间隔五分钟。硫代尿苷标记物应在使用前解冻，并将每种条件所需用量分装至无菌 Falcon 管中。每种处理条件下，将每个10厘米培养皿中的5毫升细胞培养基转移至含有四种硫嘌呤的试管中，充分混匀后，吸除培养物上剩余的培养基。然后将标记有培养基的试管重新加回到细胞中，并在实验设定的时间内进行孵育。去除细胞培养基后，向每块培养板中加入5毫升三醇。室温孵育五分钟，以实现完全的细胞裂解。用加入的三醇小心冲洗培养板，并将样品转移至聚丙烯管中，这些管能够耐受13,000 G的离心。样品可在-20摄氏度保存，或立即用于根据三醇试剂说明书制备总细胞RNA。标记反应起始时，取60至80微克总细胞RNA样品，将一微克RNA溶于七微升无核酸酶水中，然后加入一微升10倍生物素缓冲液。然后每微克 RNA 加入 1 mg/mL 的生物素 HPDP 两微升，并立即用移液器混匀。如果生物素出现沉淀，可增加 DMF 的含量。最终 DMF 浓度为 40%，将反应体系在室温下旋转孵育 1.5 小时。接着，加入等体积的氯仿，充分混匀后孵育2至3分钟，直至两相开始分离且气泡逐渐消失。离心样品，然后小心地将上层水相转移至新管中。经过第二次氯仿抽提后，加入十分之一体积的5摩尔氯化钠溶液和等体积的异丙醇。从水相中沉淀RNA时，通过离心使RNA形成沉淀。弃去上清液，用等体积的75%乙醇洗涤沉淀一次，再次离心后弃去上清液。短暂离心，然后用200微升移液器除去残留的乙醇。再次离心，用20微升移液器吸除残留乙醇，将RNA重悬于50至100微升水中，通过移液充分混匀。采用电泳评估RNA质量，以排除RNA降解情况。将每份样品的三毫升洗涤缓冲液在水浴中平衡至65摄氏度。同时将生物素标记的RNA样品在65摄氏度变性10分钟，随后立即置于冰上。将微量离心柱置于磁力架上。用一毫升室温洗涤缓冲液预平衡M

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高分辨率基因表达谱RNA的合成，加工和衰变的新转录RNA在细胞培养的代谢标记

我们介绍一种利用成像技术在缺氧条件下分析全局RNA合成的方法。此前尚未在缺氧条件下进行过基于点击化学的RNA标记，该技术可实现单细胞水平上全局RNA变化的可视化。该方法补充了现有的平均化RNA检测技术，能够直接观察细胞间全局RNA合成的差异。...

缺氧后单细胞水平全局RNA合成分析

比率型双分子信标（RBMBs）可用于在活细胞中对单个工程化RNA转录本进行成像。本文中，我们描述了RBMBs的制备与纯化方法，通过微孔电穿孔将RBMBs递送至细胞，以及实时荧光成像单个RNA转录本的过程。...

活细胞中利用比率型双分子信标对单个工程化RNA转录本进行实时成像

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

我们介绍一种名为SPOt（tRNA简化分析平台，Streamlined Platform for Observing...

利用宏阵列对转运RNA进行代谢标记与分析

该方法可用于测量RNA合成。将5-溴尿苷加入细胞中，并掺入新合成的RNA。通过标记后立即提取RNA，随后对标记的RNA进行针对5-溴尿苷的免疫沉淀，并通过逆转录和定量聚合酶链式反应分析，从而测定RNA合成水平。...

利用5-溴尿苷标记与免疫沉淀法研究RNA合成

本文所述方案基于对经4-硫尿嘧啶标记的酵母细胞中纯化的新生mRNA进行全基因组水平的定量分析。该方法能够将mRNA合成与mRNA降解过程分离，从而准确测量RNA聚合酶II的转录活性。...

Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标

利用硫代尿嘧啶从酵母Saccharomyces...

体内利用4-硫尿嘧啶进行极快速且特异的RNA代谢标记（Ers4tU）

我们提供了用于转录组分析中新生转录本的代谢标记与纯化的详细方法 非洲爪蟾...

Xenopus 早期胚胎发生过程中新生转录组的代谢标记

本实验方案描述了如何从小鼠骨髓中建立原代造血细胞培养，并随后使用 Gene Pulser MXCell...

小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

高质量完整RNA的分离是许多实验室实验方案中的关键步骤。在此，我们展示了从完整的斑马鱼胚胎中提取RNA并合成cDNA，以用于后续多种实验操作，包括基因表达微阵列分析。...

从斑马鱼胚胎中提取RNA及用于基因表达分析的cDNA合成

学习使用4-硫尿苷代谢标记技术分离真核细胞培养中的新转录RNA，通过硫醇特异性生物素化和链霉亲和素磁珠捕获，实现RNA合成、加工和降解动力学的高灵敏度检测，为基因表达调控机制研究提供精确方法。

细胞培养中新生转录RNA的代谢标记：用于高分辨率RNA合成、加工与降解的基因表达谱分析

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