Name: 来自患者的细胞培养和分离的CD133 +假定的肿瘤干细胞的恶性黑色素瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 学习从恶性黑色素瘤患者组织中建立原代细胞培养，并通过磁珠分选技术分离CD133阳性肿瘤干细胞。该方法去除红细胞和成纤维细胞污染，获得高纯度活性细胞群体，用于个性化医疗中的药物反应预测研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 M. Dietel 教授和 Dirk Schumacher 对本工作的支持以及对稿件的审阅。
这些研究成果获得了创新药物计划联合企业（Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking）在第n号资助协议下的支持&deg; 115234，其资源由欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）的财政资助以及欧洲制药工业协会联合会（EFPIA）各公司的实物捐助共同构成。本工作还得到了柏林癌症协会（Berliner Krebsgesellschaft, BKG）的支持。

实验的整体方案包括从肿瘤组织中制备原代单细胞、原代细胞培养物的表征、成纤维细胞去除以及CD133+和CD133-黑色素瘤细胞的磁性细胞分选，如图1所示。
1. 样品获取
<ol>
	<li>在考虑下一步操作前，需确认已获得伦理批准。</li>
	<li>准备一个50 ml离心管，加入含1%青霉素-链霉素终浓度的无菌PBS，并交予手术手术室团队。</li>
	<li>安排将肿瘤组织从手术室快速转运至细胞培养实验室，运输温度为4 °C。</li>
</ol>
2. 从肿瘤组织制备原代黑色素瘤单细胞
<ol>
	<li>所有步骤均需在无菌条件下进行。</li>
	<li>在切除肿瘤之前，需准备消化液。每 2-4 g 组织需要 10 ml 消化液。该混合液可立即使用，或分装为 10 ml 每份，于 -20 °C 保存以备后续使用。
	<ol>
		<li>配制含有 150 mM 氯化钠的溶液。使用涡旋振荡器混匀，直至溶液澄清。如有必要，使用 0.22 μm 滤器对氯化钠溶液进行无菌过滤。</li>
		<li>称取 DNase I，用 150 mM 氯化钠溶液配制成 10 mg/ml 的 DNase I 溶液。通过反复倒置混匀，直至溶液澄清。</li>
		<li>用 PBS 配制含有 100 mg/ml Collagenase IV 的溶液。通过反复倒置混匀，直至溶液澄清。胶原酶溶液可分装后于 -20 °C 保存数月。</li>
		<li>用 Quantum 263 培养基配制消化液，终浓度为 1% 青霉素-链霉素、1 mg/ml Collagenase IV 和 0.1 mg/ml DNase I。使用涡旋振荡器混匀。可选：若使用来源于皮肤的黑色素瘤组织，可在消化液中加入两性霉素 B 溶液，使其终浓度为 1.5 μg/ml 两性霉素 B。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所需量的消化液、PBS 和 Quantum 263 培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>将肿瘤组织置于无菌培养皿中。吸除组织表面多余液体，加入 500 μl 消化液。使用新的无菌手术刀将肿瘤切成 2-4 mm 的小块。</li>
	<li>将 2-4 g 切碎的肿瘤组织转移至 gentleMACS C 管中，加入 5 ml 消化液。用额外的 4.5 ml 消化液冲洗培养皿，并将残留的组织碎片一并加入 gentleMACS C 管中。</li>
	<li>盖紧 gentleMACS C 管，将其倒置固定在 gentleMACS 解离仪的套筒上，运行程序 "h_tumor_01"。</li>
	<li>将 gentleMACS C 管从解离仪上取下，在 37 °C 下持续旋转孵育 30 分钟。可使用 MACSmix 管式旋转仪以最高速度（12 rpm）旋转，或每 5 分钟手动翻转一次试管，以重新悬浮沉降的组织碎片。</li>
	<li>将 gentleMACS C 管倒置固定在 gentleMACS 解离仪的套筒上，运行程序 "h_tumor_02"。</li>
	<li>将 gentleMACS C 管从解离仪上取下，在 37 °C 下持续旋转孵育 30 分钟。可使用 MACSmix 管式旋转仪以最高速度（12 rpm）旋转，或每 5 分钟手动翻转一次试管，以重新悬浮沉降的组织碎片。</li>
	<li>将 gentleMACS C 管倒置固定在 gentleMACS 解离仪的套筒上，运行程序 "h_tumor_03"。</li>
	<li>将 gentleMACS C 管从解离仪上取下，重悬样品，并将细胞悬液通过置于 50 ml 离心管上的 70 μm 细胞筛。若滤器发生堵塞，可用无菌滤头轻轻搅动细胞悬液，直至全部液体通过滤器。</li>
	<li>用 5 ml Quantum 263 培养基冲洗细胞筛。</li>
	<li>可选：若滤器中仍有残留的组织碎片，可将碎片重悬于 Quantum 263 培养基中，并接种至适当的细胞培养皿中。于 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育组织碎片。</li>
	<li>弃去细胞筛，将含有消化后细胞悬液的 50 ml 管盖紧。在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>可选：若细胞沉淀因含有大量红细胞而呈红色，可将 10x 红细胞裂解液用双蒸水按 1:10 稀释，配制成 1x 红细胞裂解液。将细胞沉淀重悬于 500 μl PBS 中，加入 5 ml 1x 红细胞裂解液。涡旋振荡 5 秒，在室温下孵育 10 分钟。在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用 Quantum 263 培养基重悬肿瘤细胞，并将细胞接种至适当的细胞培养瓶中。于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养肿瘤细胞，当细胞融合度达到 80% 时进行常规传代。</li>
</ol>
3. 原代细胞培养的表征与成纤维细胞去除
<ol>
	<li>使用显微镜对原代细胞培养物进行表型分析。</li>
	<li>收集少量原代细胞培养物（0.5×106 个细胞），并使用针对肿瘤性、黑色素瘤、干细胞和基质细胞标志物基因的引物进行 RT-PCR。需分析的最重要基因包括 CD90（成纤维细胞标志物）、TYR（黑色素瘤/黑色素细胞标志物）、CD133（肿瘤干细胞标志物）、CD83（成熟树突状细胞标志物）以及一个看家基因（例如 HPRT 或 GAPDH）。</li>
	<li>如果显微镜分析和 RT-PCR 中 CD90 的高表达表明原代黑色素瘤培养物中存在大量成纤维细胞污染，则需使用 Miltenyi 的抗成纤维细胞 MicroBeads 和 D Columns 去除成纤维细胞。</li>
</ol>
4. 使用 LS 柱对 CD133+ 和 CD133- 黑色素瘤细胞进行磁性细胞分选
<ol>
	<li>配制含2 mM EDTA和5% FCS的PBS缓冲液。通过倒置混匀，并使用0.22 μm Steritop-GP滤器单元进行无菌过滤。将缓冲液冷却至4–8 °C，并在使用前脱气。</li>
	<li>将Accutase、PBS和Quantum 263培养基预热至37 °C。</li>
	<li>用PBS洗涤80%融合度的细胞。加入适量Accutase，孵育至细胞从培养表面脱落。使用Quantum 263培养基将细胞收集至50 ml离心管中。</li>
	<li>计数细胞，并以300 × g离心5分钟（温度4–8 °C），收集所需数量的细胞（根据Miltenyi的操作说明，每根LS柱最多可上样2×109个细胞；不同细胞系的最佳上样量需另行确定，通常可能显著低于此值）。完全吸除上清液。</li>
	<li>将最多1×108个细胞重悬于350 μl MACS缓冲液中（若细胞数量更高，则按比例增加后续所有试剂体积，包括MACS缓冲液、FcR阻断试剂、CD133/1-Biotin和抗生物素微珠）。</li>
	<li>加入100 μl FcR阻断试剂。</li>
	<li>加入50 μl CD133/1-Biotin。使用涡旋振荡器充分混匀，在4–8 °C下孵育10分钟。</li>
	<li>加入10 ml MACS缓冲液洗涤细胞，以300 × g离心5分钟（温度4–8 °C）。完全吸除上清液。</li>
	<li>重复步骤（4.8）的洗涤操作。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于400 μl MACS缓冲液中。</li>
	<li>加入100 μl 抗生物素微珠（anti-Biotin MicroBeads）。使用涡旋振荡器充分混匀，在4–8 °C下孵育15分钟。</li>
	<li>同时准备用于磁性分离的MACS分选仪。将QuadroMACS装置安装至MACS分选仪多联支架上。将所需数量的LS柱插入QuadroMACS的磁场中，确保柱翼朝前。在每根LS柱中放置一个预分选滤器（含30 μm尼龙网），并在每根柱下方放置合适的收集管（15 ml或50 ml）。用3 ml MACS缓冲液冲洗滤器和柱子以进行预处理，弃去穿流液。</li>
	<li>加入10 ml MACS缓冲液洗涤细胞，以300 × g离心5分钟（温度4–8 °C）。完全吸除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于500 μl MACS缓冲液中，并将细胞悬液通过预分选滤器加载至LS柱上。</li>
	<li>每根柱用3 ml MACS缓冲液洗涤三次。仅当柱储液腔排空后才可加入新的缓冲液。</li>
	<li>收集的总穿流液含有未标记的CD133−细胞组分。</li>
	<li>弃去预分选滤器，从分选仪上取下柱子，并将其置于合适的收集管上。</li>
	<li>加入5 ml MACS缓冲液。立即用力将推杆插入柱中，快速洗脱出标记的CD133+细胞。</li>
	<li>为提高阴性组分的纯度，可将细胞悬液加载至另一根已平衡的LS柱（插入QuadroMACS装置中）。此时穿流液即为CD133−细胞组分。</li>
	<li>弃去所有柱子。</li>
</ol>

<ol><li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+sunlight+causes+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li>
<li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Srp.+Arh.+Celok.+Lek%22%5BJournal%5D)">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li>
<li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li>
<li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma%3A+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eur.+Acad.+Dermatol.+Venereol%22%5BJournal%5D)">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li>
<li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEigentler%2C+TK+%22Der+Onkologe%22">Der Onkologe</a>. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).</li>
<li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms%3A+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+%C3%84rzteblatt%22%5BJournal%5D)">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).</li>
<li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li>
<li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li>
<li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li>
<li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li>
<li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-contamination+of+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li>
<li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li>
<li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cancer+cell+lines%3A+fact+and+fantasy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li>
<li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).</li>
<li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermis-derived+stem+cells%3A+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li>
<li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133%2B+cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li>
<li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li>
<li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer%2Ftestis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133%2B+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy+%3A+CII%22%5BJournal%5D)">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li>
<li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+cell+selection+is+an+alternative+to+CD34%2B+cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematother.+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li>
<li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li>
<li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone%2C+but+on+embryonic+neural+stem+cells%2C+ependymal+cells%2C+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li>
<li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li>
<li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker%2C+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409(2007).</li>
<li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952(2012).</li>
<li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

为了去除肿瘤细胞沉淀中的红细胞污染，我们强烈推荐使用 Miltenyi 公司的红细胞裂解液。与传统的 Ficoll 密度梯度离心法相比，裂解红细胞的方法具有更快、更简便的优点。此外，该方法可避免 Ficoll 或红细胞的残留污染，同时防止肿瘤细胞丢失。在原代细胞培养过程中，若观察到成纤维细胞生长，应立即清除，因为若等待时间过长，成纤维细胞通常会过度生长并抑制肿瘤细胞的增殖。
使用 Miltenyi 的 MACS 技术分选细胞时，我们建议通过酶解法收获细胞。虽然使用细胞刮刀对细胞及其表面表位可能更温和，但会产生细胞碎片，这些碎片会非特异性地结合到 MACS 柱上并导致柱子堵塞。与传统的胰蛋白酶/EDTA 处理相比，Accutase 的优势包括减少细胞应激，从而提高细胞活力，并最大限度降低将外源性因子引入细胞培养物的风险。Accutase 制剂不含任何哺乳动物或重组细菌蛋白28。
为防止抗体在细胞表面发生封端以及非特异性细胞标记，操作时应迅速进行，保持细胞处于低温环境，并使用预冷的溶液。所有孵育步骤均应在 2...

皮肤恶性黑色素瘤是皮肤癌中最少见但最致命的类型。由于发病率不断上升、恶性程度高且扩散迅速，黑色素瘤目前已占皮肤恶性肿瘤相关死亡病例的75%1,2。除原发肿瘤的手术切除外，化疗、放疗、免疫治疗以及针对转移性黑色素瘤的联合化疗与免疫治疗，是当前黑色素瘤治疗的主流策略3,4。然而，恶性黑色素瘤对化疗药物的应答率较低（5–12%）5,6，仅有携带BRAF V600E基因突变的50–70%患者能从维莫非尼等新型靶向治疗中获益7。为了提高总体生存率，迫切需要更深入地理解黑色素瘤发生发展的机制。
过去研究这些机制时，通常使用已建立的商业化细胞系。近年来，研究癌症发生和进展分子事件的新方法则采用直接从肿瘤组织获取的原代培养细胞——这一策略具有多种优势：研究者可完全掌控患者和组织的选择；从经过专业筛选的肿瘤组织中获得的细胞能够真实再现肿瘤的全部异质性，同时患者的随访数据和详细的病理信息也可获取，从而可将培养细胞的特性与原始肿瘤的特性进行比较8。
相比之下，关于使用已建立的细胞系作为癌症研究中相关模型系统的有效性，学界仍存在争议。早在1987年，Osborne 及其同事就描述了来自不同实验室的 MCF-7 人乳腺癌细胞系之间存在显著的生物学差异9。Hiorns et al. 后续研究证实了这些细胞系在传代过程中存在广泛的基因组不稳定性及RNA表达的变异，为“细胞系在培养过程中会发生演化”的观点提供了支持性证据，从而削弱了此类已建立的细胞培养体系作为人类癌症模型的直接相关性10。
另一个长期以来被忽视的重要问题是，细胞培养物可能被无关的“错误”细胞污染或过度生长，这一问题早在二十多年前就已提出，当时的研究表明，大量细胞系受到了HeLa细胞的污染8,11。近年来，文献中再次揭示了因使用“错误”细胞系而导致的数据误读问题。MacLeod 等通过结合DNA图谱分析和分子细胞遗传学方法发现，在德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ）保存的252株新建立的肿瘤来源人源细胞系中，近18%存在种内或种间交叉污染12,13。
为了避免上述问题并利用前述优势，我们决定从新切除的转移灶中建立低传代黑色素瘤细胞系。
稳健的细胞分离与分析技术需要在生成单细胞悬液的同时，最大限度地限制细胞死亡并保护特征性表面蛋白不被破坏。一种用于将组织自动解离为单细胞悬液的台式仪器是 Miltenyi 公司生产的 gentleMACS Dissociator。当该仪器与 gentleMACS C 管及优化的解离溶液联合使用时，可在封闭系统中实现对肿瘤组织的有效且温和的解离，同时保留抗原表位并减少细胞损失。该仪器为多种特定应用提供了优化的预设程序，可标准化地制备黑色素瘤组织来源的单细胞悬液14。
近期的研究报告表明，大多数肿瘤中都存在一小部分所谓的肿瘤干细胞（CSCs），这些细胞具有独特的肿瘤起始能力和自我更新能力。在皮肤真皮层中发现能够产生黑色素细胞的干细胞后，研究者提出假设：这些细胞可能是黑色素瘤中肿瘤干细胞（CSCs）的来源，因为暴露于UVA辐射可能促使这些细胞发生恶性转化15。此类基因损伤的结果是产生兼具肿瘤细胞和干细胞特性的细胞。
在黑色素瘤中，CD13316-20 被提出作为代表肿瘤干细胞（CSCs）亚群的关键标志物之一。CD133（亦称为Prominin 1）属于五次跨膜糖蛋白家族，表达于造血干细胞、内皮祖细胞、神经元及胶质干细胞中21-23。CD133的表达与细胞不对称分裂相关24，且其糖基化表位在细胞分化过程中被证实会下调25。近期研究表明，CD133+ 黑色素瘤细胞具有自我更新和肿瘤起始能力19,20。
为了研究CD133+黑色素瘤肿瘤干细胞（CSCs）的潜在功能，我们对美天旎生物技术公司（Miltenyi Biotech）的磁性激活细胞分选（MACS）系统进行了改进和优化，以获得高纯度且具有活力的CD133+和CD133-细胞群体。
磁珠法细胞分离可用于负向筛选，如 Matheu 所示 等26 或如本文所示的阳性选择。在阳性选择过程中，特定的目标细胞类型， 例如 表达CD133的细胞通过与高度特异性抗体偶联的50 nm超顺磁性微珠（MicroBeads）进行磁性标记。在分离过程中，磁性标记的细胞在分离器的磁场作用下被保留在色谱柱内，而未标记的细胞则流出色谱柱。经过洗涤步骤后，将色谱柱移出分离器的磁场，目标细胞即可从色谱柱中洗脱。在阳性选择过程中使用的LS或MS色谱柱可获得高纯度的标记细胞与未标记细胞组分。相比之下，用于阴性选择的LD色谱柱所获得的标记组分纯度略低。由于其基质填充更为致密，这类色谱柱的流速较低，导致未标记细胞更易被困在柱内。因此，LD色谱柱仅应适用于对不需要的细胞亚群进行严格去除。阳性选择可通过直接磁性标记（抗体直接偶联至MicroBeads）或间接磁性标记（先与一抗孵育，再与MicroBeads孵育）实现。目前已有针对多种原发性肿瘤细胞（如前列腺癌细胞或黑色素瘤细胞）阳性选择的特异性MACS MicroBeads产品27.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B溶液，250 &amp;mu;g/mL，溶于去离子水</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2942-50ml</td><td></td></tr><tr><td>抗成纤维细胞微珠</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>CD133/1 (W6B3C1)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-395</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem GmbH</td><td>A3778.0050</td><td></td></tr><tr><td>不含Ca、Mg的D-PBS</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E-7889</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>人源间接CD133微珠试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-091-895</td><td>包含：CD133/1(AC133)-生物素、抗生物素微珠和FcR阻断试剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（液体，100倍浓缩）</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Quantum 263</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>U15-815</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液（10倍浓缩）</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>细胞筛（70 &amp;mu;m）</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C管</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>MACS分选器多用支架</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS分选柱 25 LS柱</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix管式旋转混合器</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck KGaA</td><td>567440-1KG</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS分选器</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rotilabo注射器滤器（0.22 &amp;mu;m，PES）</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG</td><td>P668.1</td><td></td></tr><tr><td>Steritop-GP 过滤装置 500 ml</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr></tbody></table>

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离cd133+潜在肿瘤干细胞

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

尽管目前黑色素瘤的治疗选择已有所改善，但晚期恶性黑色素瘤患者的无进展生存期和总生存期预后仍然较差。因此，转化医学研究需要提供进一步的分子证据，以改进针对恶性黑色素瘤的靶向治疗。过去，与黑色素瘤相关的致癌机制主要在已建立的细胞系中进行了广泛研究。为了迈向基于个体基因谱的更个性化治疗方案，我们建议使用患者来源的细胞系，而非通用型细胞系。结合高质量的临床数据，尤其是患者的随访信息，这些细胞将有助于更深入地理解黑色素瘤进展背后的分子机制。
本文报道了从分离的新鲜肿瘤组织中建立黑色素瘤原代培养细胞的方法。该操作步骤包括将组织切碎并解离为单个细胞，去除红细胞和成纤维细胞的污染，以及进行原代培养，并可靠地验证细胞的黑色素瘤来源。
近期研究发现，黑色素瘤与大多数肿瘤类似，其内部存在一小群肿瘤干细胞（CSCs），这类细胞似乎是驱动肿瘤发生及其向转移状态进展的唯一来源。在黑色素瘤中，用于识别和分离肿瘤干细胞的关键标志物之一是CD133。为了从原代黑色素瘤培养物中分离CD133+肿瘤干细胞，我们对Miltenyi公司的磁性激活细胞分选（MACS）技术进行了改进和优化，从而实现了高纯度分选，并获得了高活性的CD133+肿瘤干细胞及CD133-主体细胞群，这些细胞可进一步用于培养和功能分析。

肿瘤组织单细胞制备
图2展示了晚期黑色素瘤患者切除的淋巴结转移灶在机械解离成2-4 mm组织块之前（A）和之后（B）的示例。组织经酶解消化后，通过70 μm尼龙滤网过滤，细胞被离心沉淀，上清液弃去。在此步骤中，我们观察到红细胞污染严重，如图2C中细胞沉淀呈现红色所示。随后，我们去除了红细胞，得到浅棕色的细胞沉淀（图2D）。将这些细胞重悬后，用Quantum 263培养基在37 °C和5% CO2条件下进行培养。
原代细胞培养物的表征
为了验证细胞来源于肿瘤组织而非周围间质，我们对黑色素细胞/黑色素瘤、成纤维细胞、树突状细胞及干细胞标志基因进行了RT-PCR检测。成体黑色素细胞作为TYR的正常对照细胞，而胚胎癌细胞系NCCIT则作为干细胞标志物CD133的阳性对照。如图3所示的PCR结果表明，部...

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133-主体细胞中分选出CD133+的黑色素瘤干细胞样细胞。

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

尽管目前黑色素瘤的治疗选择已有所改善，但晚期恶性黑色素瘤患者的预后仍然较差……

本实验的总体目标是从恶性黑色素瘤中建立患者来源的细胞培养物，并分离出潜在的CD133阳性肿瘤干细胞。首先从肿瘤组织制备黑色素瘤原代单细胞，然后去除细胞沉淀中的红细胞。如有必要，可对原代细胞培养物进行表征，并去除成纤维细胞。最后一步是进行CD133阳性与CD133阴性黑色素瘤细胞的磁珠分选。最终，这一优化后的Max方案是一种获得高度富集且具有活性的CD133阳性与CD133阴性细胞群体的优良方法。我们最初应用该技术来验证个体化医学中的转录组数据，在该领域中我们试图预测癌症患者对药物的反应，而这一研究无法使用任何商业可得的细胞系完成。该技术的主要优势在于能够快速获取CD133阳性细胞，这些细胞被认为是恶性黑色素瘤中的肿瘤干细胞。本技术将由我实验室的技术员Catherine Davis进行演示。将手术中新分离的肿瘤组织置于含有1%青霉素-链霉素的无菌PBS中，转移至组织培养实验室。将肿瘤组织转移至无菌培养皿中，吸除多余液体。随后加入500微升解离混合液，使用新的无菌手术刀将肿瘤组织切碎为2至4毫米的小块。接着将2至4克切碎的肿瘤组织转移至含有5毫升解离混合液的gentle max C管中。用额外的4.5毫升解离液冲洗培养皿，并将剩余的组织碎片加入gentle max C管中。关闭管盖，将其倒置固定在解离仪套管上，运行程序H tumor zero one。随后，将样品在37摄氏度下以最高速度持续旋转孵育30分钟。现在将离心管倒置固定到解离套管上，运行程序 H tumor zero two。随后在 37 摄氏度下以 12 RPM 的持续旋转速度孵育样品 30 分钟。接着，运行 gentle max 程序 H tumor zero three。重悬样本，并将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。如有必要，用无菌滤嘴轻轻搅拌细胞悬液，直至全部液体滤过。用5毫升QM263培养基冲洗细胞滤网，然后在300 × g离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液。如果细胞培养皿呈现红色，可能是由于存在大量组织碎片和红细胞，具体参见配套文本方案。将肿瘤细胞在Quantum 263中重新离心，并在细胞达到80%融合度时常规传代培养。使用显微镜对原代细胞培养物进行表型分析。然后从原代细胞培养物中收获少量细胞，用于RNA提取，随后进行cDNA合成，并使用针对黑色素瘤、干细胞和基质细胞标志物基因的引物进行逆转录PCR（RTPCR）。最关键的分析基因包括成纤维细胞标志物CD90、黑色素瘤和黑色素细胞标志物以及肿瘤干细胞标志物CD133、成熟树突状细胞标志物CD83，以及HPRT或GAPDH等内参基因。如果显微镜观察联合RTPCR分析显示原代黑色素瘤培养物中存在严重的成纤维细胞污染，则使用抗成纤维细胞抗体偶联的磁珠和LD柱进一步去除成纤维细胞。用预热的 PBS 洗涤汇合度为 80% 的细胞，加入适量 Accutase，孵育至细胞从培养表面脱落。用 Quantum 263 培养基收集细胞，并转移至 50 毫升离心管中。计数细胞后，取所需数量的细胞，在 300 ×g 及 4–8°C 条件下离心 5 分钟。完全吸除上清液并重悬。在最多350 µL缓冲液中重悬至多1×10⁸个细胞，加入100 µL FcR阻断试剂和50 µL CD133.1生物素。充分混匀，于4°C孵育10分钟。用10毫升Max缓冲液洗涤细胞，随后在300 ×g及4至8°C条件下离心5分钟。第二次洗涤后，彻底吸除上清液。将细胞沉淀重悬于400微升max缓冲液中。加入100微升抗生物素微珠，充分混匀，在4至8摄氏度孵育15分钟。同时，为准备用于磁性分离的max分离柱，将quadro max连接至max分离柱多联支架上。将所需数量的 LS 柱（柱翼朝前）插入 Quadro Max 的磁场中。在每个 LS 柱中放入一个预分离滤器，并配合适当的收集管。在每个柱子下方，用三毫升 Max 缓冲液冲洗滤器和柱子，弃去流出液。按照前述方法用 max 缓冲液洗涤细胞后，将细胞重悬于 500 微升 max 缓冲液中，并将细胞悬液加入已准备好的 LS 柱上。每根柱子用三毫升 max 缓冲液洗涤三次。收集未标记的 cd 1 33 阴性细胞组分的全部流出液。接下来，弃去预分离滤器。将柱子从分离器上取下，并置于合适的收集管上。加入最多5 mL的max缓冲液。立即用力将柱塞推入柱中，彻底冲洗出标记的CD133阳性细胞，以提高阴性组分的纯度。将细胞悬液加至新的平衡LS柱上，收集流出的CD133阴性组分。该切除的淋巴结转移灶取自一名晚期黑色素瘤患者。组织经机械和酶解消化后，滤过细胞的沉淀物中含有大量红细胞污染。随后，去除红细胞后获得浅棕色的细胞沉淀。这些细胞在此使用量子263培养基进行培养，该培养基适用于黑色素细胞和黑色素瘤、成纤维细胞、树突状细胞以及干细胞标记物的R-T-P-C-R分析。基因用于验证细胞来源于肿瘤组织，而非周围间质。成人黑素细胞作为泪液（tear）的正常对照细胞，而胚胎癌细胞系N-C-C-I-T作为干细胞标志物CD133的阳性对照。这些数据表明，部分原代细胞确实表达泪液（tear）标志物，因此具有黑素细胞来源的特征。该培养物对成熟树突状细胞标志物 CD83 呈阴性。有趣的是，该黑色素瘤细胞系表达 CD133，后者是细胞不对称分裂的关键基因，也是已知的肿瘤干细胞标志物。图中显示的是经成纤维细胞清除处理后仍高度污染有成纤维细胞的原代细胞培养物的明场显微图像，这些培养物代表原发性黑色素瘤细胞。

关键词：CD83，CD133，成纤维细胞清除，原代培养，黑色素瘤，肿瘤干细胞，不对称细胞分裂将原发性黑色素瘤细胞分选为CD133阳性与CD133阴性细胞。免疫荧光染色及Western印迹分析结果表明，分选效率高且纯度良好。该方法对个体化医疗具有重要意义，因为现在可利用患者来源的组织和细胞，更准确地预测每位患者对药物的个体化反应。该方法将帮助我们回答一些关键问题，例如：肿瘤起源于何处？如何对患者进行治疗？此外，它还将通过验证实验结果，帮助更好地重新定义系统生物学的研究方法。

patient-derived-cell-culture-isolation-cd133-putative-cancer-stem

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

来自患者的细胞培养和分离的CD133<sup&gt; +</sup&gt;假定的肿瘤干细胞的恶性黑色素瘤

癌症干细胞（CSCs）已在多种恶性肿瘤中被发现。本方案描述了一种流式细胞术方法，利用醛脱氢酶活性以及CD44和CD24的表达，从人胰腺导管腺癌异种移植瘤中分离癌症干细胞。这些活细胞随后可用于功能性和分析性研究。...

从人胰腺癌异种移植瘤中分离干细胞

本文介绍了从小鼠全肝脏中分离表达CD133的肝干细胞和肿瘤干细胞的方法，该过程包括组织消化、细胞富集和流式细胞术分离。我们还提供了单细胞分离和克隆扩增的先进技术方案。...

CD133+ 肝干细胞的分离与克隆扩增

本文介绍了从人胰腺导管腺癌（PDAC）组织中分离胰腺癌干细胞（CSCs）的技术。这些CSCs用于研究药物处理对肿瘤功能影响的实验研究 体外...

胰腺导管腺癌干细胞分离：一种从胰腺肿瘤中分离癌症干细胞的方法

本视频介绍了利用磁性激活细胞分选技术从原代黑色素瘤细胞系中分离CD133阴性和阳性黑色素瘤干细胞的方法。进一步研究CD133阳性的黑色素瘤肿瘤干细胞，以理解黑色素瘤发生机制。...

黑色素瘤干细胞分离：利用磁性激活细胞分选技术获取CD133阳性和阴性黑色素瘤细胞的方法

在过去的十年中，了解癌干细胞样细胞在肿瘤复发和治疗耐药性中的作用已成为备受关注的研究课题。本文描述了从头颈部鳞状细胞癌细胞系（HNSCC）中分离和鉴定癌干细胞样细胞亚群的方法。...

分离与鉴定具有干细胞特性的头颈部鳞状细胞癌亚群

本实验方案的目的是展示将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方法。...

由人黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞生成诱导性多能干细胞

本方法的目的是通过成球实验，结合功能分析以及流式细胞术和蛋白质印迹法进行表型鉴定，以可靠地鉴定癌细胞系和原代人肿瘤样本中的肿瘤干细胞（CSC）。...

从妇科及乳腺癌肿瘤中获取肿瘤干细胞球

本文描述了一套用于检测黑色素瘤转移新型候选介质及其作用机制的技术流程。...

一种用于鉴定黑色素瘤转移新介质的可靠发现平台

本文介绍了一种从黑色素瘤相关软脑膜病（M-LMD）患者脑脊液中分离循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）并进行扩增的实验方案，旨在建立用于研究M-LMD的临床前模型。...

体外 黑色素瘤患者脑脊液中循环肿瘤细胞的培养以研究黑色素瘤相关性软脑膜病

关键词：黑色素瘤，软脑膜病，循环肿瘤细胞，脑脊液，体外培养，人脑膜细胞，条件培养基，胰岛素样生长因子结合蛋白，VEGF-A，IGF信号通路，MAPK信号通路，小鼠模型，分子表征，功能分析，体内接种&#45;相关性软脑膜疾病

在此，我们介绍一种通过培养新鲜黑色素瘤组织解离后的细胞悬液来生成黑色素瘤患者来源类器官的实验方案。这些类器官能够真实地再现患者特异性的肿瘤特征 体外 为研究肿瘤免疫抑制机制、药物筛选、耐药机制及癌症监测方法提供了创新途径。...

利用黑色素瘤患者来源类器官模型揭示治疗新机遇

学习从恶性黑色素瘤患者组织中建立原代细胞培养，并通过磁珠分选技术分离CD133阳性肿瘤干细胞。该方法去除红细胞和成纤维细胞污染，获得高纯度活性细胞群体，用于个性化医疗中的药物反应预测研究。

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133⁺潜在肿瘤干细胞

探索更多视频