来自患者的细胞培养和分离的CD133 +假定的肿瘤干细胞的恶性黑色素瘤

该程序的总体目标是从恶性黑色素瘤中建立患者来源的细胞培养物，并分离出推定的 CD 1 33 阳性癌症干细胞。这是通过在从细胞沉淀中耗尽红细胞后首先从肿瘤组织中制备原代黑色素瘤单细胞来实现的。如有必要，表征原代细胞培养物并耗尽成纤维细胞。

最后一步是对 CD 1 33 阳性和 CD 1 33 阴性黑色素瘤细胞进行磁性细胞分选。最终，这种优化的 max 程序是获得高度富集和活的 CD 1 33 阳性和 CD 1 33 阴性细胞群的极好方法。我们首先使用该技术来验证个性化医学中的 insco 数据，我们试图预测癌症患者的药物反应，为此不能使用市售细胞系。

该技术的主要优点是我们可以快速获得 CD 1 33 阳性细胞，这些细胞是恶性黑色素瘤中推定的癌症干细胞。该技术将由我实验室的实验室技术员 Catherine Davis 介绍。将新鲜分离的肿瘤组织从手术中转移到含有 1% 青霉素链霉素的无菌 PBS 中的组织培养实验室。

将肿瘤组织转移到无菌培养皿中，吸出多余的溶液。然后加入 500 微升解离混合物，并使用新鲜的无菌手术刀将肿瘤切成 2 到 4 毫米的小块。现在将 2 到 4 克切碎的肿瘤组织转移到含有 5 毫升解离混合物的温和的 max C 管中。

再用 4.5 毫升解离混合物冲洗培养皿，并将剩余的组织碎片加入温和的 max C 管中。关闭试管，将其倒置连接到解离的套筒上，然后运行程序 H tumor zero one。接下来，将样品在 37 摄氏度下以最高运行速度连续旋转孵育 30 分钟。

现在将试管倒置到解离的套筒上，并运行程序 H tumor zero two。然后将样品在 37 摄氏度下以 12 RPM 连续旋转孵育 30 分钟。接下来，运行温和的 max 程序 H tumor zero three。

重悬样品，将细胞悬液通过 70 微米细胞过滤器放入 50 mL 试管中。如有必要，用无菌过滤嘴搅拌细胞悬液，直到整个悬液流过。用 5 毫升量子 2 6 3 培养基冲洗细胞过滤器，以 300 G 沉淀细胞悬液 5 分钟，弃去上清液。

如果细胞上颚由于大量的抽搐和谎言而显得已读，则红血细胞如配套文本协议中所述。在量子 2 6 3 中重新旋转肿瘤细胞，并接种培养物，当它们达到 80% 汇合时常规传代细胞。使用显微镜分析原代细胞培养物表型。

然后在 CD NA 合成后收获少量原代细胞培养物用于 RNA 提取，并使用肿瘤性黑色素瘤、干细胞和基质细胞标志基因的引物进行 R-T-P-C-R。要分析的最重要的基因是成纤维细胞标志物 CD 90、黑色素瘤和黑色素细胞标志物撕裂癌症干细胞标志物 CD 1 33、成熟树突状细胞标志物 CD 83 以及 HPRT 或 GAAP dh 等管家基因。如果显微镜和 R-T-P-C-R 联合分析显示原代黑色素瘤培养物存在高度成纤维细胞污染，则继续使用抗成纤维细胞、微珠和 LD 柱去除成纤维细胞。

用预热的 PBS 洗涤 80% 汇合细胞，加入适量的 Accutane 并孵育直至细胞从培养表面分离。在 quantum 2 6 3 培养基中收获细胞，并转移到 50 毫升试管中。对细胞进行计数，然后在 300 G 和 4 至 8 摄氏度下离心所需数量的细胞 5 分钟。

完全吸出上清液并复苏。在最大 350 μL 缓冲液中悬浮至第 10 至第八个细胞的 1 倍，加入 100 μL FCR 封闭试剂和 50 μL CD 1、33。一种生物素。

充分混合并在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。用最大 10 mL 缓冲液洗涤细胞，然后在 300 G 和 4 至 8 摄氏度下离心 5 分钟。第二次洗涤后，将上清液完全吸出。

细胞沉淀重悬于 400 μL 最大缓冲液中。加入 100 μL 抗生物素微珠并充分混合，在 4 至 8 摄氏度下孵育 15 分钟。同时，要准备用于磁分离的 max 分离器，请将 quadro max 连接到 max 分离器 multis 支架上。

将所需数量的 LS 柱插入 quadro max 的磁场中，将柱翼向前插入。将预分离过滤器放入每个 LS 柱和适当的收集管中。在每根色谱柱下，用最大 3 mL 缓冲液冲洗过滤器和色谱柱，并丢弃流出液。

如前所述，在最大缓冲液中洗涤细胞后，将细胞重悬于 500 μL 最大缓冲液中，并将细胞悬液涂在准备好的 LS 柱上。用每根柱子最大 3 mL 缓冲液洗涤 3 次。收集未标记的 cd 1 33 负细胞组分的总富度。

接下来，丢弃 pres 分离过滤器。从分离器中取出色谱柱并将其放在合适的收集管上。涂抹最多 5 毫升缓冲液。

立即将柱塞用力推入柱中，冲洗掉标记的 CD 1 33 阳性细胞，以提高阴性组分的纯度。将细胞悬液涂在新的平衡 LS 柱上，并收集流出物 CD 1 33 负馏分。这种切除的淋巴结转移是来自一名晚期黑色素瘤患者。

在组织进行机械和酶解离后，过滤细胞沉淀含有红细胞的高度污染。随后，红细胞的耗竭导致浅棕色的细胞沉淀。这些细胞在这里的量子 2 6 3 培养基中培养，黑色素细胞和黑色素瘤的 R-T-P-C-R、成纤维细胞、树突状和干细胞标志物。

基因用于验证细胞是否来源于肿瘤，而不是来自周围的基质。成体黑色素细胞作为泪液的正常对照细胞，胚胎癌细胞系 N-C-C-I-T 作为干细胞标志物 CD 1 33 的阳性对照。这些数据表明，一些原代细胞确实对泪液呈阳性，因此是黑色素细胞来源的。

培养物对成熟树突状细胞的标志物 CD 83 也呈阴性。有趣的是，这种黑色素瘤细胞系表达 CD 1 33，这是一种对不对称细胞分裂至关重要的基因，也是已知的癌症干细胞标志物。此处显示的是成纤维细胞耗竭处理后被成纤维细胞高度污染的原代细胞培养物的明场显微照片，培养物代表原代黑色素瘤细胞。

将原代黑色素瘤细胞分为 CD 1 33 阳性细胞和 CD 1 33 阴性细胞。这些来自免疫荧光、染色和 western blot 分析的数据表明分选效率高，纯度高。该方法对个性化医疗具有重大意义，因为现在我们可以使用患者来源的组织和细胞来更好地单独预测每位患者的药物反应。

这种方法将帮助我们回答关键问题，例如，肿瘤来自哪里？如何治疗患者？通过验证他们的实验，这将有助于更好地重新定义系统生物学方法。