Name: 固体支持基于膜的电 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 56 s
Description: 了解固体支持膜电生理技术用于研究电生膜转运蛋白的方法。该技术通过电容耦合检测电荷位移，适用于细菌与真核转运蛋白的动力学分析及药物筛选应用。

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感谢 J. Garcia-Celma、I Smirnova 和 R. Kaback 对 LacY 测量工作的贡献，以及 E. Bamberg 提供的支持和有益的讨论。

1. 建立基于SSM的膜片钳电生理实验装置
详细信息见于我们的两篇技术出版物中，其中包含比色皿及其装置的示意图和照片1, 2。不同的溶液交换配置和流控程序也在我们的方法学论文2中进行了讨论。
下文将补充一些近期的改进和技术细节，这些内容与视频展示直接相关。
阀门控制与数据采集
接口盒包含一个商用USB数字输出/模拟输入接口（NI USB 6009，National Instruments）以及阀门驱动器。它用于控制溶液流动，并负责数据采集。阀门通常由12 V电压驱动。然而，为了实现快速切换，阀门可使用最高达18 V的电压驱动。在本视频中，我们使用12 V电源。
阀门驱动电路板可控制四个阀门，由马克斯·普朗克生物物理研究所车间制造。阀门可通过计算机或前面板上的开关手动控制，后者在冲洗和清洁操作中尤为方便。测量过程中，通过计算机使用阀门控制与数据采集软件（SURFE2R 软件，IonGate Biosciences）来控制接口箱。
2. 准备工作
本节介绍了基于SSM的电生理实验制备的各种不同方案。
2.1 制备用于形成 SSM 的脂质溶液
<ol>
 <li>在玻璃小瓶中混合 25 μl 十八胺（氯仿中 5 mg/ml）和 375 μl 二植酰磷脂酰胆碱（氯仿中 20 mg/ml）。</li>
 <li>使用旋转蒸发仪并持续通入氮气，蒸发氯仿约 30 分钟。</li>
 <li>用 500 μl 正癸烷振荡，将脂质从玻璃小瓶壁上洗下。最终脂质浓度为 15 mg/ml，十八胺比例为 1:60（w/w）。</li>
 <li>将溶液转移至玻璃储存小瓶中，在 -20 °C 下保存脂质溶液。</li>
</ol>
2.2 参比电极的氯化处理
由于磨损，参比电极需要定期进行氯化处理。
<ol>
 <li>在氯化处理前，使用细砂纸去除残留的旧氯化银层。
 </li>
 <li>将银丝与铂电极一同放入1 M盐酸溶液中，在0.5 mA条件下氯化15分钟。氯化完成后，银丝颜色变为均匀的深灰色。</li>
</ol>
2.3 聚丙烯酰胺凝胶桥的制备
<ol>
 <li>配制含有 100 mM KPi（pH=7）、100 mM KCl 和 6% 丙烯酰胺的溶液。
 </li>
 <li>加入 0.3% 过硫酸铵（10% 储液）和 0.6% 四甲基乙二胺（TEMED），并用移液器短暂混合溶液。 </li>
 <li>混合后立即用移液器将 30 μl 混合液注入空的凝胶桥容器中。注射过程中应避免产生气泡。
 </li>
 <li>在 20 分钟的孵育时间内，凝胶完成聚合。 </li>
 <li>聚合完成后，将凝胶桥保存在溶液（100 mM KPi pH 7，100 mM KCl）中。为延长凝胶桥的使用寿命，应将其置于 4 °C 保存。 </li>
</ol>
2.4 测量溶液的制备
由于溶质与SSM之间存在强相互作用，在交换不同组成的溶液时会产生电学伪影。因此，溶液的配制是一个关键步骤。在溶液配制过程中应采取以下预防措施，以尽量减少溶液交换带来的伪影。
<ol>
 <li>使用同一批次溶液配制非激活溶液和激活溶液，并调节pH值和离子强度。
 </li>
 <li>高盐背景有助于减少溶液交换过程中产生的假象。 </li>
 <li>将该批次溶液分成两份体积。 </li>
 <li>向激活溶液中加入激活化合物。在非激活溶液中加入补偿性化合物，以尽可能保持两种溶液的渗透压和离子强度一致。 </li>
 <li>若溶液储存在4 °C条件下，务必确保所有溶液在开始测量前均已达到室温，因为即使微小的温度差异也可能产生假象。 </li>
</ol>
3. 基于SSM的电生理实验
本文介绍了一种基于固态膜（SSM）的电生理实验的典型方案。
3.1 准备 SSM 装置
当SSM装置不使用时，需用30%乙醇/水溶液填充管道，以防止细菌生长。
<ol>
 <li>安装比色皿前，用纯水冲洗系统，以清除管路中的乙醇。将乙醇容器替换为水容器。使用高压（0.6 至 1.0 bar）用 20–30 ml 水清洗系统。</li>
 <li>使用 pH 7.6 的 100 mM KPi 缓冲液或非激活溶液重复清洗程序。</li>
 <li>确保流体系统中无残留气泡。</li>
</ol>
3.2 安装比色皿
<ol>
 <li>将O形圈安装到参比电极上</li>
 <li>从储存液中取出凝胶桥，并连接参比电极。</li>
 <li>用非激活缓冲液预填充出口连接器，插入O形圈，并将凝胶桥连接到位，完成参比电极组件的组装。特别注意确保凝胶桥与出口溶液流路的连接处无气泡存在。</li>
 <li>通过安装弹簧接触针（连接放大器）、进样管（连接终端阀）、O形圈（用于SSM密封）以及螺丝，预先组装好比色皿的主体部分。</li>
 <li>使用镊子将传感器芯片从储存液（10 mM十八烷基硫醇乙醇溶液）中取出。</li>
 <li>使用移液器，用约5 ml纯乙醇冲洗残留溶液。</li>
 <li>在氮气环境下干燥电极。</li>
 <li>将传感器芯片准确放置在比色皿底座上，确保比色皿主体的进样孔对准传感器的圆形活性区域。</li>
 <li>在传感器芯片的活性区域上添加1 μl脂质溶液。确保金层被脂质完全覆盖。</li>
 <li>添加脂质溶液后立即盖上已预组装的比色皿主体部分，封闭比色皿。</li>
 <li>在将比色皿安装到法拉第屏蔽笼之前，确保所有表面完全干燥。</li>
 <li>将放大器连接至弹簧接触针，将进样管连接至终端阀，然后用螺丝将比色皿固定在法拉第屏蔽笼内。</li>
 <li>将出口连接器旋紧至比色皿顶部，最后将出口管连接至出口连接器，并将电压发生器连接至参比电极。</li>
 <li>比色皿安装完成后，立即以0.6 bar压力用缓冲液冲洗系统，从而自发形成SSM。</li>
</ol>
3.3 测量膜参数
使用函数发生器测量电容和电导，以检查 SSM 的质量。
<ol>
 <li>使用函数发生器施加 100 mV 直流电压以测量电导。</li>
 <li>计算电导：电流衰减反映了膜电容的充电过程。当电容完全充电后，根据欧姆定律，测得的电流可用于计算膜电导。为简化计算，我们采用施加电压后 1 秒时的电流值，按公式 G=I/U 计算电导。</li>
 <li>施加峰峰值为 50 mV、频率为 0.5 Hz 的三角波交流电压，以测量电容。</li>
 <li>计算电容：所得方波电流的幅值代表电容的充电电流。电容 C 等于转移电荷量 Q=IΔt 除以 ΔU=100 mV。（ΔU 为所施加 50 mV 电压的两倍，因为 I 是三角波电压正负斜率对应的差分电流。）</li>
 <li>每隔约 10 分钟重复监测膜的电学参数，持续约 30 至 40 分钟，直至参数值趋于稳定。期间使用 KPi 缓冲液在约 0.6 至 1 bar 的高压下进行冲洗。</li>
 <li>评估 SSM 膜的质量：理想参数范围为电导 0.1 至 0.2 nS，电容 2 至 3.5 nF。若电导高于 0.8 nS 且电容低于 1 nF，表明 SSM 膜未正确形成；若电容高于 4 nF，则可能表明活性区域未被 SSM 完全覆盖。</li>
 <li>若参数不在理想范围内，应弃用该膜，并使用新制备的电极芯片重新制备另一个 SSM 膜。</li>
</ol>
3.4 检查溶液交换伪影
在检查完膜参数后，应测试测量缓冲液是否存在溶液交换伪影。
<ol>
 <li>将相应的溶液容器插入流体系统。
 </li>
 <li>使用手动阀门从流体系统中去除气泡。</li>
 <li>通过数据采集软件选择您实验中要使用的流速程序。</li>
 <li>调节压力至 0.6 bar 并开始测量。</li>
 <li>除了机械阀门切换引起的伪影外，理想情况下不应检测到其他伪影电流，或其幅度应远小于预期的蛋白质转运信号。如果观察到溶液交换伪影，请在继续实验前尝试优化缓冲液组成和/或样品制备步骤。</li>
</ol>
3.5 加样蛋白样品
通常将蛋白脂质体或膜碎片在 -80 °C 下冷冻保存。每次测量需要约 30 μl 的样品量。
<ol>
 <li>用非激活溶液冲洗SSM。</li>
 <li>将蛋白质样品置于冰上解冻。</li>
 <li>进行三次10秒的超声处理，每次超声后在冰上冷却10秒。脂蛋白体使用水浴超声仪进行超声处理；对于膜碎片，则使用探头式超声仪（50W，30 kHz，超声探头直径1 mm，强度20%，占空比0.5）。最后一次超声处理后，不要将样品放回冰上，而应立即注入比色皿中。</li>
 <li>拧下出口连接器及其参比电极组件。</li>
 <li>使用移液器吸取30 μl蛋白质样品，并将移液器吸头对准出口孔安装到位。</li>
 <li>打开通往废液容器的非激活通路中的手动阀门，将脂蛋白体注入比色皿腔室。注意避免随传感器将空气注入比色皿腔室。</li>
 <li>在移除移液器吸头前，先关闭手动阀门，以防止溶液继续流动。</li>
 <li>让脂蛋白体吸附在SSM上，孵育时间为1至2小时；也可选择过夜孵育。</li>
</ol>
3.6 基于SSM实验的一般流程
<ol>
 <li>若测量缓冲液储存于 4 °C，需提前将其预热至室温。所有测量缓冲液在开始测量前必须达到室温，以避免产生干扰信号。</li>
 <li>更换溶液时，应先用无尘纸清洁溶液容器内的管路，然后插入新的试剂瓶。</li>
 <li>开始测量前，使用手动阀门排除可能在更换溶液过程中产生的气泡。</li>
 <li>在开始测量前调整压力。我们常规使用 0.6 bar 的压力，在特定的阀门和管路配置下，可获得约 1.0 ml/sec 的流速。</li>
 <li>最初的几次测量可连续进行，但应舍弃，直到峰电流保持稳定。若溶液间 pH 不同，则在开始测量前需至少孵育 3 分钟，以使蛋白脂质体内部 pH 达到平衡。</li>
 <li>此时系统已准备好进行测量。为降低噪声，至少应进行 3 次测量并取平均值。</li>
</ol>
3.7 对照测量
在一系列测量过程中，信号衰减可能由蛋白质降解或吸附损失引起。每次SSM实验都应包含衰减对照。这可通过使用相同溶液进行重复测量来实现。最简化的衰减对照是指在实验开始和结束时各进行一次测量，使用相同的溶液。
我们建议在实验中预期峰幅值最高的条件下进行衰减对照。这有助于更方便地量化信号的衰减情况。
通过比较两个衰减对照的峰值幅度，可以量化信号衰减程度。由此得到的百分比值可用于校正测量信号，前提是假设衰减具有线性时间依赖性。
3.8 伪影对照
如果可能，尝试在实验后通过抑制目标蛋白来验证您的结果。残留的信号可能是溶液交换伪影。随后必须根据测得的伪影对信号进行校正。
3.9 实验结束后
<ol>
 <li> 使用 20–30 ml 纯水和 20–30 ml 30% 乙醇/水溶液清洗系统。当系统不使用时，乙醇溶液可防止细菌生长。</li>
 <li> 完成此清洗程序后，释放系统压力并关闭所有仪器。</li>
 <li> 从法拉第笼中取出比色皿并将其拆卸。如有需要，比色皿的所有部件均可使用水和纯乙醇，并借助超声波清洗器进行清洗。</li>
 <li> 将传感器芯片置于盛有纯乙醇的玻璃烧杯中。使用超声波清洗器对烧杯超声处理约 1 至 2 分钟。</li>
 <li> 在氮气氛围下干燥传感器芯片。</li>
 <li> 将传感器芯片避光保存于 10 mM 十八烷硫醇乙醇溶液中。经过约 30 分钟的孵育后，传感器芯片即可再次使用。</li>
</ol>

<ol><li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li>
<li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli%3A+an+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li>
<li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na%2B%2Fproline+transporter+of+E.coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li>
<li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transporters%3A+charge+translocation+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li>
<li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G215R+mutation+in+the+Cl-%2FH%2B-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585(2010).</li>
<li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose%2FH%2B+symport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

1. 基于固相支撑膜（SSM）的电生理学技术相较于传统方法的优势
基于固持化膜（SSM）的电生理学已被证明是电生理工具箱中一种有价值的工具。它在传统电生理学方法（即膜片钳和电压钳技术）无法应用的情况下尤为有用：除极少数例外，由于细菌体积微小，且难以在哺乳动物细胞或卵母细胞中表达，因此细菌转运蛋白通常无法通过电压钳或膜片钳方法进行研究。但该技术也可用于研究具有生理相关性的哺乳动物转运蛋白。在此情况下，基于SSM的电生理学因其稳健性以及自动化潜力，特别适用于来自细胞内膜的转运蛋白研究，以及在药物发现中的筛选应用。
基于SSM的方法，使用传统电生理学技术对转运蛋白进行时间分辨表征具有挑战性。由于转运蛋白的周转速率较低，需要采用“巨斑片”或“全细胞”构型，而这些构型在溶液交换实验中本身具有较低的时间分辨率。这一难题可通过光解底物释放技术克服，但仅有少数底物适用于该方法。在此，SSM上的快速溶液交换提供了独特的机会，使得能够以高时间分辨率对任意底物开展电生理学研究。
2. 局限性与关键步骤
与膜片钳和电压钳技术不同，基于固态膜（SSM）的电生理学方法不能用于施加电位。因此，转运体的表征仅限于不依赖膜电位的转运模式。
通常，基于固相膜（SSM）的电生理学技术对（生电性）转运蛋白的类型没有限制。然而，如果蛋白质功能依赖于细胞内组分（如结合蛋白），则电压钳或膜片钳技术可能更具优势。
如果溶液交换产生较大的伪影电流，则可能出现局限性。当底物与SSM相互作用较强时（例如在亲脂性化合物的情况下），就会发生这种情况。可以使用伪影对照来校正测得的信号。此外，可通过在所有测量缓冲液中使用高盐背景来减少伪影。但在伪影大小与蛋白质信号相近的情况下，几乎无法将与蛋白质相关的信号从伪影中分离出来。幸运的是，在优化的溶液交换中，出现较大伪影的情况并不常见。
有几个步骤对于成功实施基于SSM的电生理实验至关重要。其中，蛋白质样品的制备是最关键的部分。如果使用蛋白脂质体，务必确保重建过程能够产生具有足够脂质蛋白比（LPR）且转运蛋白方向正确的纯净、可重复的样品。可通过冷冻断裂电子显微镜检测LPR，若有合适的抗体，也可通过ELISA实验检测蛋白方向。
仅使用针对孵育蛋白质样品具有最佳参数的SSM。蛋白质的进样是另一个关键步骤。超声处理至关重要，且在进样过程中应避免产生气泡。在样品孵育完成后，测量过程本身也非常关键，因为气泡会将吸附在传感器芯片上的蛋白质样品移除。因此，每次更换溶液后都必须去除气泡。尽管如此，仍可能出现信号衰减现象。为了校正可能发生的信号衰减，在实验过程中必须进行衰减对照。
3. 专用系统
SSM装置可根据其应用进行修改。此外，还可提供完全不同且高度专业化的装置配置。
有可能在非对称条件下检测蛋白质信号， 例如 在pH梯度条件下。为了在蛋白脂质体内外建立不对称的缓冲液组成，需要引入第三种溶液，即静息溶液，这要求采用双交换配置。此处需要额外的三通阀在非激活溶液和静息溶液之间进行切换。
为了提高系统的时间分辨率，我们开发了一种替代的流路，该流路省去了末端阀门，但使用了不同类型的比色皿。在此设置中，激活溶液与非激活溶液的交汇点位于比色皿内部，距固态膜（SSM）前方3 mm处。该装置非常适合快速转运过程的动力学分析。结果表明，系统的时间分辨率可低至2毫秒。
市面上已有商用全自动系统，旨在显著提高药物筛选的通量。该系统通过一个可移动单元在标准微孔板格式的96孔板中收集溶液，并将其注入传感器表面。

本文展示了一种基于固体支撑膜（SSM）的新型电生理学方法，用于表征生电性膜蛋白。
固体支持物由玻璃载片上的薄金层构成，即传感器芯片。亲水性的金表面用于结合烷硫醇试剂的巯基。随后，磷脂酰胆碱单层通过自组装完成SSM的形成。
为了测量膜蛋白的生电反应，将蛋白脂质体或膜片段吸附到固态支持膜（SSM）上（图1）。含有蛋白质的膜与SSM构成一个电容耦合的膜系统。因此，可通过SSM以电容耦合方式检测含蛋白膜上的电荷移位。该方法仅能获得瞬态电流，其中峰值电流代表转运体的稳态转运活性。通过电路分析可重建时间依赖性的转运体电流。
将传感器芯片安装到比色皿系统中（图2）。该比色皿具有17 μl的圆柱形样品腔（安装O形圈后的净体积）。一个弹簧接触针用于连接放大器。出口接头被旋紧在主体顶部，并固定参比电极，即一根氯化银丝。
比色皿安装在法拉第笼中，并连接至流体通路，通过快速溶液交换来诱导膜蛋白的转运活性（图3）。在单次溶液交换方案中，需要两种溶液：一种为非激活溶液，另一种为激活溶液。流体由加压空气控制，可通过计算机上的阀门控制软件或接口盒上的手动开关进行调节。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>水浴超声波破碎仪</td><td>Bandelin</td><td>RK 52 H</td><td></td></tr><tr><td>超声波探头</td><td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>二通阀</td><td>NResearch，美国韦斯特考德威尔</td><td>NR225T011</td><td></td></tr><tr><td>末端瓣膜</td><td>NResearch，美国韦斯特考德威尔</td><td>NR225T031</td><td></td></tr><tr><td>压力计</td><td>Greisinger 电子</td><td>GDH 14 AN</td><td></td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>马克斯·普朗克生物物理研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td>马克斯·普朗克生物物理研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml 溶液容器</td><td>卡特尔</td><td>1623</td><td></td></tr><tr><td>O型圈</td><td>Seal Science 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Tektronix</td><td>TDS 1002</td><td></td></tr><tr><td>参比电极</td><td>马克斯·普朗克生物物理研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>马克斯·普朗克生物物理研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管</td><td>圣戈班高性能塑料</td><td>AAC00006</td><td></td></tr><tr><td>传感器芯片</td><td>弗劳恩霍夫研究所&amp;#252;层与表面&amp;#228;细胞技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>接口盒</td><td>马克斯·普朗克生物物理研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>基思利</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>手动齿轮</td><td>Vygon GmbH</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>USB 模数转换器</td><td>国家仪器公司</td><td>6009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1,2&amp;#8209;二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3574</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR AnalaR NORMAPUR</td><td>603-002-00-5</td><td></td></tr><tr><td>天然大肠杆菌极性脂质提取物</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>100600</td><td>用于 LacY 重建</td></tr><tr><td>正癸烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D901</td><td></td></tr><tr><td>十八烷硫醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858</td><td></td></tr><tr><td>十八胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74750</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>默克</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺</td><td>BIO RAD</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;一水乳糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8783</td><td></td></tr></tbody></table>

固相支持膜电生理学简介

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

我们所介绍的电生理学方法基于一种固态支撑膜（SSM），该膜由吸附在镀金传感器芯片上的十八烷硫醇层以及其上方的磷脂酰胆碱单层组成。该组装结构被安装到含有参比电极（即氯化银丝）的比色皿系统中。
在含有目标膜蛋白的膜碎片或蛋白脂质体吸附后，通过快速溶液交换来诱导膜蛋白的转运活性。在单次溶液交换方案中，需要两种溶液：一种为非激活溶液，另一种为激活溶液。液体流动由法拉第笼内的加压空气、阀门和管路系统控制。
通过固持化膜（SSM）与蛋白脂质体或膜片段之间的电容耦合，可获得电致运输活性的动力学数据。因此，该方法仅能产生瞬态电流。峰值电流代表稳态的运输活性。通过电路分析可重建依赖时间的转运蛋白电流。
该方法特别适用于原核生物转运蛋白或来自细胞内膜的真核生物转运蛋白，这些蛋白无法通过膜片钳或电压钳技术进行研究。

迄今为止，基于SSM的电生理学技术已被用于表征超过20种转运蛋白，其中大多数来源于原核生物。 例如 MelB 3NhaA 4 和 PutP 5 （总结如下） 6）。但也包括来自细胞内膜的真核转运蛋白， 例如 ClC7 7 以及离子通道， 例如 烟碱型乙酰胆碱受体 8 已被研究。
此处以大肠杆菌（Escherichia coli）的糖/H+ 共转运蛋白 LacY 为例，介绍利用蛋白脂质体进行的测量，其中 LacY 的外向（right side out）比例至少达到 85%，脂质与蛋白比（LPR）为 5 9, 10我们重点关注构建该转运蛋白最小化动力学模型的主要步骤。
1. 野生型 LacY 的电生理表征
第一步是通过测定不同 pH 值（图 4）、底物浓度（图 5）和底物来对电化学反应进行一般性表征。为验证该技术，重现了文献中报道的 KM 值和 pK 值。
LacY 的 pH 依赖性表现出两种不同的电生反应。电容耦合电流在 pH 5 至 pH 8.5 之间增加，同时其波形也发生变化。在碱性条件下观察到稳态转运，而在酸性 pH 条件下仅保留快速的电生反应。为了区分稳态信号与快速电生反应，我们采用电路分析方法重构转运蛋白电流（图 6）。
在 pH 7 时，单相信号变为双相信号。这同样表明存在两个不同的生电反应。根据所转移的电荷量（信号的积分）估算，这两个反应分别约占转运循环总生电性的 6% 和 94%。
2. 电生反应的指认
为了将两个生电反应分配到LacY反应循环的特定步骤中，我们测定了E325A LacY突变体（图7）。该突变体仅表现出乳糖交换，但由于质子释放受阻，其所有主动运输模式均存在缺陷。E325A LacY的信号表现为一个快速瞬变信号，并且在所有测定的pH值下保持恒定。该信号的形状和幅度与酸性条件下野生型LacY的信号相似。此外，我们在下降的峰值电流之后观察到一个小的负相，这是在电容耦合系统中测得的快速瞬变电流的特征。由于乳糖的结合与释放本身不产生电效应，该快速瞬变必然与乳糖结合后发生的生电构象转变相关。
已知在乳糖浓度梯度驱动的运输模式下，质子释放步骤是 LacY 转运速率的限速步骤。在这种情况下，我们预期随着 pH 值升高（碱性增强），转运速率会增加，因为碱性环境有利于质子的释放。野生型 LacY 的稳态转运相关信号正是表现出这种现象。此外，通过 pH 梯度测量可以证明，只有细胞内 pH 值会影响 LacY 的稳态转运（未发表数据）。因此，这一显著的生电反应可归因于质子释放步骤。
3. 动力学分析的测量
在确定电生反应后，使用固持膜法（SSM）装置以约4.5毫秒的高时间分辨率测定反应在转运过程开启与关闭状态下的速率。只有当信号主要由单一反应主导时，才可能实现该测定。在此情况下，可结合信号的时间分辨率，采用迭代最小二乘去卷积算法，从瞬态电流中推导出速率常数（图8）。所确定的速率常数以及所提出的最小动力学模型（图9）最终用于转运蛋白动力学的模拟。模拟曲线能够重现SSM实验数据，进一步验证了该动力学模型的正确性。
<img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="用于SSM分析的AgCl装置与磷脂酰胆碱层的蛋白脂质体电容耦合示意图" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 蛋白脂质体在SSM上的吸附几何结构。 SSM在传感器芯片（一种结构化的金膜玻璃载片）上形成。为了测量膜蛋白的电生反应，将蛋白脂质体或膜片段吸附至SSM上。这两个膜形成一个电容耦合系统，因此仅能检测到瞬态电流。
<img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig2.jpg" alt="静态平衡示意图；用于电化学分析的传感器芯片装置及溶液流动路径。" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. SSM比色皿承载传感器芯片和参比电极。 传感器芯片夹在比色皿底座与比色皿头部之间。参比电极通过聚丙烯酰胺凝胶盐桥与流动路径隔离。
<img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="电化学装置示意图；法拉第笼中的光谱方法；PC 数据分析连接。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. SSM 装置的液体通路与电路。 在单溶液交换方案中，仅需一种非激活溶液（NA）和一种激活溶液（A）。液体流动由两个两位阀（V1）和一个终端阀（V2）控制。终端阀在非激活溶液与激活溶液之间切换，将其中一种溶液导入比色皿，另一种溶液导入废液容器（W）。传感器芯片（SSM）连接至放大器（I/U），参比电极（AgCl）则连接至外电路中的函数发生器（F）。计算机（PC）和接口盒用于控制阀门操作及数据采集。
<img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="pH依赖性电流-时间曲线图，乳糖浓度效应分析，多个pH水平。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 在不同pH值下，对野生型LacY蛋白脂质体施加100 mM乳糖浓度跃变后测得的瞬时电流。非激活溶液含有100 mM葡萄糖，而激活溶液含有100 mM乳糖。所有溶液均用100 mM磷酸钾缓冲液在指定pH条件下配制，并含1 mM DTT。有关本图及后续各图测量条件的详细信息，请参见9和10。
<img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig5.jpg" alt="不同pH值下乳糖浓度与归一化峰值电流的关系图，pH 8.5、7.6、6.6；Km数据分析。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 在不同乳糖浓度和pH值条件下，利用野生型LacY蛋白脂质体测得的归一化峰值电流的平均值。 KM 值由双曲线拟合获得。
<img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="动态电流响应；公式 \( I_P(t) \)，时间序列图，预稳态/稳态阶段分析。" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图6. 转运体电流的重建。 用于重建转运体电流 (B) 的瞬态电流 (A) 是在 pH 8.5（蓝色曲线）和 pH 5.2（红色曲线）条件下，对野生型 LacY 蛋白脂质体施加 100 mM 乳糖浓度跳跃后测得的。在 pH 8.5 时可观察到持续的翻转反应，而在 pH 5.2 时则发生快速的电致反应。这一点在重建的电流 (B) 中表现得尤为明显。
<img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg" alt="电化学反应图；公式 τ₀=(Cₚ+Cₛₛᴍ)/(Gₚ+Gₛₛᴍ)；LacY 突变体 E325A 研究。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 在 pH 5.2 条件下，对 E325A LacY 蛋白脂质体施加 100 mM 乳糖浓度跃变后测得的瞬态电流。该 LacY 突变体在转运循环的质子释放步骤中受到抑制，因此不具备转运功能。所观察到的小幅负向组分是电容耦合系统中测得的快速瞬态电流的特征，由快速电化学反应后膜电容放电引起。其时间常数 τ₀ 由系统的电容和电导决定（图 1）。
<img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="乳糖浓度对速率常数影响的动力学分析图；电流随时间变化曲线。" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. 在 pH 5.2 条件下，对野生型 LacY 蛋白脂质体施加不同浓度乳糖跳跃后测得的瞬态电流。在这些条件下未观察到稳态转运，但在乳糖结合时出现电致构象转变。虚线表示代表系统时间分辨率的传递函数。插图显示通过将观测速率常数 kobs 与数据进行双曲线拟合，确定结合与解离速率常数。观测速率常数 kobs 是通过迭代最小二乘去卷积算法从瞬态电流中确定的10。
<img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="离子转运机制示意图；pH依赖性过程；包含光谱数据分析。" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 
图9. LacY反应循环的动力学模型。 通过SSM测量可识别并表征两个电生步骤。一个强电生反应代表了反应循环中约94%的总电荷位移，仅在中性和碱性pH值下被观察到，该反应可归因于质子释放步骤（蓝色箭头）。在酸性pH条件下，当野生型LacY的持续周转受到抑制时，可观察到一个弱电生步骤。我们将此反应归因于乳糖结合引起的电生构象转变，该转变在反应循环中占总电荷位移的6%。

本文介绍一种基于固态支撑膜的电生理学方法，并重点阐述其在电致性膜转运蛋白表征中的应用。

我们所介绍的电生理学方法基于一种固体支撑膜（SSM），该膜由十八烷硫醇层通过化学吸附固定在金镀层表面构成……

因此，基于固持膜的电生理学（SSM 基础电生理学）是一种新型电生理学方法。与传统方法相比，该方法在多项应用中具有显著改进。传统电生理学的主要工具是充满电解质的微电极，而基于固相支撑膜（SSM）的电生理学则通过固相支撑膜电极检测电荷的转移。在传统电生理学无法应用的情况下，该方法极具价值，例如对于细菌转运蛋白的研究，除极少数例外情况外，这些蛋白无法通过电压钳或膜片钳技术进行研究。在这些情况下，基于SSM的电生理学方法已被证明非常成功。它还可用于研究细胞内膜中具有生理相关性的真核转运蛋白。基于SSM的电生理学实验有多种实施方式。在基础研究中，该技术可用于测定动力学参数并阐明转运机制；而其稳定性及自动化潜力使其成为靶点发现中筛选应用的理想选择。SSM电极携带一种复合膜系统，该系统由底层的SSM以及掺入的蛋白酶体或含有目标转运蛋白的膜片段组成。复合膜的电学特性可通过等效电路进行描述，在该电路中，膜构成一个电容耦合系统。需要注意的是，无论使用膜片段还是蛋白脂质体，该系统的电学行为本质上是相同的。转运蛋白中的电荷位移通过膀胱膜的电容传递至测量电路，该检测原理称为电容耦合。在典型的实验中，VSSM 上的快速溶液交换为转运蛋白 V 提供底物，随之产生的电致转运活性会生成电流，该电流通过 SSM 电容耦合至测量系统。与此同时，电致性蛋白的活性逐渐使脂质体膜带电，导致转运蛋白受到抑制，记录电路中的电流随之下降。所测得的电流是吸附在Enzo上的数百万个蛋白脂质体同时发生转运反应的结果，每个脂质体含有约100个转运蛋白。该装置由法拉第屏蔽笼、液体通路、用于阀门控制的外部电路、信号放大系统以及数据采集与分析系统组成。EC 屏蔽笼包含用于控制溶液流动的容器、阀门和管路，以及一个带有 XOR 芯片的立方体。XOR 芯片承载 SSM 电极和吸附的蛋白脂质体。该装置连接至外部电路的放大器和信号发生器。SSM 测量，引发电流，两种溶液，一种为激活溶液，另一种为非激活溶液，底物仅存在于激活溶液中。在单交换构型中，两种溶液具有相同的组成。两个两位阀控制非激活溶液和激活溶液的流动。末端阀门是一种机械耦合的三通三通阀，用于在非激活溶液和激活溶液之间切换，将其中一种溶液导向废液容器，另一种溶液导向qve。当切换末端阀门时，非激活溶液的流动被重新导向废液，而激活溶液则流向qve。该配置可实现两种溶液的同时连续流动。在流动方案的任何阶段，均可根据需要优化流动路径。但需注意，SSM 与非激活溶液和激活溶液汇合处之间的距离应尽可能缩短，因为该距离决定了溶液交换的时间进程。电源舱屏蔽笼外的电流放大器连接至一个传感器芯片。通常，放大倍数设置为每安培10的8次方至10的9次方伏特，响应时间为1至10毫秒。函数发生器连接至参比电极，计算机配备阀门控制和数据采集软件，并通过接口盒完成整个系统连接。接口盒包含阀门驱动器、数据采集系统以及数字输出硬件，溶液流路由0.22微米过滤的加压空气维持。通过数字压力计监测1 bar的压力，该压力可通过调节安装在气源与EC Cage内溶液容器之间的针阀，向钢制储气罐充气来维持。CVIC 由四个部分组成。zen 芯片夹在 vet 底座和 vet 头之间。一个圆柱形出口连接器被拧到 vet 头上，并承载参比电极组件。参比电极由一根氯化银丝组成，带有微型 SMC 连接器，并通过聚丙烯酰胺凝胶盐桥与流路隔离。不使用时，将凝胶桥组件保存在含有 100 毫摩尔氯化钾的 100 毫摩尔磷酸钾 pH 7 溶液中。首先，必须将参比电极安装到包含凝胶桥的参比电极组件中。安装参比电极时应避免产生气泡。现在将该部分的 vete 连接到已预装缓冲液的出口接头。所有连接处必须用 O 形圈密封。该SM在zor芯片上形成，zor芯片是一种表面涂有山羊膜的结构化玻璃片。该语义导线的宽度为1毫米，直径为1毫米，并通过一条0.2毫米宽的白色导电连接条与焊盘相连。一个弹簧探针与放大器建立连接。将 zen 芯片置于 10 LAR Okta Deccan 巯基乙醇溶液中避光保存。为维持其神秘的硫醇层并去除未吸附的 Okta Deccan 病毒分子，需用纯乙醇冲洗电极，并用氮气吹干。现在可组装磷胆碱单分子层。脂质溶液包含每毫升15毫克DFI胆碱和每微克每毫升250微克。Okta two A胺在衰变中，并储存在-20°C。电极现已准确放置在SA尺骨底部。将1 µL溶液加入SSM电极中，注意不要触碰到金层。添加脂质溶液后，立即组装vete。vete由O形圈密封，呈圆柱形，安装后的内部体积为17 µL。SSM 应位于入口孔的中心位置。在连接灌流装置之前，流体系统必须预先充满 100 毫摩尔磷酸钾缓冲液。必须确保管路和阀门中无气泡存在。现在可将电极安装到甲状腺日笼中，连接放大器、溶液流路的入口和出口以及函数发生器。最后，用 100 毫摩尔磷酸钾缓冲液冲洗电极。这将导致SSM自发形成，以检测SSM的质量。使用函数发生器测量电容和电导，施加100毫伏直流电压进行电导测量。电流衰减反映了膜电容器充电过程，直至电容器完全充电。通过测得的电流，利用M'S定律可得到膜电导。此处我们观察到电导为 0.17 纳西门子。电容可通过峰峰值振幅为 50 毫伏、频率约为 0.5 赫兹的三角波交流电压进行测量。所得方波电流的振幅代表电容器的判断电流。电容等于转移电荷除以施加的电压。该膜的电容为2.3纳法，高电导率和低电容表明SSM未正确形成。在这些情况下，应弃用该膜，并使用新的电极芯片制备另一个SSM。通常，含有蛋白质的脂质体需在零下80摄氏度冷冻保存。样品在冰上进行超声处理至关重要，因为聚集的样品会阻碍其在SSM上形成均匀的含蛋白脂质体悬浮液。超声处理采用三个十秒的循环，每个循环之间在冰上冷却十秒。用非激活溶液冲洗其SSM。然后将出口连接器连同样品参比电极一起拧下。使用移液器，通过vette的出口将30微升蛋白质样品注入ette体积中。首先将移液枪头安装到出口孔上。然后在非激活通路中打开上方的手动装置，并注入蛋白脂质体。在移除移液枪头之前完成上述操作。关闭上方的手动开关，以防止溶液继续流动。让蛋白脂质体在固持单层膜（SSM）上吸附，孵育时间为一至两小时。使用阀控与数据采集软件中的流控协议窗口来定义您的流控程序。如果需要在对称条件下进行测量，例如测定底物特异性、KM 值或 pH 依赖性，请选择单溶液交换方案。将每种溶液的流速持续时间设置为 0.5 到 1 秒。在整个流速方案过程中持续记录电流。扩增通常设置为10的9次方，采样率选择每秒2000个数据点。最后，将您的新协议保存为标题“NA a和a”。在流式协议窗口的第二个选项卡中，您可以定义特定阀门的开启或关闭状态，以控制非激活溶液或激活溶液通过qubit的流动。在此，我们演示了大肠杆菌中蛋白脂质体的测量方法，该蛋白为糖质子同向转运蛋白Y。激活溶液中含有被转运的底物乳糖，而非激活溶液中则含有等量但不被转运的葡萄糖作为补偿化合物。除糖类外，两种溶液均含有pH 7.6的100毫摩尔磷酸钾缓冲液和1毫摩尔二硫苏糖醇（DTT）。更换溶液后，使用手动阀门确保去除气泡。在开始流动程序之前，应在开始测量前调整压力。我们通常使用 0.6 bar 的压力，在特定的阀门和管路配置下，可产生约每秒一毫升的流速。然后在此选择一个安全的流式检测程序，即 NAA 程序，并按下启动按钮以开始每次测量。在前几次测量过程中，松散吸附的蛋白脂质体将被去除，因此峰值电流可能会下降。重复测量，直至峰值电流保持稳定。在非激活溶液流动的第一阶段，电流为零。当溶液从非激活状态转变为含有乳糖的激活溶液时，会诱导膜的生电转运活性。蛋白质的正电荷在蛋白脂质体内部积累，放大器通过固持单膜法（SSM）的正向耦合检测到一个正向瞬态电流。这种正向耦合电流称为激活溶液产生的“开启”信号V交换。返回非激活溶液时，会诱导质子糖编码从脂质体中转运出来。此时显示的是负向LY耦合电流，即蛋白质动力学分析中所谓的“关闭”信号。仅使用“开启”信号，因为“关闭”信号由于膜阀切换时的电荷状态会产生机械和电学伪迹，导致信号定义不清晰。幸运的是，这些伪迹仅限于蛋白质诱导信号出现之前的时间范围内。需要注意的是，阀切换伪迹与转运蛋白信号之间50毫秒的延迟，是溶液从末端阀传递到固持膜支持体（SSM）快速溶液交换表面所需的时间。此类在SSM上进行的操作代表了一种典型的弛豫实验。在此类实验中，电流会通过一个与时间相关的预稳态阶段，逐渐松弛至恒定的稳态。反应循环的电流动力学细节可通过预稳态电流的波形和幅值推导得出。而稳态电流则提供了关于膜蛋白持续 turnover 的信息。在蛋白脂质体与SSM（支撑性脂质膜）紧密偶联的体系中，脂质体吸附于SSM表面，其初始稳态前电流几乎保持不变。由于脂质体的充电效应，无法获得恒定的稳态电流，而是随着测量时间的推移，测得的电流逐渐减小。通过电路分析方法，可从测得的紧密偶联电流中计算出转运蛋白电流。在此，我们以 PA 值介于 8.5 至 7.6 范围内的糖质子共转运蛋白（如 Y）为例，展示典型实验结果。该转运蛋白的电流主要由反应循环后期的生电反应主导。在此条件下，前置稳态相表现为简单的电流上升至其稳态值。随后由于电容耦合而衰减。我们关注的是稳态输运电流。在无膜电位的情况下，该电流可由峰值电流很好地近似表示。因此，可以通过点印不同底物浓度下的峰值电流来分析Ali Mein动力学，但需注意，只有在同一实验中使用单个传感器获得的峰值电流幅度才能进行严格比较。其中一个原因是吸附效率的变异性。当pH进一步降低时，单相信号会变为双相信号。最后，对于运输缺陷型 lag Y 突变体，仍存在一个快速瞬变电流。该快速瞬变电流之后跟随一个微弱、较慢的负向组分。这一负向组分是在 ly 偶联系统中测得的快速瞬变电流的特征，由膜电容放电引起。此处，峰值电流并不代表稳态转运，而是离子循环早期电生性构象转变的体现。这一点之所以显现，是因为 la y 突变体不表现出稳态转运，而对于野生型 lag y，其稳态转运在低 pH 条件下受到抑制。实验结果为 lag y 反应循环中电荷移位的机制提供了阐释，该机制如动力学模型所示。在转运缺陷型突变体中观察到的快速瞬时电流，或在酸性条件下野生型 lag Y 中观察到的现象，源于较高 pH 值下乳糖结合后迅速发生的弱电生性反应；而在反应循环后期，信号主要由主要的电生性反应主导，该反应在电容耦合系统中被推测代表拟似胞质侧质子释放。这会导致由于Utes之间的强相互作用而产生代表Lag y稳态运输的瞬态电流。使用SSM时，在交换不同组成的溶液时会产生电学伪影。务必使非激活溶液和激活溶液尽可能相似，特别是在pH值和离子强度方面。应进行对照实验，因为底物本身也可能产生假象。在加入蛋白质样品前，务必使用未修饰的固态膜（SSM）对特定的缓冲体系和流动程序进行假象检测。加入蛋白质样品后，可使用含有与底物结构相似但非底物的化合物溶液进行对照测量。此外，还可以使用不含目标蛋白的脂质体或膜片段来检测底物是否存在假象。您也可以将抑制剂加入溶液中，或通过移液直接加入。在实验结束后，可将抑制剂直接注入流路出口，以检测转运蛋白信号的抑制情况，此时蛋白特异性信号将消失，仅留下溶液交换产生的假象信号。随后可轻松校正蛋白质信号。务必确保吸附的蛋白质、脂质体损失或蛋白质降解不会影响您的测量结果。通过在相同条件下进行重复的对照测量，最多达20%的信号衰减是可以接受的，并可通过假设衰减具有线性时间依赖性来进行校正。该装置是我们实验室经过20年技术发展所取得的成果。此外，我们还提供专门的系统，可用于动力学分析的高时间分辨率实验，以及针对昂贵底物的低溶液消耗实验。对于药物筛选，我们采用具有更高通量的全自动装置。迄今为止，已有超过 20 种转运蛋白通过该方法得到表征，其中包括转运型 APA、呼吸链复合物、协同转运蛋白、交换体，甚至铁离子通道。因此，当您无法通过标准电生理学方法解决研究问题时，可考虑改用 SS Mase 电生理学方法。

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