固体支持基于膜的电

所以支持基于膜的电生理学缩写为基于 SSM 的电生理学。这是一种新的电生理学方法。与传统方法相比，它为许多应用提供了显着的改进。

传统电生理学的主要工具是充满电解质的微粒电极，而其基于 M 的电生理学通过固体支撑膜电极检测电荷易位。它在无法使用常规电生理学的情况下非常有用，例如细菌转运蛋白，除了少数罕见的例外，无法通过电压钳或贴片凸轮方法进行研究。在这种情况下，基于 SSM 的电生理学已被证明非常成功。

它也可用于研究细胞内膜中生理相关的真核转运蛋白。进行基于 SSM 的电生理学实验的方法有很多。在基础研究中，它可用于确定动力学参数和阐明传输机制，但其稳健性和自动化潜力使其成为轨迹发现中筛选应用的理想选择。

SSM 电极携带一个复合膜系统，该系统由底层 SSM 和含有您目标转运蛋白的蛋白酶体或膜片段组成。复合膜的电特性可以用等效电路来描述，其中膜形成电容耦合系统。请注意，无论使用膜片段还是 protea 脂质体，系统的电行为基本相同。

运输蛋白中的电荷置换通过气囊膜的电容传输到测量电路。一种称为电容耦合的检测原理。在典型的实验中，VSSM 的快速溶液交换为转运蛋白 V 提供了底物，随后蛋白质的电转运活动产生电流，该电流通过 SSM 电容耦合到测量系统。

同时，电原蛋白活性逐渐使脂质体膜充电，导致运输蛋白受到抑制，记录电路中的电流下降，测得的电流是吸收到 Enzo 的数百万个海藻脂质体同时运输反应的结果。每个包含大约 100 个转运车。该装置包括一个带有溶液通路的法拉第笼、用于阀控制的外部电路、信号放大以及数据采集和分析。

EC 笼包括溶液流量控制所需的容器、阀门和管子，以及带有 XOR 芯片的肘。XOR 芯片携带 SSM 电极和吸收的 prot 脂质体。该 vete 连接到外部电路的放大器和函数发生器。

SSM 测量，造成火灾，两种溶液，一种活化，一种非活化，除了底物，仅存在于活化溶液中。两种解决方案在单个 exchange 配置中具有相同的组合。两个双向阀控制非活化溶液和活化溶液的流量。

终端阀是一个机械耦合的三倍三通阀，用于在非激活溶液和激活溶液之间切换，将一种溶液引导至废液容器，将另一种溶液引导至 qve。当终端阀切换时，非活化溶液的流动被重新路由到废液，而活化溶液流向 qve。这种配置允许两种溶液同时连续流动。

在流路方案期间，可以随时根据需要优化流路。但是，必须记住，SSM 与非激活和激活溶液的交界处之间的距离应尽可能短。因为它决定了解决方案交换的计时器解决方案。

Power Deck 壳体外部的电流放大器连接到传感器芯片。通常，这设置为 10 的放大率到 8 到 10 的幂，每安培 9 伏的功率和 1 到 10 毫秒的休息时间。一个函数发生器连接到参比电极和一台带有阀门控制和数据采集软件的计算机以及一个接口盒，构成了整个系统。

接口盒包含阀门驱动器的数据采集和数字输出硬件解决方案的流程由 oh 0.22 的加压空气维持。使用数字毫米计监测 1 bar 压力。可以通过针阀填充安装在 EC 笼中供气口和溶液容器之间的钢制容器来保持这种状态。

CVIC 由四个部分组成。zen 芯片夹在兽医底座和兽医头之间。圆柱形出口连接器拧到兽医头上，并承载参比电极组件。

参比电极由一根带有微型 SMC 连接器的氯化银线组成，并通过 Poly acry 凝胶盐桥与流路隔离。不使用时，凝胶桥组件储存在含有 100 毫摩尔氯化钾的 100 毫摩尔磷酸钾 pH 7 溶液中。首先，必须将参比电极安装到包含 geo 电桥的参比电极组件中。

安装参比电极时避免气泡很重要。现在，这部分 vete 连接到出口连接器上，该连接器已预先填充了缓冲溶液。所有连接都必须用 O 形圈密封。

这种 SM 是在 zor 芯片上形成的，zor 芯片是一种结构化的山羊涂层玻璃灯。这是一个直径为 1 毫米的 sematic road，通过 oh 0.2 毫米的白色接触条连接到接触垫。弹簧触针与放大器形成触点。

zen 芯片在黑暗中储存在 10 LAR Okta Deccan 硫醇乙醇溶液中。为了保持其神秘的 thi 层以去除尚未被吸收的 Okta 德干病毒分子，用纯乙醇冲洗电极，并在氮气中干燥电极。现在可以组装磷酸胆碱单层。

脂质溶液含有 15 毫克/毫升的 DFI 胆碱和 250 微克/毫升。Okta two A 矿腐烂，储存在零下 20 度。电极现在准确地放置在 SA 肘的底座上。

将 1 微升溶液添加到 SSM 电极中，而不接触金层。添加脂质溶液后，可以立即组装 vete。由 O 形圈密封的 vete 体积为圆柱形，安装时内部容积为 17 μL。

SSM 应位于入口孔下方的 Centered 位置。在连接兽医之前，必须用 100 毫摩尔磷酸钾缓冲溶液预填充液体系统。确保管道和阀门中没有气泡非常重要。

现在，兽医可以安装在甲状腺日笼中，连接放大器、溶液流路的入口和出口以及函数发生器。最后，可以用 100 毫米磷酸钾缓冲液冲洗肘。这会导致自发的 SSM 形成以检查 SSM 的质量。

电容和电导是使用函数发生器测量的，以测量电导，使用 100 毫伏直流电压。电流衰减表示电容器完全充电后薄膜电容器的充电情况。测得的电流使用 M'S 定律产生膜电导。

在这里，我们观察到 oh 0.17 纳西门子的电导。可以使用 50 毫伏峰峰值幅度的三角形交流电压和 oh 0.5 赫兹的频率来测量电容。得到的方波电流的幅度代表电容的判断电流。

电容等于转移的电荷除以施加的电压。该膜显示 2.3 纳米的电容、高电导和低电容表明 SSM 未正确形成。在这些情况下，应丢弃膜并使用新的电极芯片制备另一个 SSM。

通常，prot 脂质体在 -80 度冷冻储存。在冰上超声处理样品的 TRE 是必不可少的，因为聚集的样品将滑轮吸收到 SSM 以获得均匀的原生脂质体悬浮液。三个 10 秒的超声处理循环与冰上 10 秒的冷却间隔交替进行。

用非活化溶液冲洗他们的 SSM。然后拧下出口连接器和参比电极样品。使用移液管，将 30 微升蛋白质样品通过 vete 的出口注入 ette 体积中。

首先将移液器吸头安装到出口孔上。然后在非激活途径中打开上面的手册并注射 protea 脂质体。在降级移液器吸头之前。

合上上面的手册以防止进一步的求解流。让 protea 脂质体吸收到 SSM 中，孵育时间为 1 到 2 小时。使用阀门控制和数据采集软件的流量协议窗口来定义您的流量协议。

如果您想在对称条件下进行测量，例如测定底物特异性、KM 值或 pH 依赖性，请选择单一溶液交换方案。将每个解决方案的流持续时间设置为 oh 0.5 到 1 秒。在整个流程协议中记录电流。

放大率通常设置为 10 的 9 次方，对于采样率，我们选择每秒 2000 个数据点。最后，将您的新协议保存在标题 NA a 和 a 下。在流协议窗口的第二次点击中，您可以定义特定阀门的打开或关闭状态，以通过 qubit 控制非激活或激活解决方案的流。

在这里，我们演示了蛋白酶体脂质体的测量，糖质子输入，如来自大肠杆菌的 Y。活化溶液含有运输的底物乳糖，而非活化溶液含有与补偿化合物相同量的非运输葡萄糖。除糖外，这些溶液还含有 100 毫摩尔磷酸钾（pH 值为 7.6）和 1 毫摩尔 DTT。

更换溶液后，使用手动阀确保去除气泡。在开始流速方案之前，请在开始测量之前调整压力。我们通常使用 Ø 0.6 bar 的压力，在我们特定的阀门和管道配置下，该压力产生的流速约为每秒 1 毫升。

然后在此处选择一个安全流程协议，即 NAA 协议，然后按开始按钮开始每次测量。在最初的几次测量中松散吸收，protea 脂质体被去除，因此峰值电流可能会降低。重复测量，直到峰值电流保持不变。

在非激活溶液流的第一阶段，电流为零。从非活化溶液到含有乳糖的活化溶液的交换诱导膜的电原转运活性。蛋白质正电荷在 prote 脂质体内积累，放大器通过 SSM 检测到由于正耦合而产生的正瞬态电流。

这种正耦合电流称为来自激活解决方案的导通信号 V 交换。回到非激活溶液诱导质子糖代码从脂质体中转运出来。在这种情况下，显示负 LY 耦合电流，即所谓的蛋白质动力学分析的 off 信号。

仅使用 on 信号，因为由于膜阀开关的充电状态导致 off 信号定义不明确，从而产生机械和电气伪影。幸运的是，这些被限制在观察到蛋白质诱导信号之前的时间范围内。请注意，阀切换伪影和转运蛋白信号之间的 50 毫秒延迟是溶液需要从终端阀传播到 SSM 快速溶液交换表面的时间，例如在 SSM 上执行的实验代表了典型的弛豫实验。

在此类实验中，电流通过与时间相关的预稳态阶段弛豫，进入恒定稳态。反应循环的当前动力学细节可以从预稳态电流的形状和大小得出。而稳态电流提供有关连续膜蛋白周转的信息。

在 ly 耦合系统中，蛋白酶体脂质体被吸收到其 SSM 中，预稳态电流几乎保持不变。虽然从未获得恒定的稳态电流，而是由于脂质体的充电，测得的电流逐渐减小。转运电流可以通过电路分析从测得的 ly 耦合电流中计算出来。

在这里，我们展示了使用糖质子协同转运蛋白（如 Y 在 8.5 和 7.6 之间的 PA 范围内）的代表性结果。转运蛋白电流由反应循环后期的电原反应主导。在这些条件下，预稳态面由简单的电流上升到其稳态值组成。

然后由于电容耦合而衰减。我们对稳态传输电流感兴趣。在没有膜电位的情况下，这可以用峰值电流很好地表示。

因此，可以通过印迹不同衬底浓度的峰值电流来分析 Ali Mein 动力学，但要考虑到，只有在一次实验中从单个传感器获得峰值电流振幅时，才能严格比较峰值电流振幅。原因之一是吸收效率的可变性。当 pH 值进一步降低时，单相信号变为双相信号。

最后，对于运输缺陷的滞后 Y 突变体，仍然存在快速瞬变。快速瞬变之后是一个小的、较慢的负分量。负分量是在 ly 耦合系统中测量的快速瞬态电流的特征，由膜电容放电引起。

在这里，峰值电流并不代表稳态传输，而是离子循环早期对转变的电确认，这变得很明显，因为 la y 突变体没有显示稳态传输，而对于野生型滞后，y 稳态传输被低 pH 值抑制。实验证据提供了滞后 y 反应循环中电荷易位的机理解释，如动力学模型所示。在酸性条件下观察到的转运缺陷突变体的快速瞬变，或者在野生型滞后 Y 的情况下，是由于在较高 pH 值下乳糖结合后每周的快速生电反应，该信号由反应循环后期的主要生电反应主导，这被提议代表电容耦合系统中的假等离子质子释放。

这导致瞬态电流代表 Lag y 的稳态传输，这是由于 Ute 的强相互作用。使用 SSM，当交换不同成分的溶液时会产生电伪影。确保非活化溶液和活化溶液尽可能相似，尤其是在它们的 pH 值和离子强度方面。

应进行控制，因为基材也会产生伪影。在添加蛋白质样品之前，请务必使用裸 SSM 测试您的特定缓冲液系统和流式方案是否存在伪影。添加蛋白质样品后，可以使用含有非底物的溶液进行测量，这些底物在结构上与底物相似。

此外，有可能使用脂质体或膜片段检测底物的伪影，而没有目标蛋白质。您也可以在溶液中添加抑制剂或移液。实验后直接到出口处测量转运蛋白信号抑制，蛋白质特异性信号随后会消失，只留下溶液交换伪影。

然后可以很容易地纠正蛋白质信号。确保吸收的 prot、脂质体或蛋白质降解的损失不会影响您的测量。通过在相同条件下执行重复控制测量，高达 20% 的信号下降是可以接受的，并且可以通过假设下降的线性时间依赖性来校正。

这种设置是我们实验室 20 年技术开发的成果。此外，还提供具有更高计时器解决方案的专用系统，用于动力学分析，并为昂贵的基材提供更低的溶液消耗。对于药物筛选，我们使用具有更高通量的全自动设置。

迄今为止，已经使用这种方法表征了 20 多种转运蛋白。这些包括运输 APA、呼吸链复合物、冷却转运蛋白、交换器，甚至铁通道。因此，当您无法通过标准电生理学解决问题时，请考虑改用 SS Mase 电生理学。