斑马鱼模型的糖尿病和代谢记忆

代谢记忆的现象，其中糖尿病并发症的坚持和畅通，即使血糖正常，取得药学进展。在这里，我们描述了一个糖尿病斑马鱼模型的独特之处在于它允许参加考试的有丝分裂传播后生成分代谢记忆

该程序的总体目标是生成 1 型糖尿病斑马鱼模型，该模型可用于发现糖尿病并发症的分子基础，更重要的是，确定其持续存在的遗传基础。这是通过首先通过一系列注射糖尿病药物 STZ 来诱导高血糖，并在降低的温度下孵育鱼来实现的。接下来，三周后，确定空腹血糖水平，以确保诱导高血糖状态并停止药物以启动 β 细胞恢复。

然后，尾鳍被截肢并使其再生，以分离代谢记忆的遗传可传播成分，并消除先前高血糖环境的潜在复杂因素。最后，进行鳍再生测定以记录鳍再生的持续减少，并通过感兴趣的测定鉴定横断组织中的诱导变化。与现有模型相比，糖尿病斑马鱼模型的主要优势在于，可以在真正的 U 血糖环境夏季研究代谢记忆，而不是在胰腺移植后的患者身上看到的。

我们预计该模型将用于发现代谢记忆和糖尿病并发症持续存在的表观遗传修饰。为了生成患有糖尿病的斑马鱼，请准备一个装有正常鱼水的回收罐和一个鱼水麻醉罐，在通风橱下用两种苯氧乙醇稀释 1 到 1000 稀释。通过将 6 毫克 STZ 添加到 2 毫升 0.09% 氯化钠中来制备 0.3% 链脲佐菌素或 STZ 溶液，并立即将溶液放在单独试管中的冰上。分装足够的盐水进行控制。

鱼在配备 27 号半针头的半 CC 注射器中加入 STZ 或对照溶液，确保没有气泡被捕获。将一条鱼放入麻醉水中，等待游泳动作停止约 1 到 2 分钟，对其进行麻醉。麻醉后，将鱼短暂地放在纸巾上以吸收多余的水分，然后将鱼放在小船上称重。

接下来，将鱼放在坚硬的表面上。然后将针头穿过斜面插入腹侧腹膜的后部，并在注射后将每克 TZ 0.35 毫克或同等体积的对照溶液注射到鱼的腹膜腔中。将鱼放入回收水箱中，并监测其是否正常游泳。

注入足够的鱼进行实验后，将它们转移到正常的活鱼缸中并保持在 22 至 24 摄氏度的温度下。降低的温度对于有效诱导高血糖以诱导长时间的非常高血糖状态至关重要，在诱导阶段遵循频繁注射的时间表，然后每周维持注射，如图所示以收集血液。为了测定 FBGL，为每个含有 5 微升生理盐水的血液样品准备一个标记的 PCR 管。

麻醉鱼后，吸干多余的水，将鱼放在显微镜载玻片上，用手术刀去除鳃盖底部的头部，收集载玻片上释放的血液，并迅速将其添加到无菌、生理盐水的 PCR 管中，上下移液以确保血液不凝结立即将样品置于冰上。通过测量试管中液体的总体积并减去 5 微升生理盐水来确定血样体积。将每个 PCR 管中的 5 微升稀释血液转移到 1.5 毫升微量离心管中，并根据制造商的说明使用量子铬葡萄糖测定试剂盒测定血糖浓度。

麻醉鱼后，将其放入培养皿中，在解剖镜下，使用无菌 10 号手术刀在第一个脂质气管分支点近端切一条直线，用于测定的再生生长阶段。将鱼放入 33 摄氏度的回收箱中，对再生鳍进行成像。麻醉鱼后，张开鱼鳍使其完全伸展，并使用配备摄像头和 NIS 元件软件的解剖镜。

以 1 x 倍放大倍率收集图像以测量再生生长。打印图像并使用 Image J 软件和绘图板跟踪新生长的整个区域，以确保跟踪的准确性。确保不存在阴影或水滴，并每次测量 5 次以计算平均值。

为了标准化测量结果，沿背腹轴测量截肢部位的长度，并将先前确定的区域除以该测量值。在 21 天生成一组 DM FISH 及其对照后，确定该组子集的 FBGL，并在实验期间将 DM 鱼分成两个子组。继续每周对一组进行 STZ 注射，因为第二组的 DM 对照停止 STZ 注射并在常温下孵育鱼。

在 14 天内，这些斑马鱼将通过胰腺再生恢复正常的血液胰岛素和血糖控制。这些鱼现在被称为代谢记忆或 MM，鱼在去除药物后第 30 天截去对照 DM 和 MM 鱼的鳍，如本视频前面所示，以允许代谢记忆组织的生长。在第 60 天将鱼恢复到正常水状态进行鳍再生 30 天。

在 30 至 60 天的时间内对再生的组织进行第二次截肢，并进行鳍再生测定，分离组织并进行感兴趣的测定。1 型糖尿病斑马鱼不仅表现出已知的视网膜病变和肾病的继发性并发症，而且还表现出额外的并发症，即截肢后 72 小时可见的鳍再生受损。这种并发症之所以持续存在，是因为在高血糖期后恢复了正常血糖控制的鱼的代谢记忆，如图所示，与对照鱼相比，mm 斑马鱼的鳍再生缺陷约为 40%，并且已观察到这种损害最早在截肢后 150 天。

看完这个视频，你应该对斑马鱼如何启动高血糖状态、测量空腹血糖水平、进行鳍再生研究，并最终产生代谢记忆鱼有一个很好的了解。