Name: 斑马鱼模型的糖尿病和代谢记忆 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解利用斑马鱼模型研究1型糖尿病代谢记忆的实验方法。通过STZ诱导高血糖并进行尾鳍再生实验，探索糖尿病并发症持续存在的表观遗传机制。该模型为糖尿病治疗策略提供重要研究基础。

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本研究工作得到了Iacocca家族基金会的研究资助、Rosalind Franklin大学的启动资金以及美国国立卫生研究院资助DK092721（授予R.V.I.）的支持。作者谨此感谢Nikki Intine在稿件准备过程中提供的帮助。

所有操作均遵循《实验动物护理原则》（美国国立卫生研究院出版物编号85-23，1985年修订版）以及罗莎琳德·富兰克林大学动物护理与使用委员会批准的动物实验方案08-19进行。
本手稿中使用了两个重要缩写：1）DM：指处于急性（300 mg/dl）高血糖状态且持续至少3周的鱼类。2）MM：指曾为21天（见实验方案）DM状态的鱼类，通过胰腺再生恢复血糖控制。在停药后（14）天内即可实现血糖恢复。此后，这些鱼类即被视为MM鱼类。还需注意，文中所称的对照组鱼类在注射次数（仅注射生理盐水）、不同温度下的孵育时间以及尾鳍截断的次数和时间安排上，均与DM或MM鱼类的处理方式完全相同。
1. 糖尿病斑马鱼模型的建立，DM 鱼
<ol>
	<li>准备恢复用水和麻醉用水两个水箱。恢复用水为正常的鱼水。麻醉用水需加入足够的2-苯氧基乙醇，使其在正常鱼水中达到1:1,000的稀释比例。</li>
	<li>在通风橱内配制0.3%的链脲佐菌素（STZ）溶液：将6 mg STZ加入2 ml 0.09%氯化钠溶液中，并立即置于冰上。该溶液可供约20条鱼在20分钟内完成注射。若超过20分钟，请停止使用并重新配制新鲜的STZ溶液。另取一管分装足量生理盐水用于对照组鱼类。STZ溶解后，后续操作无需在通风橱内进行。</li>
	<li>用带有27½号针头的½ cc注射器吸取STZ或对照溶液，确保无气泡残留。</li>
	<li>将每条鱼单独放入麻醉用水中进行麻醉，待其游动停止（1–2分钟）后取出。</li>
	<li>麻醉后将鱼短暂置于纸巾上以吸去多余水分，随后放入称量舟中测定鱼体质量。</li>
	<li>将鱼放置于坚硬表面（如培养皿盖）上以进行注射。</li>
	<li>将STZ或对照溶液注射至鱼体腹腔内，进针位置为腹侧体腔后部，针头需完全穿过斜面刺入。</li>
	<li>每条鱼应接受0.35 mg/g（即350 mg/kg）剂量的STZ，所需0.3%溶液的注射体积可按以下方法计算：
	<ol class="lalpha">
		<li>将鱼的质量（g）乘以0.35，得到所需STZ的毫克数。</li>
		<li>将上述结果除以3，得到所需注射的0.3%溶液体积（单位为μl）。 
		示例：对于一条0.5 g的鱼：a) 0.5 × 0.35 = 0.175；b) 0.175 ÷ 3 = 0.058 ml = 58 μl。 
		对照组鱼应注射相同体积但不含STZ的溶液。建议预先制作一张根据鱼体质量对应注射体积的参考表以便快速查阅。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射完成后，将鱼放入恢复用水水箱中，并观察其是否恢复正常的游动行为。一旦恢复正常活动，即将鱼转移至维持在22 °C – 24 °C较低温度范围内的常规饲养水箱。此较低温度对高效诱导高血糖状态（糖尿病 mellitus，DM）至关重要。</li>
	<li>尽管首次注射后24小时内即可检测到高血糖，但为了诱导持续且显著的高血糖状态，斑马鱼需经历一个频繁注射诱导期，随后按如下所示进行每周一次的维持性注射。</li>
</ol>
第1周：3次注射（第1、3、5天），第2周：1次注射（第12天），第3周：1次注射（第19天）， 
第4周：（第21天）进行目标检测。
此时，斑马鱼被认为已处于长期高血糖状态，并表现出糖尿病视网膜病变、肾病以及鳍再生受损等并发症。这些斑马鱼被称为糖尿病模型（DM）鱼。此外，如有需要，可通过每周维持性注射使鱼体保持高血糖状态。在此过程中，预计约有5%的死亡率。
2. 血液采集与空腹血糖水平（FBGL）测定
<ol>
	<li>每组糖尿病模型鱼和对照组鱼必须包含足够数量的鱼，以准确测定该组的平均空腹血糖水平（FBGL），因为本实验需要处死这些鱼。</li>
	<li>为每个血液样本准备一个标记好的PCR管，管内加入5 μl无菌生理盐水。</li>
	<li>采集血液时，按上述方法麻醉鱼，去除所有水分，将鱼放置在载玻片上，使用解剖刀在鳃盖基部切断鱼头。</li>
	<li>收集从鱼体释放到载玻片上的血液（最多2 μl），迅速将其加入含5 μl无菌生理盐水的PCR管中，并反复吹打混匀，确保血液不发生堵塞。立即将样本置于冰上。</li>
	<li>通过测量液体总体积（生理盐水+血液）并减去5 μl生理盐水，确定血液样本的实际体积。</li>
	<li>从每个PCR管中转移5 μl稀释后的血液至1.5 ml微量离心管中，使用QuantiChrome葡萄糖检测试剂盒测定血糖浓度。操作必须严格遵循制造商提供的说明书。预期结果：正常/对照组鱼为60 mg/dl，糖尿病模型鱼为310 mg/dl。</li>
</ol>
3. 尾鳍再生研究
<ol>
	<li>按照1.0-1.4节所述方法对鱼类进行麻醉。</li>
	<li>将鱼置于培养皿盖上，在解剖显微镜下观察尾鳍，使用无菌10号手术刀在第一鳍条分支点近端沿直线截除尾鳍。</li>
	<li>参照1.10节方法让鱼恢复，但在检测的再生生长阶段将鱼置于33 °C环境中。该温度是加速鳍再生分析的既定条件。</li>
	<li>可在截除后任意时间点对鳍进行成像，但我们通常在截除后24、28和72小时常规检测再生生长情况。</li>
	<li>如前所述对鱼进行麻醉（见1.0-1.4节），将鱼置于配备相机的解剖显微镜下（我们使用配备Q-imaging相机的Nikon SMZ-1500显微镜），使用NIS elements软件在1X放大倍数下采集所有鳍图像。成像时应将鳍充分展开，使其完全伸展但不拉伸或损伤组织，并确保无水滴残留。为保持一致性，始终将背侧朝向右侧放置。</li>
	<li>打印图像，使用Image J软件和绘图板测量再生生长区域。围绕新生组织的整个区域进行描记并计算面积。每次测量应重复五次并取平均值，以确保描记的准确性。需注意所用图像不应含有阴影或水滴，因其会导致新生区域测量误差。</li>
	<li>沿背腹轴测量截除部位的长度，将3.6步中测定的面积除以该长度。此标准化方法可实现不同体型鱼类之间的直接比较。</li>
</ol>
4. 代谢记忆（MM）斑马鱼的制备
<ol>
	<li>按照第1节所述方法建立糖尿病模型（DM）鱼群及其相应的对照组。</li>
	<li>在第21天，测定部分鱼群的空腹血糖水平（FBGL），并将DM鱼分为两个亚组。对其中一组继续每周注射链脲佐菌素（STZ），作为实验全程的DM对照组；对另一组停止STZ注射，并将鱼置于正常温度条件下培养。在14天内，这些斑马鱼将通过胰腺再生恢复正常的血糖和胰岛素调控，此类鱼现称为代谢记忆鱼（MM，metabolic memory fish）。</li>
	<li>在停药后第30天，按照3.2节所述方法对对照组、DM组和MM组鱼进行尾鳍截除手术。</li>
	<li>将鱼放回正常水环境中培养30天，以促进鳍的再生。此过程生成的组织即为我们所称的“代谢记忆组织”。</li>
	<li>在第60天，对30至60天期间再生的组织内进行第二次截除手术（操作如3.2节所述），并执行尾鳍再生实验（3.1–3.7）图1。</li>
	<li>分离组织并进行目标检测。实验方案概要见表1。</li>
</ol>

<ol><li>Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathobiology+of+diabetic+complications%3A+a+unifying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism.</a> Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).</li>
<li>Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+mediate+a+cellular+%27memory%27+of+high+glucose+stress+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling.</a> Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).</li>
<li>Ceriello, A., Ihnat, M. A., Thorpe, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+review+2%3A+The+%22metabolic+memory%22%3A+is+more+than+just+tight+glucose+control+necessary+to+prevent+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Clinical review 2: The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 94, 410-415 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intensive+treatment+of+diabetes+on+the+development+and+progression+of+long-term+complications+in+insulin-dependent+diabetes+mellitus.+The+Diabetes+Control+and+Complications+Trial+Research+Group%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group.</a> N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).</li>
<li>Turner, R. C., Cull, C. A., Frighi, V., Holman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycemic+control+with+diet%2C+sulfonylurea%2C+metformin%2C+or+insulin+in+patients+with+type+2+diabetes+mellitus%3A+progressive+requirement+for+multiple+therapies+%28UKPDS+49%29.+UK+Prospective+Diabetes+Study+%28UKPDS%29+Group%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group.</a> JAMA. 281, 2005-2012 (1999).</li>
<li>Gaede, P. H., Jepsen, P. V., Larsen, J. N., Jensen, G. V., Parving, H. H., Pedersen, O. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Steno-2+study%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+multifactorial+intervention+reduces+the+occurrence+of+cardiovascular+disease+in+patients+with+type+2%22%5BJournal%5D)">The Steno-2 study.</a> Intensive multifactorial intervention reduces the occurrence of cardiovascular disease in patients with type 2. 165, 2658-2661 (2003).</li>
<li>Holman, R. R., Paul, S. K., Bethel, M. A., Matthews, D. R., Neil, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((10-year+follow-up+of+intensive+glucose+control+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1577-1589 (2008).</li>
<li>Nathan, D. M., Cleary, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+diabetes+treatment+and+cardiovascular+disease+in+patients+with+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2643-2653 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinopathy+and+nephropathy+in+patients+with+type+1+diabetes+four+years+after+a+trial+of+intensive+therapy.+The+Diabetes+Control+and+Complications+Trial%2FEpidemiology+of+Diabetes+Interventions+and+Complications+Research+Group%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group.</a> N. Engl. J. Med. 342, 381-389 (2000).</li>
<li>Ismail-Beigi, F., Craven, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intensive+treatment+of+hyperglycaemia+on+microvascular+outcomes+in+type+2+diabetes%3A+an+analysis+of+the+ACCORD+randomised+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial.</a> Lancet. 376, 419-430 (2010).</li>
<li>Duckworth, W. C., McCarren, M., Abraira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+control+and+cardiovascular+complications%3A+the+VA+Diabetes+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Glucose control and cardiovascular complications: the VA Diabetes Trial.</a> Diabetes Care. 24, 942-945 (2001).</li>
<li>Skyler, J. S., Bergenstal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+glycemic+control+and+the+prevention+of+cardiovascular+events%3A+implications+of+the+ACCORD%2C+ADVANCE%2C+and+VA+diabetes+trials%3A+a+position+statement+of+the+American+Diabetes+Association+and+a+scientific+statement+of+the+American+College+of+Cardiology+Foundation+and+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Intensive glycemic control and the prevention of cardiovascular events: implications of the ACCORD, ADVANCE, and VA diabetes trials: a position statement of the American Diabetes Association and a scientific statement of the American College of Cardiology Foundation and the American Heart Association.</a> Diabetes Care. 32, 187-192 (2009).</li>
<li>Riddle, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intensive+glucose+lowering+in+the+management+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus+in+the+Action+to+Control+Cardiovascular+Risk+in+Diabetes+%28ACCORD%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effects of intensive glucose lowering in the management of patients with type 2 diabetes mellitus in the Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes (ACCORD) trial.</a> Circulation. 122, 844-846 (2010).</li>
<li>Patel, A., Macmahon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+blood+glucose+control+and+vascular+outcomes+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patients with type 2 diabetes.</a> N. Engl. J. Med. 358, 2560-2572 (2008).</li>
<li>Engerman, R. L., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+incipient+diabetic+retinopathy+during+good+glycemic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control.</a> Diabetes. 36, 808-812 (1987).</li>
<li>Hammes, H. P., Klinzing, I., Wiegand, S., Bretzel, R. G., Cohen, A. M., Federlin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+inhibits+diabetic+retinopathy+in+the+sucrose-fed+diabetic+Cohen+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation inhibits diabetic retinopathy in the sucrose-fed diabetic Cohen rat.</a> Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2092-2096 (1993).</li>
<li>Kowluru, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+reinstitution+of+good+glycemic+control+on+retinal+oxidative+stress+and+nitrative+stress+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats.</a> Diabetes. 52, 818-823 (2003).</li>
<li>Kowluru, R. A., Chakrabarti, S., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-institution+of+good+metabolic+control+in+diabetic+rats+and+activation+of+caspase-3+and+nuclear+transcriptional+factor+%28NF-kappaB%29+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Re-institution of good metabolic control in diabetic rats and activation of caspase-3 and nuclear transcriptional factor (NF-kappaB) in the retina.</a> Acta Diabetol. 41, 194-199 (2004).</li>
<li>Roy, S., Sala, R., Cagliero, E., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+fibronectin+induced+by+diabetes+or+high+glucose%3A+phenomenon+with+a+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 404-408 (1990).</li>
<li>Li, S. L., Reddy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proatherogenic+responses+in+macrophages+and+vascular+smooth+muscle+cells+derived+from+diabetic+db%2Fdb+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Enhanced proatherogenic responses in macrophages and vascular smooth muscle cells derived from diabetic db/db mice.</a> Diabetes. 55, 2611-2619 (2006).</li>
<li>Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+Transmission+of+Diabetic+Metabolic+Memory+in+Zebrafish+Correlates+With+DNA+Hypomethylation+and+Aberrant+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression.</a> Diabetes. , (2012).</li>
<li>Dolinoy, D. C., Jirtle, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+epigenomics+in+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Environmental epigenomics in human health and disease.</a> Environ. Mol. Mutagen. 49, 4-8 (2008).</li>
<li>Morgan, D. K., Whitelaw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+transgenerational+epigenetic+inheritance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">The case for transgenerational epigenetic inheritance in humans.</a> Mamm. Genome. 19, 394-397 (2008).</li>
<li>Ho, L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling during development.</a> Nature. 463, 474-484 (2010).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Jirtle, R. L., Sander, M., Barrett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+imprinting+and+environmental+disease+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Genomic imprinting and environmental disease susceptibility.</a> Environ. Health Perspect. 108, 271-278 (2000).</li>
<li>Blomen, V. A., Boonstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+reversible+modifications%3A+maintenance+of+epigenetic+information+through+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of reversible modifications: maintenance of epigenetic information through the cell cycle.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2010).</li>
<li>Bogdanovic, O., Veenstra, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+methyl-CpG+binding+proteins%3A+developmental+requirements+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function.</a> Chromosoma. 118, 549-565 (2009).</li>
<li>Mosammaparast, N., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+histone+methylation%3A+biochemical+and+molecular+mechanisms+of+histone+demethylases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 155-179 (2010).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genomic+transgenerational+inheritance+of+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Non-genomic transgenerational inheritance of disease risk.</a> Bioessays. 29, 145-154 (2007).</li>
<li>Bjornsson, H. T., Fallin, M. D., Feinberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+epigenetic+and+genetic+approach+to+common+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">An integrated epigenetic and genetic approach to common human disease.</a> Trends Genet. 20, 350-358 (2004).</li>
<li>Whitelaw, N. C., Whitelaw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance in health and disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 273-279 (2008).</li>
<li>Reddy, M. A., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+diabetic+vascular+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in diabetic vascular complications.</a> Cardiovasc. Res. , (2011).</li>
<li>Villeneuve, L. M., Reddy, M. A., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+deciphering+its+role+in+diabetes+and+its+chronic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: deciphering its role in diabetes and its chronic complications.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 401-409 (2011).</li>
<li>Pirola, L., Balcerczyk, A., Okabe, J., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+phenomena+linked+to+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic phenomena linked to diabetic complications.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 6, 665-675 (2010).</li>
<li>Cooper, M. E., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+mechanisms+and+implications+for+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: mechanisms and implications for diabetic complications.</a> Circ. Res. 107, 1403-1413 (2010).</li>
<li>Intine, R. V., Sarras, M. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Memory+and+Chronic+Diabetes+Complications%3A+Potential+Role+for+Epigenetic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Diab.+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic Memory and Chronic Diabetes Complications: Potential Role for Epigenetic Mechanisms.</a> Curr. Diab. Rep. , (2012).</li>
<li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22, 473-478 (2006).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Mandrekar, N., Thakur, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+the+zebrafish+model+in+the+discovery+of+bioactive+molecules+from+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature.</a> Biotechnol. Lett. 31, 171-179 (2009).</li>
<li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+small%3A+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2012, 817341(2012).</li>
<li>Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limb+regeneration+is+impaired+in+an+adult+zebrafish+model+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Wound.+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus.</a> Wound. Repair Regen. 18, 532-542 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，最初以高血糖为诊断依据，最终会导致血管损伤，引发多种并发症，即使通过药物干预恢复了正常血糖水平，这些并发症仍会持续存在。这种并发症的持续现象被称为代谢记忆，近年来多项研究探讨了表观遗传机制在其中所起的作用。本文详细介绍了一种可用于建立急性糖尿病斑马鱼模型以及代谢记忆（恢复血糖控制）斑马鱼模型的实验方案。我们进一步描述了可用来区分表观遗传因素与先前糖尿病状态中潜在干扰成分影响的研究方法。需要强调的是，研究人员可在任意时间点使用任何感兴趣的检测方法对斑马鱼进行分析，因此该模型在后续发现性研究中的应用前景极为广泛。
本方案中有若干步骤需要进一步讨论和强调。根据我们的经验，0.3% STZ 溶液在配制后约20分钟内会降解并失去活性。因此，我们建议使用计时器，并每隔20分钟重新配制新鲜溶液。在我们最初尝试建立糖尿病斑马鱼模型时，仅在第一周进行一次注射，成功率约为40%。因此，三次注射并非严格必需，但若进行三次注射，成功率可超过95%。其次，在向斑马鱼注射STZ时，必须确保针头刺入时针尖斜面完全进入鱼体内，以保证溶液正确释放；但需注意避免刺入过深，以防造成内部损伤...

糖尿病（DM）是一种严重且日益严重的健康问题，可因疾病特异性的微血管（视网膜病变、肾病、神经病变、伤口愈合受损）和大血管（心脏病和中风）并发症而导致预期寿命缩短。 1一旦发生，即使血糖得到控制，糖尿病并发症仍会持续进展 2,3 这一现象被称为代谢记忆或遗留效应。在20世纪90年代初期，随着“糖尿病控制与并发症试验（Diabetes Control and Complications Trial, DCCT）”的推进，该现象在临床上被确认，并在此后得到多项其他临床试验的支持。 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14动物模型在糖尿病并发症及代谢记忆相关病理生理学研究中发挥了关键作用。事实上，糖尿病并发症的持续性最早是在犬类糖尿病视网膜病变模型中被记录，此后通过多种实验模型的大量证据进一步证实了这一现象 体外 培养系统与动物模型 15,16,17,18,19,20,21这些研究表明，初期的高血糖阶段会导致靶器官/细胞出现永久性异常（包括基因表达异常），并从机制上提示表观基因组的参与。
表观基因组包含特定细胞类型的所有染色质修饰，决定了细胞独特的基因表达谱。染色体修饰在发育过程中具有动态性，支持细胞分化，响应外界刺激，可通过有丝分裂稳定遗传22,23，并在疾病状态下发生改变24,25,26。这些表观遗传机制包括：组蛋白的翻译后修饰、八聚体中非经典组蛋白变体的掺入、通过DNA甲基化改变染色质可及性，以及通过非编码微小RNA调控基因表达27,28,29,30。总体而言，表观遗传过程使细胞或生物体能够快速响应变化的环境刺激31,32,33，同时在刺激消除后仍能使细胞“记忆”这些经历23,22。因此，由表观遗传过程引起的基因表达谱改变在初始信号消失后仍保持稳定，并可通过细胞分裂遗传，这使其作为包括代谢记忆在内的多种人类病理状态的潜在分子机制而受到广泛关注。在糖尿病（DM）与表观遗传学研究中，高血糖诱导的大量表观遗传改变导致细胞转录网络发生显著且持久的变化，这一发现与其他疾病领域的进展相呼应（详见综述34,35,36,37,38）。
斑马鱼长期以来一直是研究脊椎动物发育的首选模式生物，但在过去15年中，利用该生物研究人类疾病的应用呈指数级增长39。目前已建立了涵盖多种人类病理学的斑马鱼人类疾病模型，包括遗传性疾病和获得性疾病40,41,42。与其他脊椎动物模型生物相比，斑马鱼具有诸多优势，如繁殖力高、世代周期短、早期成体阶段身体透明、饲养成本低，以及丰富的基因操作工具。此外，由于脊椎动物之间在遗传通路和细胞生理学方面具有高度保守性，并且具备进行高通量药物筛选的能力，斑马鱼已被成功应用于药物发现。
我们利用致糖尿病药物链脲佐菌素（streptozocin）建立了一种成年斑马鱼I型糖尿病模型。我们对该模型进行了表征，结果显示糖尿病斑马鱼不仅表现出已知的人类糖尿病继发性并发症，而且由于高血糖环境的影响，其肢体再生能力（尾鳍再生）也受到损害。此外，我们报道了在停药后2周内，由于内源性胰岛β细胞的再生，高血糖斑马鱼的血糖水平可恢复至正常生理状态。然而，与此形成对比的是，这些斑马鱼的肢体再生能力仍持续受损，程度与急性糖尿病状态相同，表明该并发症具有持久性，并易受代谢记忆效应的影响。建立该模型的主要目的是提供一个研究系统，用于在消除先前高血糖环境背景干扰的情况下，探究支持代谢记忆现象的有丝分裂稳定型表观遗传组分。在完成本方案所述操作后，斑马鱼整体或特定组织可根据研究人员的需求采用任何合适的分析方法进行后续检测。我们已成功利用该流程鉴定出由高血糖诱导并在代谢记忆状态下长期维持的全基因组DNA甲基化持久性改变21。
我们认为，这种I型糖尿病斑马鱼模型在研究代谢记忆方面相较于其他模型系统具有多项创新优势：1）所有研究均可在活体（in vivo）中进行，且先前处于高血糖状态的斑马鱼可通过内源性胰岛素生成的恢复而回归正常血糖水平，无需外源性胰岛素注射。因此，可避免因依赖外源性胰岛素而导致的血糖控制波动问题。2）如上所述，先前糖尿病状态所带来的背景刺激（即晚期糖基化终末产物和活性氧物种标志物的持续存在）被消除，从而能够单独研究代谢记忆的表观遗传学因素。3）实验周期较短，从糖尿病诱导到代谢记忆检测约需80天。4）尾鳍再生在实验操作上非常便捷，易于进行遗传和实验干预，且已有大量可用工具支持。5）尾鳍再生提供了一种极为简单且可量化的评估代谢记忆的方法，有助于未来的药物筛选与发现。

<table><tbody><tr><td>链脲佐菌素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>2-苯氧乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>手术刀（10号）</td><td>Fisher Scientific</td><td>089275A</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac12; cc 注射器，带 27½ 号针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>QuantiChrome 葡萄糖检测试剂盒</td><td>Bioassay Systems</td><td>DIGL-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>TMZ-1500</td><td>任何型号的解剖显微镜均可。</td></tr><tr><td>成像用相机</td><td>Nikon</td><td>Q imaging</td><td>任何相机均可使用。</td></tr><tr><td>Image J 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>NIH Image</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>任何成像软件均可使用。</td></tr></tbody></table>

糖尿病及代谢记忆的斑马鱼模型

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

糖尿病目前影响着3.46亿人，预计到2030年这一数字将上升至4亿。来自实验室研究和大规模临床试验的证据表明，即使通过药物手段实现了血糖控制，糖尿病并发症仍会通过“代谢记忆”现象持续进展。基因表达可通过表观遗传改变而稳定变化，这种变化不仅使细胞和生物体能够快速响应不断变化的环境刺激，还赋予细胞在刺激消除后“记忆”这些经历的能力。因此，这些机制在代谢记忆现象中所起的作用目前正受到广泛研究。
我们最近报道了一种Ⅰ型糖尿病斑马鱼模型的建立，并对该模型进行了表征，结果显示糖尿病斑马鱼不仅表现出已知的继发性并发症，包括与糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病以及伤口愈合受损相关的病理变化，同时还表现出尾鳍再生能力受损。该模型的独特之处在于，斑马鱼能够再生受损的胰腺，并恢复至接近正常的血糖状态，类似于人类患者在胰腺移植后所预期的恢复情况。此外，通过多次尾鳍截断实验，可实现对纯粹表观遗传效应的分离与研究 体内 在排除先前糖尿病状态可能带来的复杂因素的情况下，尽管在胰腺再生后血糖恢复正常，但糖尿病继发的鳍再生障碍和皮肤伤口愈合缺陷仍会无限期持续。在鳍再生受损的情况下，即使在子代鳍组织中经历多轮再生，该病理特征仍然持续存在。这些现象提示，在代谢记忆状态下存在一种潜在的表观遗传机制。本文介绍了成功建立鱼类糖尿病模型及代谢记忆模型所需的方法，并讨论了该模型的优势。

I型糖尿病斑马鱼不仅表现出已知的视网膜病变和肾病等继发性并发症，还存在另一种并发症：尾鳍再生能力受损。这种并发症在经历高血糖期后恢复了正常血糖控制的斑马鱼中，由于代谢记忆的存在而持续存在。图2A（对照组）和图2B（代谢记忆组）展示了截肢后72小时再生尾鳍的代表性图像。该缺陷可被量化，如图2C所示，与对照组斑马鱼相比，糖尿病（DM）和代谢记忆（MM）斑马鱼在72小时时再生缺陷约为40%。尽管图2C中的数据截止至90天，但类似的再生缺陷在长达150天时仍可观察到。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>天数 </td>
			<td>操作步骤</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>糖尿病模型组 = STZ 注射 (350 mg/dl)，对照组 = 生理盐水注射</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>糖...

代谢记忆是指即使通过药物实现正常血糖后，糖尿病并发症仍持续进展的现象。本文描述了一种独特的糖尿病斑马鱼模型，可用于研究代谢记忆中可通过有丝分裂遗传的表观遗传组分 体内.

糖尿病目前影响着3.46亿人，预计到2030年这一数字将上升至4亿。来自实验室和临床研究的证据表明……

本实验的总体目标是建立一种1型糖尿病斑马鱼模型，可用于揭示糖尿病并发症的分子基础，更重要的是，确定其持续存在的遗传学基础。该模型的构建首先通过多次注射致糖尿病药物STZ并结合低温孵育，以诱导高血糖状态。随后，在三周后检测空腹血糖水平，以确认高血糖状态已被成功诱导，然后停止给药，以启动β细胞的恢复过程。随后，切除尾鳍并使其再生，以分离代谢记忆中可遗传的组成部分，并消除先前高血糖环境可能带来的干扰因素。最后，通过鳍再生实验记录鳍再生能力的持续下降，并利用特定检测方法鉴定截断组织中发生的变化。与其他现有模型相比，糖尿病斑马鱼模型的主要优势在于，可以在真正恢复正常血糖的环境中研究代谢记忆，类似于胰腺移植后患者体内的情况。我们期望该模型将被用于发现表观遗传修饰，这些修饰是代谢记忆及糖尿病并发症持续存在的基础。为生成糖尿病斑马鱼，需在通风橱内准备一个含有正常鱼用水的复苏缸，以及一个含有鱼用水并按1:1000比例稀释的2-苯氧乙醇麻醉缸。通过将6毫克链脲佐菌素（STREPTOZOTOCIN或STZ）加入2毫升0.09%氯化钠溶液中，配制0.3%的STZ溶液，并立即将该溶液置于另一试管中的冰上。同时分装足量生理盐水作为对照。用 27½ 号针头连接的半毫升注射器吸取链脲佐菌素（STZ）或对照溶液，确保无气泡残留。将一条鱼放入麻醉用水中进行麻醉，等待约一至两分钟直至其游动停止。麻醉后，将鱼短暂置于纸巾上以吸去多余水分，然后将鱼放入称量船中并称重。接下来，将鱼放置在坚固的表面上。然后将针头穿过斜面，插入腹膜腔后部的腹侧区域，并向鱼的腹膜腔内注射每克体重0.35毫克的TZ，或等体积的对照溶液。注射后，将鱼放入恢复用水的水箱中，并观察其是否出现正常的游动行为。完成实验所需数量的鱼类注射后，将其转移至正常的饲养水箱中，并在22至24摄氏度的温度下维持培养。降低温度对于高效诱导高血糖状态至关重要，以实现持续的严重高血糖。在诱导阶段应按照频繁注射的时间表进行操作，随后如图所示改为每周一次的维持性注射，以便采集血液。为测定空腹血糖水平（FBGL），应为每份血液样本准备一个标记好的PCR管，每管内含五微升（5 µL）生理盐水。麻醉鱼体后，吸干多余的水分，将鱼放置在载玻片上，用解剖刀在鳃盖骨基部切断头部，收集在载玻片上释放出的血液，并迅速将其加入含有5 µL无菌生理盐水的PCR管中，反复吹打混匀，防止血液立即凝固，随后立即将样品置于冰上。通过测量PCR管中液体的总体积并减去5 µL盐水体积，确定血液样本的体积。从每个PCR管中转移5 µL稀释后的血液至1.5 mL离心管中，按照试剂盒说明书使用Quantum Chrome葡萄糖检测试剂盒测定血糖浓度。将鱼麻醉后，置于培养皿中，在解剖显微镜下使用无菌的10号手术刀，于第一脂鳍分支点近端沿直线切断尾鳍，以进入实验的再生生长阶段。将鱼放入33摄氏度的恢

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JoVE Journal

Medicine

医学

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了解利用斑马鱼模型研究1型糖尿病代谢记忆的实验方法。通过STZ诱导高血糖并进行尾鳍再生实验，探索糖尿病并发症持续存在的表观遗传机制。该模型为糖尿病治疗策略提供重要研究基础。

糖尿病及代谢记忆的斑马鱼模型

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