CA同时测量人的心房肌细胞分离 +瞬变和膜电流

该程序的总体目标是分离适合同时测量钙、瞬时和膜电流的人心房肌细胞。右心房标本是从接受心脏直视手术的患者那里获得的，并迅速运输以开始手术。该程序的第一步是清洁组织并将其切成小组织块。

第二步是用蛋白水解酶对组织进行双重酶消化，产生分离的心房肌细胞。最后一步包括用钙敏感荧光染料加载肌细胞。最终，落射荧光显微镜和膜片钳技术的组合使用可同时记录具有膜电流或动作电位的钙瞬变。

该方法可以帮助了解细胞钙处理异常的分子基础 心房颤动等潜在心脏病，演示该方法将由我们实验室的高级技术员 Claudia Lira 提供，从接受心脏直视手术进行冠状动脉旁路移植术或二尖瓣置换术的患者那里获得的人体心房组织应以运输溶液的形式迅速运输到实验室。到达实验室后，将组织样本和溶液转移到 10 厘米的培养皿中。然后用剪刀粗略去除脂肪组织。

接下来，挥动组织样本。保留 200 至 600 毫克用于细胞分离，并将剩余部分冷冻在液氮中用于生化分析。将用于细胞分离的组织转移到一盘凉爽的无钙溶液中，然后将组织切成一立方毫米的块以洗涤组织。

将其与无钙溶液一起转移到带夹套的烧杯中。加热至 37 度。从带有移液器吸头盖的管路中供氧，以防止强烈冒泡。

用磁力搅拌棒小心搅拌组织约 3 分钟。然后让组织沉淀。现在小心地通过 200 微米尼龙网过滤上清液。

大部分组织应留在烧杯中。用加热的 37 度无钙溶液重新填充烧杯。然后使用镊子将过滤的组织块从网孔中返回到烧杯中，并重复洗涤程序两次。

通过准备 20 毫升加热的 37 摄氏度酶溶液 E 开始这部分程序，其中含有胶原酶和蛋白酶。在最后的洗涤步骤后，小心地过滤无钙溶液，并将洗涤过的组织重悬于 E one 溶液中。将收集在网眼上的组织放回烧杯中。

小心搅拌悬浮液 10 分钟。然后加入 40 微升 10 毫摩尔氯化钙，继续搅拌 35 分钟。接下来，通过尼龙网小心地过滤上清液。

大部分组织应留在烧杯中。准备 20 毫升酶溶液 E 2 个，其中含有胶原酶，仅 1 个，然后用它来重新填充烧杯。将收集在网眼上的组织放回烧杯中。

然后在第二次消化时立即加入 40 微升 10 毫摩尔氯化钙溶液，偶尔用剪刀切碎组织凝块。五分钟后，取悬浮液样品，在显微镜下检查细胞的解离情况。继续每 2 到 3 分钟采集一次样本，直到清晰可见杆状横纹心肌细胞。

然后停止搅拌，让组织沉淀。沉淀后，小心地将上清液通过尼龙网过滤到 50 毫升塑料管中。接下来，将组织悬浮在 20 毫升储存溶液中，并将拉紧的组织块从网眼放回烧杯中。

通过温和的机械刺激进一步解离细胞。使用 20 mL 移液器时，尽量避免气泡形成。接下来，过滤离心机后，通过尼龙网小心地过滤上清液，将两种上清液收集在 90 5G 下 10 分钟。

要沉淀细胞，通过抽吸丢弃上清液，而不会干扰沉淀复苏。在室温下将每个沉淀悬浮在 1.5 mL 储存溶液中。接下来，向每管中加入 7.5 微升 10 毫摩尔氯化钙溶液并等待 10 分钟。

然后再加入 7.5 微升氯化钙，再等待 10 分钟。等待后，加入第三个 15 微升体积的 10 毫摩尔氯化钙，使溶液中氯化钙的最终浓度达到 0.2 毫摩尔。这种分离的目的是获得适合细胞内钙测量的细胞。

因此，从储存溶液中省略任何钙缓冲液（如 EGGA）是一项关键要求。将 1.5 mL 细胞悬液转移到 2 mL 微量离心管中。在执行以下步骤时，应考虑荧光钙指示剂的光敏性。

流感 O 三。首先，制作 1 毫摩尔流感 oh 凌晨 3：00 储备溶液。该溶液可在零下 20 摄氏度下储存长达一周。

接下来，将 15 微升流感 oh 凌晨 3：00 储备液添加到 1.5 毫升细胞悬液中。小心搅拌混合物，并在室温下在不透明盒中孵育悬浮液 10 分钟。孵育后，以约 6， 000 RPM 的速度短暂离心组织。

然后弃去上清液，将沉淀重悬于 1.5 mL浴液中。在开始实验之前，将细胞悬液放置约 30 分钟进行 d 酯化。然后使用概述的方案同时进行膜片钳和 epi 荧光钙测量。

从心房组织中分离肌细胞，并在 Cell Finder 显微镜载玻片上定量。平均细胞产量清楚地表明，慢性心房颤动患者样本的细胞产量有降低的趋势。流感 oh 三个负载的肌细胞在电流钳配置中以 0.5 赫兹刺激以引发动作电位，大约 90% 的研究细胞表现出规则的收缩。

作为对这种刺激的反应，切换到荧光显微镜可视化了动作电位触发的钙从肌浆网中释放出来，从而启动了细胞收缩。来自窦性心律和心房颤动患者的代表性记录显示，sr.患者的动作电位通常呈尖峰和圆顶形状，而动作电位三角和缩短是心房重塑的典型标志。

在心房颤动患者中，同时记录的细胞内钙瞬变显示心房颤动患者心肌细胞中舒张期钙水平增加和钙瞬变振幅降低，以记录 L 型钙电流。使用 4 个氨基帕瑞丁和氯化钡阻断钾电流。在电压钳配置中，使用负 80 毫伏的保持电位，以 100 毫秒的斜坡加热至负 40 毫伏，以 100 毫秒的测试脉冲加热至 10 毫伏。

代表性记录显示，心房颤动与 L 型钙电流降低有关。同样，舒张期钙水平增加，而钙瞬时振幅较低。心房颤动。

应用非选择性 β 肾上腺受体激动剂异戊二烯增加了 L 型钙电流和胞质钙瞬变的幅度。在两组中，这表明细胞具有完整的 β 肾上腺素能信号转导级联反应。结果表明，该方法提供了高质量的耐钙肌细胞，适用于同时进行膜片钳和钙瞬时测量。

此外，获得的肌细胞可用于细胞缩短测量、免疫染色或 TTU 染色。