Name: CA同时测量人的心房肌细胞分离 +瞬变和膜电流 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学习分离人心房肌细胞并同时测量钙瞬变与膜电流的方法。该技术结合酶解消化、荧光染料负载及膜片钳技术，为研究房颤等心脏疾病的钙处理异常提供关键实验手段。

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此外，我们感谢海德堡大学的心脏外科医生提供人右心耳组织，感谢Claudia Liebetrau、Katrin Kupser和Ramona Nagel在技术上的出色支持。特别感谢Andy W. Trafford在建立Ca2+瞬变测量方法过程中提供的有益建议和指导。作者谨向德累斯顿工业大学药理学与毒理学系（负责人：Ursula Ravens）的全体成员致以最诚挚的谢意，感谢他们为我们提供了学习细胞电生理学和心肌细胞分离基本技术与技能的机会。
作者的研究得到了德国研究基金会（Do769/1-1-3）、德国联邦教育与研究部通过心房颤动卓越网络（01Gi0204）和德国心血管研究中心、欧盟通过心房颤动转化研究欧洲网络（EUTRAF，FP7-HEALTH-2010，大型综合性项目，提案编号261057）以及Leducq基金会的欧洲-北美心房颤动研究联盟（ENAFRA）资助（07CVD03）的支持。
视频文件中所示的示意图使用Servier医学艺术制作。

实验方案需经当地伦理委员会批准，所有患者均需签署书面知情同意书。本研究已获得海德堡大学曼海姆医学院伦理委员会的批准（编号：#2011-216N-MA），并严格遵守所有机构、国家及国际关于人类受试者福利的指导原则。所有患者均签署了书面知情同意书。
0. 获取人心房组织
在进行体外循环冠状动脉旁路移植术的开胸心脏手术患者中，常规插管操作时通常会切除右心耳尖端，该组织可用于心房心肌细胞的分离。切除后，立即将组织样本转移至含有无钙2+转运液的50 ml Falcon管中，转运液内含2,3-丁二酮单肟（表 I；BDM，收缩抑制剂，可防止心肌细胞挛缩）。在转运时间为30至45分钟的情况下，我们未发现冷却或氧合处理在分离心房心肌细胞的数量和质量方面具有明显优势。一般而言，应尽快将样本运送至实验室。然而，若无法避免较长的转运时间，则建议在4 °C条件下使用充氧溶液进行转运，可能更为有利。
1. 准备工作
<ol>
	<li>打开控温循环仪，该仪器用于控制夹套烧杯的温度（表 II）。确保烧杯内的温度达到 37 °C。在整个分离过程中，用玻璃盖盖住烧杯，以维持烧杯内温度恒定。</li>
	<li>将胶原酶 I 和蛋白酶 XXIV 分别称量后放入三个玻璃烧杯中，并在室温下保存。这些酶将在使用前立即稀释。</li>
	<li>将 20 ml 无 Ca2+ 溶液置于培养皿中，并在 4 °C 下保存。</li>
	<li>将 250 ml 无 Ca2+ 溶液置于 37 °C 水浴中保存。</li>
</ol>
2. 组织清洗
<ol>
	<li>将组织样本连同转运溶液一同转移至培养皿（约10 cm直径）中，使用剪刀粗略去除脂肪组织。</li>
	<li>称取组织样本质量，用于细胞分离的组织量为200至600 mg。剩余组织可置于液氮中冷冻，以备后续生化分析使用。</li>
	<li>将组织样本转移至含有20 ml无Ca2+溶液（见步骤1.3）的培养皿中，于4 °C下将组织切成约1 mm3大小的小块。</li>
	<li>以下步骤应在37 °C并持续通入100% O2的条件下进行。可将移液枪头连接至氧气管末端，以避免剧烈冒泡，实现平稳持续的气流。</li>
	<li>将组织小块连同无Ca2+溶液转移至夹套烧杯中，用磁力搅拌子轻轻搅拌约3分钟。</li>
	<li>停止搅拌，静置数秒使组织小块沉降。小心地将上清液通过尼龙滤网（200 μm，表 II）过滤。用镊子将滤网上截留的组织小块重新放回烧杯中。</li>
	<li>向烧杯中补充无Ca2+溶液，并重复步骤2.4和2.5的清洗操作两次。</li>
</ol>
3. 第一次酶解消化
<ol>
	<li>用含有胶原酶和蛋白酶的 20 ml 酶解液 E1（表 I）重悬组织块，并轻轻搅拌 10 分钟。</li>
	<li>加入 40 μl 的 10 mM CaCl2 溶液，使 Ca2+ 的终浓度为 20 μM。</li>
	<li>35 分钟后，将上清液小心地通过尼龙筛网（200 μm，表 II）过滤，使大部分组织块保留在烧杯中。将筛网上截留的组织块返回至烧杯中。</li>
</ol>
4. 第二次酶解消化
<ol>
	<li>用含有仅胶原酶 I 的 20 ml 酶溶液 E2（表 I）再次重悬组织块。立即加入 40 μl 的 10 mM CaCl2 溶液，使最终 Ca2+ 浓度为 20 μM。</li>
	<li>在第二次消化过程中，使用剪刀间歇性地进一步剪切组织凝块。</li>
	<li>5 分钟后，用巴斯德吸管取样，检查细胞解离情况。每 2–3 分钟重复一次，直至出现杆状、有横纹的心肌细胞。</li>
	<li>停止搅拌，让组织块静置沉降约 20–30 秒。</li>
	<li>小心地将上清液通过尼龙滤网（200 μm，表 II）过滤至一个 50 ml Falcon 管（A 管）中。将滤网上截留的组织块重新放回烧杯中。</li>
	<li>用 20 ml 储存液（表 I）10 重悬烧杯中的组织块，并使用带移液器的 20 ml 血清移液管进行轻柔的机械吹打，进一步解离细胞。尽量避免产生气泡，因为气泡会损害细胞存活率和质量。</li>
	<li>小心地将上清液通过尼龙滤网（200 μm，表 II）过滤至另一个 50 ml Falcon 管（B 管）中。</li>
</ol>
5. 最终制备及终末 Ca2+ 浓度的调整
<ol>
	<li>将Falcon管A和B（见步骤4.5和4.7）在95 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>小心吸弃两根离心管中的上清液，注意不要扰动沉淀。弃去上清液。</li>
	<li>分别用1.5 ml保存液（表I）重悬两个沉淀（室温）。</li>
	<li>向每个Falcon管中分两次加入各7.5 μl的10 mM CaCl2溶液，并轻轻搅拌。每步操作后孵育10分钟。</li>
	<li>再向每个管中加入15 μl的10 mM CaCl2溶液，使最终Ca2+浓度达到0.2 mM。</li>
</ol>
6. 用荧光Ca2+指示剂Fluo-3 AM负载心肌细胞（图1）
<ol>
	<li>将1.5 ml细胞悬液（管A和/或管B）转移至2 ml微量离心管（Eppendorf管）中。</li>
	<li>以下步骤应考虑荧光Ca2+指示剂Fluo-3对光的敏感性，避免光照。</li>
	<li>将50 μg Fluo-3的膜通透性乙酰氧基甲酯衍生物（Fluo-3 AM，表III）溶解于44 μl Pluronic F-127（表III）储备液（20% w/v，无水DMSO中）中，配制成1 mM的Fluo-3 AM储备液，该溶液可在-20 °C下保存最多1周。</li>
	<li>向含有1.5 ml细胞悬液的微量离心管（见步骤6.1）中加入15 μl Fluo-3 AM储备液，并轻轻混匀。</li>
	<li>将细胞悬液置于不透光的容器中，避光孵育10分钟。</li>
	<li>短暂离心，约6,000 rpm。</li>
	<li>弃去上清液，并将沉淀物重悬于1.5 ml浴液（表IV）中。</li>
	<li>在开始实验前，将细胞悬液静置约30分钟，以完成去酯化过程。</li>
</ol>
7. 同时进行膜片钳和落射荧光 Ca2+ 测量
由于膜片钳测量并非本文综述的主要内容，因此我们建议感兴趣的读者参考其他对此技术有更深入描述的文献。11-14 为完整起见，我们简要概述一种用于记录动作电位或L型Ca2+电流的实验方案，同时结合Ca2+瞬变信号的同步记录。
实验过程中，使用快速灌流系统（Octaflow IITM，ALA Scientific Instruments，NY）将心肌细胞在37 °C下用浴液（表IV）持续灌流。在电压钳实验中，通过在浴液中添加4-氨基吡啶（5 mmol/L）和BaCl2（0.1 mmol/L）以阻断K+电流。使用硼硅酸盐玻璃微电极，当充以移液管溶液（表V）时，其尖端电阻应为2–5 MΩ。除心肌细胞的Fluo-3 AM负载（见步骤6）外，Fluo-3也加入至移液管溶液中（表V）。荧光激发波长为488 nm，发射光（&lt;520 nm）被转换为[Ca2+]i，并作如下假设
<img alt="公式 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" />
 
其中，kd 为 Fluo-3 的解离常数（864 nM），F 为 Fluo-3 荧光强度；Fmax 为每次实验结束时获得的 Ca2+ 饱和荧光强度12。电生理信号与落射荧光 Ca2+ 信号同步记录。在电流钳模式下，以 0.5 Hz 频率、1 毫秒时程、1.2 倍阈值强度的电流脉冲刺激动作电位。在电压钳模式下测量 L 型 Ca2+ 电流：钳制电位为 -80 mV，先施加 100 毫秒斜坡脉冲至 -40 mV 以失活快速 Na+ 电流，随后以 0.5 Hz 频率施加 100 毫秒测试脉冲至 +10 mV。

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</ol>

Worthington Biochemical Corp. 通过承担视频文件的制作费用支持了本出版物。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件准备过程中未发挥任何作用。

本文描述了一种从接受开胸心脏手术患者获取的右心耳组织中分离人心房肌细胞的方法。为了将这些心肌细胞用于细胞质 Ca2+ 浓度的测量，我们对先前报道的方法4-11进行了改进，即在细胞保存液中省去 EGTA。
早在1970年就已发现，尽管在消化过程中存在Ca2+时心肌细胞会发生解离，但所有细胞均处于收缩状态且不可存活。16,17 因此，细胞分离需在无Ca2+溶液中进行。然而，重新引入生理浓度的Ca2+会导致Ca2+快速内流并引起细胞死亡。这一现象被称为Ca2+悖论，最初由Zimmerman和Hulsman在灌注心脏实验中观察到。18 为防止Ca2+悖论，已有多种对分离液的改良方法被提出，包括将pH值降低至7.019、添加牛磺酸20或少量Ca2+（见步骤3.2和4.1）21，以及将分离后的心肌细胞储存在含EGTA的保存液中22。17 然而，众所周知，通过EGTA进行Ca2+缓冲会降低L型Ca2+电流诱导的Ca2+瞬变幅度，并导致Ca2+瞬变呈现双相衰减特征。23 因此，为了获得具有典型特性和单相衰减特征的Ca2+瞬变，我们在整个分离过程中均未使用EGTA。为保护细胞免受Ca2+悖论的影响，我们逐步提高保存液中的最终Ca2+浓度，直至达到0.2 mM。
胶原酶的选择可能是成功分离心肌细胞最关键的一步。传统的胶原酶是从溶组织梭菌（Clostridium histolyticum）提取的粗制制剂，除胶原酶外，还含有多种蛋白酶、多糖酶和脂肪酶。根据其总体组成，胶原酶被分为不同类型。24 Worthington I型和II型胶原酶已成功用于人右心房心肌细胞的分离。4-10,15,25-30 在本研究描述的方案中，我们推荐使用I型胶原酶，尽管使用II型胶原酶也能获得足够数量的存活细胞。然而，即使是同一种类型的胶原酶，不同批次间的酶活性也存在显著差异。这些差异要求仔细筛选和测试不同批次，以优化分离流程。Worthington Biochemical Corp. 提供的在线批次筛选工具（<a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php</a>）可用于查找组成合适、已被证实适用于人右心房心肌细胞分离的可用批次。目前我们使用的I型胶原酶，其活性为250 U/mg胶原酶活性、345 U/mg酪蛋白酶活性、2.16 U/mg梭菌蛋白酶活性和0.48 U/mg胰蛋白酶活性（批号# 49H11338）。
 
 
本方法所获得的细胞可用于8小时内进行膜片钳研究、Ca2+ 瞬态测量以及两者的结合15 此外，这些细胞可用于测量在电场刺激或通过膜片钳电极进行电刺激条件下细胞的收缩反应（未发表观察结果）。

利用膜片钳技术研究心脏离子通道的电生理特性以及细胞内钙离子（Ca2+）处理异常，需要分离的心肌细胞。此外，能够利用这些技术研究来自患者的细胞，对于阐明心房颤动（AF）等心脏疾病的分子基础具有不可估量的价值1。本文描述了一种适用于膜片钳实验及同时检测细胞内Ca2+浓度的人心房肌细胞分离方法。首先，将接受开胸心脏手术患者获取的右心耳组织切成小块（“组织块法”），并用无钙溶液洗涤。随后，将组织块在含有20 μM Ca2+的胶原酶和蛋白酶溶液中进行消化。之后，通过过滤和离心收集分离的肌细胞。最后，逐步将细胞保存液中的Ca2+浓度调整至0.2 mM。我们简要讨论了分离过程中Ca2+及其缓冲体系的作用，并提供了在此类分离细胞中记录的动作电位和膜电流的代表性结果，以及与钙瞬变同步检测的数据。2+ 处理异常需要分离的心肌细胞。这些细胞通常通过以下方法获得 体外 将心脏组织样本暴露于消化酶（胶原酶、透明质酸酶、肽酶等）中。自1955年首次报道分离出有活性的心肌细胞以来2 已开发出大量用于从不同物种（包括小鼠、大鼠、兔、狗、豚鼠和人）获取单个心房和心室心肌细胞的实验方案。本综述重点介绍人的心房心肌细胞的分离方法。关于其他物种心肌细胞分离的操作步骤，可参考美国Worthington Biochemical Corp.提供的《Worthington组织解离指南》。<a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a>).
人类心房肌细胞的分离方案通常源自 Bustamante 等人et al.3 所描述的方法。本文提供了一种技术的逐步操作说明，该技术改编自先前发表的方法，旨在获得不仅适用于膜片钳实验，同时也适用于同步细胞内 Ca2+ 浓度测量的心房肌细胞。4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-b-羟基丁酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;无钙溶液&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;无钙溶液&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;无钙溶液&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;无钙溶液&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;无钙溶液&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;无钙溶液&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;无钙溶液&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>蛋白酶 XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;无钙溶液&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 7.40</td></tr><tr><td>用以下试剂调节 pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;转运溶液&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;无钙溶液&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酶溶液 E1 和 E2&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">浓度单位为 mM，另有说明者除外。BDM：2,3-丁二酮单肟。*蛋白酶 XXIV 仅包含在酶溶液 E1 中。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 I. 溶液组成。&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼龙筛网（200 &amp;#956;m）</td><td>VWR-德国</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>带夹套反应烧杯</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 II. 特殊设备。&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM（特殊包装）</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 III. 心肌细胞加载 Fluo-3 AM 所用物质。&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-氨基吡啶*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>丙磺舒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 7.35</td></tr><tr><td>用以下试剂调节 pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;灌流液&lt;/em&gt;: 1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 IV. 膜片钳实验用灌流液。&lt;/strong&gt; *4-氨基吡啶和 BaCl 仅用于电压钳实验。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-天冬氨酸钾盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;电极内液&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;电极内液&lt;/em&gt;: 0.02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;电极内液&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;电极内液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;电极内液&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;电极内液&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;电极内液&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;电极内液&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7.20</td></tr><tr><td>用以下试剂调节 pH</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 V. 膜片钳实验用电极内液*。&lt;/strong&gt; *实验当天电极内液需冰上保存直至使用。**Fluo-3 在实验当天由 1 mM 储存液加入。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人房颤肌细胞的分离以同时测量ca2+瞬变和膜电流

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

利用膜片钳技术研究心肌离子通道的电生理特性以及探索心肌细胞内 Ca2+ 调控异常，需要分离的心肌细胞。此外，利用这些技术对患者来源的心肌细胞进行研究，是阐明心房颤动（AF）等心脏疾病分子基础不可或缺的前提条件1。本文描述了一种适用于膜片钳研究及同时测量细胞内 Ca2+ 浓度的人心房肌细胞分离方法。首先，将接受开胸心脏手术患者所获取的右心耳组织切成小块（“组织块法”），并在无 Ca2+ 溶液中洗涤。随后，将组织块在含有胶原酶和蛋白酶并添加 20 μM Ca2+ 的溶液中进行消化。之后，通过过滤和离心组织悬液收集分离的心肌细胞。最后，逐步将细胞保存液中的 Ca2+ 浓度调整至 0.2 mM。我们简要讨论了分离过程中 Ca2+ 及 Ca2+ 缓冲体系的作用，并提供了在这些分离的心肌细胞中记录的动作电位和膜电流的代表性结果，以及同步进行的 Ca2+ 瞬变测量数据。

图2A展示了从分离的人右心房肌细胞中获得的三个代表性示例。为了定量细胞产量，我们将10 μl细胞悬液（步骤5.5）移液至CellFinder显微镜载玻片上（<a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a>）。图2B中的平均细胞产量结果明确表明，慢性房颤（cAF）患者样本的细胞产量有降低的趋势（SR与cAF相比，A管：16.5±3.1个细胞/10 μl（n=29） vs. 5.1±2.3个细胞/10 μl（n=10），p&lt;0.05；B管：17.9±3.9个细胞/10 μl（n=29） vs. 5.9±2.0个细胞/10 μl（n=9），p=0.107）。
动作电位测量及胞质Ca2+瞬变的同步记录的代表性示例如图3所示。在约90%的被检细胞中，动作电位触发的Ca2+释放引起明显且规律的细胞收缩。如先前报道，静息膜电位作为细胞完整性的公认指标，在SR和cAF患者中分别平均为-73.9±2.7 mV（n = 23/10 个心肌细胞/患者）和-77.7±1.8 mV（n = 19/8 个心肌细胞/患者）（p&gt;0.05）15。图4展示了电压门控L型Ca2+电流与胞质Ca2+瞬变的代表性同步记录。应用非选择性β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素（1 μM）可增加ICa,L和胞质Ca2+瞬变的幅度，提示β-肾上腺素能信号转导级联功能完整。
<img alt="图1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> 
图1. 心肌细胞Fluo-3 AM负载方案流程图（见步骤6.1–6.5）。m/v，质量/体积。
<img alt="图2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> 
图2. A，在保存液中储存一小时后分离的人右心房心肌细胞。B，在保存液中每10 μl细胞计数所得的细胞得率均值±标准误（见步骤5.5）。n 表示每组内的制备次数。*p&lt;0.05。
<img alt="图3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> 
图3. 来自窦性心律和慢性心房颤动患者心房肌细胞的动作电位触发的Ca2+瞬变（CaT）的代表性记录。顶部：用于刺激的注入膜电流（IM）（0.5 Hz）。下方：膜电位（VM）和触发的CaT（底部）的同步记录。（经Voigt 等 201215许可重绘）
<img alt="图4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> 
图4. 在窦性心律患者和慢性心房颤动患者的 心房肌细胞中，异丙肾上腺素（1 μM）对L型Ca2+电流触发的Ca2+瞬变（CaT）的代表性记录。顶部：电压钳制方案（0.5 Hz）。下方：全膜总电流（IM，主要反映L型Ca2+电流，居中）与触发的CaT（底部）的同步记录。（经Voigt等et al. 201215许可重绘）

<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="表 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> 
表 I. 溶液。
<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="表 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> 
表 II. 专用设备。
<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="表3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> 
表III. 用于心肌细胞负载 Fluo-3 AM 的物质。 
<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="表 4" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg"/> 
表 IV. 膜片钳实验用灌流液。
<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="表 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> 
表 V. 膜片钳实验用移液管溶液*。

我们描述了一种可用于结合细胞内Ca2+浓度测量与电生理膜片钳研究的人类心房肌细胞的分离方法。

人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca2+瞬变和膜电流

采用膜片钳技术研究心脏离子通道的电生理特性以及探索心肌细胞内Ca2+调控异常，需要分离的心肌细胞。此外，利用这些技术对来自患者的细胞进行研究，是阐明心房颤动（AF）等心脏疾病分子机制不可或缺的条件1。本文描述了一种适用于膜片钳实验及细胞内Ca2+浓度同步检测的人心房肌细胞分离方法。首先，将接受开胸心脏手术患者获取的右心耳组织切成小块（“组织块法”），并用无Ca2+溶液洗涤。随后，将组织块在含有20 μM Ca2+的胶原酶和蛋白酶溶液中进行消化。之后，通过过滤和离心收集分离的肌细胞。最后，逐步将细胞保存液中的Ca2+浓度调整至0.2 mM。我们简要讨论了分离过程中Ca2+及其缓冲体系的作用，并提供了在此类分离细胞中记录的动作电位和膜电流的代表性结果，同时结合了细胞内Ca2+瞬变的同步测量。

本实验的总体目标是分离出适用于同时测量钙瞬变和膜电流的人心房肌细胞。右心房组织样本取自接受开胸心脏手术的患者，并需迅速转运以开始实验操作。该实验的第一步是清洗组织并将组织切成小块。第二步是使用蛋白水解酶对组织进行双重酶消化，从而获得分离的心房肌细胞。最后一步包括将肌细胞负载钙离子敏感的荧光染料。最终，结合使用落射荧光显微镜和膜片钳技术，可同步记录钙瞬变与膜电流或动作电位。该方法有助于理解心房颤动等心脏疾病中细胞钙处理异常的分子基础。演示该方法的是本实验室高级技术员Claudia Lira。从接受冠状动脉旁路移植术或二尖瓣置换术的患者身上获取的人心房组织，应迅速置于转运液中并运送至实验室。到达实验室后，将组织样本及转运液转移至10厘米培养皿中，随后使用剪刀粗略去除脂肪组织。接下来，挥动组织样本，保留200至600毫克用于细胞分离，其余部分在液氮中速冻，以备生化分析。将用于细胞分离的组织转移至盛有冰冷无钙溶液的培养皿中，将组织切成1立方毫米大小的组织块，以洗涤组织。将其与无钙溶液一同转移至带夹套的烧杯中，在37摄氏度下加热。通过连接移液管尖端的供氧管线提供氧气，以防止产生剧烈气泡。用磁力搅拌子小心搅拌组织约三分钟，然后让组织静置沉降。接着，小心地将上清液通过200微米的尼龙滤网过滤。大部分组织应保留在烧杯中。用预热至37摄氏度的无钙溶液重新注满烧杯，然后用镊子将滤网上的组织块放回烧杯中，并重复洗涤步骤两次。从本步骤开始，先准备 20 毫升预热至 37 摄氏度的酶溶液 E1（含胶原酶和蛋白酶）。在最后一次洗涤步骤后，仔细滤除无钙溶液，并将洗涤后的组织重悬于 E1 溶液中。将滤网上收集的组织放回烧杯中。小心搅拌悬浮液10分钟。然后加入40 µL 10 mmol/L的氯化钙，继续搅拌35分钟。接着，用尼龙滤网小心过滤上清液。大部分组织应保留在烧杯中。配制 20 毫升仅含胶原酶一的酶解液 E2，并用其重新加满烧杯。将滤网收集的组织重新放回烧杯中。然后在第二次消化过程中立即加入 40 微升 10 毫摩尔/升的氯化钙溶液，并偶尔使用剪刀剪碎组织凝块。5 分钟后，取少量悬液在显微镜下检查细胞解离情况。每 2 至 3 分钟取样一次，直至清晰可见杆状横纹心肌细胞。然后停止搅拌，使组织沉淀。待其沉淀后，将上清液小心地通过尼龙滤网过滤至一个50毫升塑料离心管中。接着，将组织悬浮于20毫升保存液中，并将滤网上截留的组织块重新放回烧杯中。通过轻柔的机械吹打进一步解离细胞。使用 20 毫升移液管时，尽量避免产生气泡。接着，在离心后，将上清液小心地通过尼龙滤网过滤，两次收集的上清液均在 90 5G 条件下离心 10 分钟。为沉淀细胞，通过抽吸弃去上清液，注意不要扰动沉淀物。将每个沉淀物在室温下用1.5毫升保存液重悬。接着，向每根试管中加入7.5微升10毫摩尔/升的氯化钙溶液，并静置10分钟。然后加入7.5 µL氯化钙，再等待10分钟。等待结束后，加入第三份15 µL的10 mmol/L氯化钙溶液，使溶液中氯化钙的终浓度达到0.2 mmol/L。该分离的目的是获得适用于细胞内钙离子检测的细胞。因此，储存溶液中必须避免使用任何钙缓冲剂，例如 EGTA。将 1.5 毫升细胞悬液转移至 2 毫升微量离心管中。以下步骤应考虑荧光钙指示剂对光敏感的特性来进行操作。三氟化铁。首先，配制1毫摩尔的三氟化铁储备液。该溶液可在-20摄氏度下保存长达一周。随后，向1.5毫升细胞悬液中加入15微升的Fluoh 3:00 AM储备溶液。轻轻混匀后，将悬液置于不透光的盒子中，室温孵育10分钟。孵育结束后，将样品短暂离心，转速约为6,000 RPM。然后弃去上清液，并将沉淀重悬于 1.5 毫升浴液中。在开始实验前，将细胞悬液静置约 30 分钟以完成去酯化。随后按照所述方案进行同步膜片钳和落射荧光钙成像测量。从心房组织中分离心肌细胞，并在细胞计数载玻片上通过显微镜进行定量。平均细胞产量结果明确表明，来自慢性心房颤动患者的样本细胞产量呈下降趋势。将Fluo-3负载的心肌细胞在电流钳模式下以0.5赫兹进行刺激以诱导动作电位，约90%被检测的细胞表现出规律性收缩。在此刺激下，通过切换至荧光显微镜可观察到由动作电位触发的肌浆网钙离子释放，从而启动细胞收缩。来自窦性心律和心房颤动患者的代表性记录显示，患者的心房动作电位通常呈现尖峰和圆顶状形态，而动作电位的三角化及缩短则是心房重构的典型特征。心房颤动患者的细胞内钙瞬变同步记录显示，与非心房颤动患者相比，心房颤动患者的心肌细胞舒张期钙水平升高，钙瞬变幅度降低，用于记录L型钙电流。通过使用4-氨基吡啶和氯化钡阻断钾电流。在电压钳制模式下，细胞以0.5赫兹频率进行刺激，钳制电位为-80毫伏，先施加100毫秒的斜坡脉冲至-40毫伏，再施加100毫秒的测试脉冲至10毫伏。代表性记录显示，心房颤动与L型钙电流降低相关。此外，舒张期钙水平升高，而钙瞬变幅度则降低。在心房颤动中。应用非选择性β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素可增加L型钙电流幅度和胞质钙瞬变。在两组实验中，这一结果提示细胞具有完整的β肾上腺素信号转导级联反应。结果表明，该方法可获得高质量的耐钙心肌细胞，适用于同时进行膜片钳和钙瞬变测量。此外，所获得的心肌细胞可用于细胞缩短测量、免疫染色或横管系统（TTU）染色。

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本文演示了从小鼠成年个体中分离窦房结心肌细胞（SAMs）的方法，可用于膜片钳电生理学或成像研究。分离的细胞可直接使用，也可在培养中维持，以实现目的蛋白（如基因编码报告蛋白）的表达。...

从小鼠成年心脏窦房结分离、培养及功能表征心肌细胞的方法

本方案描述了利用具有高时间分辨率和空间分辨率的光学标测系统对小鼠心房进行电生理学评估的方法，包括通过特制电极导管进行程序化刺激，同步记录膜电位和Ca2+瞬变信号。...

小鼠心房的高分辨率光学标测电生理学评估

本文介绍了一种经过优化的基于兰根多夫（Langendorff）系统的分离方法，用于从与代谢综合征相关且射血分数保留的心力衰竭大鼠模型中分离单个心房心肌细胞。通过手动调节心脏腔室的管腔内压力，可获得功能完整的肌细胞，适用于兴奋-收缩耦联研究。...

从代谢综合征相关射血分数保留型心力衰竭大鼠模型中分离心房心肌细胞

本方案采用组织块消化法从成年小鼠心脏中分离单个心房心肌细胞。该方法可用于分离右心房或左心房心肌细胞，进而用于膜片钳实验中对心房心肌细胞电生理特性的表征研究。...

从成年小鼠中分离心房心肌细胞

本文介绍了一种从振动切片机切割的心肌薄片中分离人和动物心室心肌细胞的实验方案。仅需少量组织（&lt;50...

从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

本方案描述了对朗根多夫（Langendorff）方法的改进，包括主动脉插管的深度，以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室肌细胞。...

对Langendorff法的改良以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室心肌细胞

学习分离人心房肌细胞并同时测量钙瞬变与膜电流的方法。该技术结合酶解消化、荧光染料负载及膜片钳技术，为研究房颤等心脏疾病的钙处理异常提供关键实验手段。

人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca²⁺瞬变和膜电流

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