人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca²⁺瞬变和膜电流

本实验的总体目标是分离出适用于同时测量钙瞬变和膜电流的人心房肌细胞。右心房组织样本取自接受开胸心脏手术的患者，并需迅速转运以开始实验操作。该实验的第一步是清洗组织并将组织切成小块。

第二步是使用蛋白水解酶对组织进行双重酶消化，从而获得分离的心房肌细胞。最后一步包括将肌细胞负载钙离子敏感的荧光染料。最终，结合使用落射荧光显微镜和膜片钳技术，可同步记录钙瞬变与膜电流或动作电位。

该方法有助于理解心房颤动等心脏疾病中细胞钙处理异常的分子基础。演示该方法的是本实验室高级技术员Claudia Lira。从接受冠状动脉旁路移植术或二尖瓣置换术的患者身上获取的人心房组织，应迅速置于转运液中并运送至实验室。到达实验室后，将组织样本及转运液转移至10厘米培养皿中，随后使用剪刀粗略去除脂肪组织。

接下来，挥动组织样本，保留200至600毫克用于细胞分离，其余部分在液氮中速冻，以备生化分析。将用于细胞分离的组织转移至盛有冰冷无钙溶液的培养皿中，将组织切成1立方毫米大小的组织块，以洗涤组织。

将其与无钙溶液一同转移至带夹套的烧杯中，在37摄氏度下加热。通过连接移液管尖端的供氧管线提供氧气，以防止产生剧烈气泡。

用磁力搅拌子小心搅拌组织约三分钟，然后让组织静置沉降。接着，小心地将上清液通过200微米的尼龙滤网过滤。

大部分组织应保留在烧杯中。用预热至37摄氏度的无钙溶液重新注满烧杯，然后用镊子将滤网上的组织块放回烧杯中，并重复洗涤步骤两次。

从本步骤开始，先准备 20 毫升预热至 37 摄氏度的酶溶液 E1（含胶原酶和蛋白酶）。在最后一次洗涤步骤后，仔细滤除无钙溶液，并将洗涤后的组织重悬于 E1 溶液中。将滤网上收集的组织放回烧杯中。

小心搅拌悬浮液10分钟。然后加入40 µL 10 mmol/L的氯化钙，继续搅拌35分钟。接着，用尼龙滤网小心过滤上清液。

大部分组织应保留在烧杯中。配制 20 毫升仅含胶原酶一的酶解液 E2，并用其重新加满烧杯。将滤网收集的组织重新放回烧杯中。

然后在第二次消化过程中立即加入 40 微升 10 毫摩尔/升的氯化钙溶液，并偶尔使用剪刀剪碎组织凝块。5 分钟后，取少量悬液在显微镜下检查细胞解离情况。每 2 至 3 分钟取样一次，直至清晰可见杆状横纹心肌细胞。

然后停止搅拌，使组织沉淀。待其沉淀后，将上清液小心地通过尼龙滤网过滤至一个50毫升塑料离心管中。接着，将组织悬浮于20毫升保存液中，并将滤网上截留的组织块重新放回烧杯中。

通过轻柔的机械吹打进一步解离细胞。使用 20 毫升移液管时，尽量避免产生气泡。接着，在离心后，将上清液小心地通过尼龙滤网过滤，两次收集的上清液均在 90 5G 条件下离心 10 分钟。

为沉淀细胞，通过抽吸弃去上清液，注意不要扰动沉淀物。将每个沉淀物在室温下用1.5毫升保存液重悬。接着，向每根试管中加入7.5微升10毫摩尔/升的氯化钙溶液，并静置10分钟。

然后加入7.5 µL氯化钙，再等待10分钟。等待结束后，加入第三份15 µL的10 mmol/L氯化钙溶液，使溶液中氯化钙的终浓度达到0.2 mmol/L。该分离的目的是获得适用于细胞内钙离子检测的细胞。

因此，储存溶液中必须避免使用任何钙缓冲剂，例如 EGTA。将 1.5 毫升细胞悬液转移至 2 毫升微量离心管中。以下步骤应考虑荧光钙指示剂对光敏感的特性来进行操作。

三氟化铁。首先，配制1毫摩尔的三氟化铁储备液。该溶液可在-20摄氏度下保存长达一周。

随后，向1.5毫升细胞悬液中加入15微升的Fluoh 3:00 AM储备溶液。轻轻混匀后，将悬液置于不透光的盒子中，室温孵育10分钟。孵育结束后，将样品短暂离心，转速约为6,000 RPM。

然后弃去上清液，并将沉淀重悬于 1.5 毫升浴液中。在开始实验前，将细胞悬液静置约 30 分钟以完成去酯化。随后按照所述方案进行同步膜片钳和落射荧光钙成像测量。

从心房组织中分离心肌细胞，并在细胞计数载玻片上通过显微镜进行定量。平均细胞产量结果明确表明，来自慢性心房颤动患者的样本细胞产量呈下降趋势。将Fluo-3负载的心肌细胞在电流钳模式下以0.5赫兹进行刺激以诱导动作电位，约90%被检测的细胞表现出规律性收缩。

在此刺激下，通过切换至荧光显微镜可观察到由动作电位触发的肌浆网钙离子释放，从而启动细胞收缩。来自窦性心律和心房颤动患者的代表性记录显示，患者的心房动作电位通常呈现尖峰和圆顶状形态，而动作电位的三角化及缩短则是心房重构的典型特征。

心房颤动患者的细胞内钙瞬变同步记录显示，与非心房颤动患者相比，心房颤动患者的心肌细胞舒张期钙水平升高，钙瞬变幅度降低，用于记录L型钙电流。通过使用4-氨基吡啶和氯化钡阻断钾电流。在电压钳制模式下，细胞以0.5赫兹频率进行刺激，钳制电位为-80毫伏，先施加100毫秒的斜坡脉冲至-40毫伏，再施加100毫秒的测试脉冲至10毫伏。

代表性记录显示，心房颤动与L型钙电流降低相关。此外，舒张期钙水平升高，而钙瞬变幅度则降低。在心房颤动中。

应用非选择性β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素可增加L型钙电流幅度和胞质钙瞬变。在两组实验中，这一结果提示细胞具有完整的β肾上腺素信号转导级联反应。结果表明，该方法可获得高质量的耐钙心肌细胞，适用于同时进行膜片钳和钙瞬变测量。

此外，所获得的心肌细胞可用于细胞缩短测量、免疫染色或横管系统（TTU）染色。