活细胞周期分析果蝇组织使用同调声聚焦流式细胞仪Vybrant的DyeCycle紫DNA染色

该程序的总体目标是测量果蝇中细胞群遗传作并用 GFP 或 RFP 标记的细胞群的相对细胞周期阶段和细胞大小。首先建立遗传杂交，以产生含有用所需荧光蛋白标记的细胞的后代，并在特定组织或细胞群中进行所需的基因作。在研究中，从适当发育阶段的后代中干净地分离出所需的组织，然后将组织解离成单细胞悬液，并用活的 DNA 染料染色以测量 DNA 含量。

通过流式细胞术分析染色的解离样品。最终，体内结果测量了由所研究的基因作引起的细胞大小和细胞周期期的变化。与使用紫外线染料对活果蝇组织进行流式细胞术的现有方法相比，该技术的主要优点是染料循环紫色染料与含有紫色 4 0 5 激光器的较便宜的台式细胞仪兼容，该细胞可以以少量预算购买并保持在单个实验室规模上。

这种方法可以通过提供有关细胞周期阶段和细胞大小的信息来帮助回答细胞周期领域中的关键问题，这些信息比仅仅测量整体组织大小和增殖速率更详细。演示该程序的是我实验室的研究生 Kagel 和 Dan Sun 以及 Olga Guko。我们的技术人员 在产卵后约 110 至 120 小时收集第三个幼虫龄的成熟幼虫，以进行幼虫解剖。

准确的瞳孔分期对于过程中的研究至关重要，因为这种收获白色前蛹在开始时，如有必要，我将蛹的台面密封培养皿或一小瓶幼虫在 37 摄氏度的水浴中以激活热量。用于谱系追踪克隆的 Chuck 翻转碱基。打开培养皿的密封后，将其放入培养箱中，使其老化至所需的瞳孔解剖发育阶段。

轻轻抓住蛹的瞳孔前尖端，那里有气泡，以免损坏里面的蛹，定位漂浮的蛹以正确抓取。然后用微型剪刀将蛹的后尖以一个小角度朝向动物的背部干净利落地切开，以释放内部压力，而不会迫使蛹的脂肪进入胸部和头部的所需组织，沿着背侧正中小心地切割，避免损坏翅膀和前眼脑复合物清洗以去除他的脂肪。然后用镊子抓住瞳孔表皮的后缘并将其从瞳孔盒中拉出，将瞳孔从瞳孔盒中取出。

将解剖的蛹转移到干净的解剖皿中。用镊子在眼脑复合体前方的角质层上戳一个小孔。使用带有橡胶球的玻璃糊状移液器。

通过部分解剖的蛹轻轻洗涤 PBS 解剖液，以去除任何残留的 His 化脂肪和肠道组织。为了获得瞳孔翅膀，用一个镊子和第二个镊子将蛹压在头部。抓住翅膀角质层的最后端，将其从胴体侧面拉出并移出。

然后在铰链处剪下或拉掉翅膀，将其从身体中取出，并将其堆成一堆，远离尸体和其他材料，以获得瞳孔、眼睛或大脑。清洗蛹，直到眼脑复合体脱落并从蛹中脱离。使用镊子轻轻地将瞳孔从大脑中拉开并保存所需的组织 使用润滑的过去移液器，小心地转移解剖的组织。

将试管在 23 摄氏度下以 500 RPM 振荡孵育 70 分钟。然后以中等速度轻轻涡旋 5 秒钟，并将样品放回摇床中再放置 15 至 20 分钟。以中等速度再次涡旋采样 5 秒，用于大脑和瞳孔。

超过 36 小时。A PF 在 23 摄氏度下以 500 RPM 的 DNA 染色溶液解离组织 45 至 60 分钟。然后，将大块组织与约 50 μL DNA 染色溶液一起转移到解剖皿中，逐个手动解离。

用手动拉过大约 100 至 150 微米开口的移液器快速上下移液。将解离的标本汇集在 5 毫升试管中。在 23 摄氏度下再孵育 30 分钟，并以 500 RPM 的速度摇动。

目视验证样品是否已完全解离。注意无细胞透明瞳孔翅角质层不会结合。通过将样品加载到细胞仪上来开始传真分析。

然后选择通道以检测指示细胞大小和膜复杂性的前向散射和侧向散射。为了检测 DNA 的 D 循环紫色染色，您需要测量紫色激光激发的 VL 高度、宽度和面积。同时选择蓝色激光通道一个区域来测量 GFP 荧光。

对于 RFP 分析，我们使用蓝色激光通道 3。attune 上的此通道针对 RFP 检测进行了优化。设置门以将分析限制为选定的群体，并限制碎片并出售来自分析的团块，该分析使用门一生成终止图，在 VL 一面积与 VL 一的图中排除 SSC 与 FSC 图中的碎片和团块，使用 GA 二排除未染色的细胞、sub G 1、凋亡细胞和细胞团块基于单重体的鉴定。

GA 3 包含门 1 和 2 内的细胞，这些细胞在基于 VE L 1 高度的荧光与 DNA 含量的关系图上为 GFP 阴性。接下来，步态 4 包含门 1 和 2 内的细胞，这些细胞在荧光与 DNA 含量的关系图上为 GFP 阳性。还可以从 GFP 与前向散射测量的细胞大小的点图生成门 5 和 6。

要检查细胞周期定相，请使用两个直方图，它们在 x 轴上绘制 DNA 含量，在 Y ais 上绘制门 3 和门 4 定义的群体的细胞计数。对于细胞大小，直方图将种群设置为门 5 和 6，并在 x 轴上绘制 FSC，在 Y 轴上绘制计数，当运行样品时将记录设置为在 10， 000 处停止。GFP 阳性事件也将采集体积设置为 300 μL。

提供的模板中包含相应的阈值和电压设置。以每分钟 100 μL 的标准或高灵敏度运行样品并记录。Attune 软件生成的记录数据文件为 FCS 格式，与大多数细胞周期建模软件兼容。

这个包含四个点图和两个直方图的代表性工作区显示了在后翅表达 GFP 和细胞周期蛋白 D 的幼虫翅样品，由 Grailed gal four 转基因驱动。步态 1 的细胞大小的第一个点图排除了碎片和团块。第二个点图区分步态为 2 的单体，以排除未染色的细胞、亚 G 1D NA 含量和 GFP 与 DNA 含量图中的团块。

可以区分 GFP 阴性细胞和阳性细胞，并且根据沿 x 轴的位置明显显示两个 N 和四个 NDNA 含量。通过 GFP 测量的细胞大小与前向散射的关系图用于生成门 5 和 6。所得分析可得出 GFP 或 RFP 阴性群体以及 GFP 或 RFP 阳性细胞的 DNA 含量与计数的关系直方图。

使用提供的 RFP 模板。使用相同的组织类型和表达模式可获得相似的结果。对于 RFP，提供的模板和电压适用于分析幼虫的眼睛、大脑和翅膀，以及瞳孔、大脑和翅膀。

在 attuned 软件中。对细胞周期或细胞大小直方图使用自动缩放功能可以确定每个群体的全局最大值。这些细胞周期谱代表在后部表达 GFP 的幼虫眼中的 GFP 阳性和阴性细胞。

使用 GMR GAL 四个 U-A-S-G-F-P 转基因，叠加揭示了后表达 GFP 的细胞周期相位的差异。也可以绘制 GFP 阳性和阴性细胞之间细胞大小的相对变化。该细胞周期图谱来自 46 小时 A PF 时的瞳孔大脑。GFP 阳性细胞是表达 G one S 调节因子、细胞周期蛋白 D 和 E two F 的谱系示踪克隆，可破坏静止并导致进入 S 期。

这与不表达的 GFP 阴性细胞形成鲜明对比，后者在这个阶段通常被阻滞。在 G 1 中，attune 软件在直方图上生成用户定义的区域，描绘 G 1 s 和 G 2 相。每次运行的统计表确定用户定义的区域和百分比内细胞的绝对计数。

或者，可以使用建模软件（如 mod fit）来估计每个阶段以及凋亡细胞的百分比。观看此视频后，您应该对如何从果蝇中分离和标记多个组织以进行细胞周期分析有很好的了解。