活细胞周期分析 果蝇 使用Attune声学聚焦流式细胞仪和Vybrant DyeCycle Violet DNA染料进行组织分析

本实验的总体目标是测量果蝇中经遗传操作并用GFP或RFP标记的细胞群体在特定组织中的相对细胞周期时相和细胞大小。首先建立遗传杂交组合，以获得子代，其中目标组织或细胞群体被标记上所需的荧光蛋白并完成所需的遗传操作。随后，从适当发育阶段的子代中精确分离出目标组织，将其解离为单细胞悬液，并使用可穿透活细胞的DNA染料进行染色，以测定DNA含量。

通过流式细胞术分析染色后的解离样品。最终，体内实验结果可检测到由所研究的遗传操作引起的细胞大小和细胞周期时相的变化。与现有的使用紫外染料对活体果蝇组织进行流式细胞术的方法相比，该技术的主要优势在于，细胞周期紫染料可与价格较低的台式细胞仪兼容，这类细胞仪配备405 nm紫色激光器，采购成本低，适合单个实验室规模配置和维护。

该方法可通过提供比仅测量整体组织大小和增殖速率更为详细的细胞周期时相和细胞大小信息，帮助解答细胞周期领域的关键问题。演示该实验操作的人员为本实验室的研究生Kagel、Dan Sun以及技术员Olga Guko。在卵孵化后约110至120小时，收集处于三龄幼虫期的成熟幼虫，用于幼虫解剖。

精确的蛹期分期对于变态过程中的研究至关重要。如有必要，在变态开始时采集这种白色的预蛹。将装有蛹的密封培养皿或装有幼虫的小管置于37摄氏度水浴中，以激活热敏感的克隆谱系追踪系统。打开培养皿密封后，将其放入培养箱中，使发育至所需龄期，以便进行蛹眼组织解剖。

轻轻捏住蛹体前端蛹壳处的气泡位置，以避免损伤内部的蛹体，并调整漂浮的蛹体以便正确抓握。然后用显微剪刀以略微倾斜的角度从蛹体后端朝向动物背侧干净地剪断，以释放内部压力，防止将脂肪挤入胸部和头部所需组织中。接着沿背侧中线小心剪开，注意避免损伤翅和前部眼脑复合体，清洗以去除脂肪。随后用镊子夹住蛹表皮的后缘，将蛹从蛹壳中拉出。

将解剖好的蛹转移至洁净的解剖皿中。用镊子在复眼-脑复合体前方的角质层上刺一个小孔。使用带橡胶吸头的玻璃巴斯德吸管。

用 PBS 解剖液轻轻冲洗部分解剖的蛹，以去除残留的脂肪和肠道组织。为获取蛹的翅，用一把镊子夹住蛹的头部固定，另一把镊子夹住翅表皮最末端的尖端，将其从尸体侧面拉出并取下。

然后在翅基关节处剪断或拔下翅膀，将其从身体上移除，并放置于远离尸体及其他材料的一处，以获取复眼或脑组织。清洗蛹体，直至眼脑复合体从蛹体中脱离并完全游离。使用镊子轻轻将复眼与脑组织分开，并保留所需组织。使用涂有润滑剂的移液枪，小心转移已解剖的组织。

将试管在23摄氏度、500转/分钟的摇床上振荡孵育70分钟。然后以中等速度轻轻涡旋振荡5秒，并将样品放回摇床继续振荡15至20分钟。对于脑组织和瞳孔眼样品，再次以中等速度涡旋振荡5秒。

超过36小时。将PF组织置于DNA染色液中，在23摄氏度、500转/分钟条件下解离45至60分钟。随后，将组织连同约50微升DNA染色液一起转移至解剖皿中，手动逐一分离较大的组织块。

使用手动拉制的移液管（开口直径约100至150微米）快速上下吹打。将解离后的样本收集至5毫升离心管中。在23°C下以500转/分钟振荡继续孵育30分钟。

目视确认样本已完全解离。注意无细胞的透明角膜翼部表皮不会发生聚集。通过将样本加载到细胞仪上，开始进行流式分析。

然后选择检测前向散射和侧向散射的通道，以反映细胞大小和膜的复杂性。为了检测DNA的D周期紫光染色，需要使用紫激光激发，测量VL的高度、宽度和面积。同时选择蓝色激光通道的面积，以检测GFP荧光。

对于RFP分析，我们使用蓝色激光通道三。Attune仪器上的该通道已针对RFP检测进行了优化。设置门控以将分析限定于选定的细胞群体，并排除碎片和细胞团块。首先生成SSC与FSC散点图，通过门控一排除碎片和团块；然后在VL1-A与VL1-H散点图中，使用门控二排除未染色细胞、亚G1期凋亡细胞以及根据单细胞识别结果判定的细胞团块。

GA三包括在基于VE L1高度的荧光与DNA含量散点图中GFP阴性的门一和门二内的细胞。接下来，门四包括在荧光与DNA含量散点图中GFP阳性的门一和门二内的细胞。还可以通过GFP测定的细胞大小与前向散射的散点图生成门五和门六。

为了分析细胞周期时相，使用两个直方图，其横轴为DNA含量，纵轴为细胞数量，分别对应第三门控和第四门控所定义的细胞群体。对于细胞大小，将第五门控和第六门控设为细胞群体，横轴为前向散射光（FSC），纵轴为细胞计数；在运行样品时，将记录停止设置为10,000个事件，同时将GFP阳性事件的采集体积设为300微升。

适当的阈值和电压设置包含在提供的模板中。以标准或高灵敏度100微升/分钟运行样品并记录数据。Attune软件生成的记录数据文件为FCS格式，可兼容大多数细胞周期建模软件。

这个代表性的分析工作区包含四个点图和两个直方图，显示了一个幼虫翅样本在翅后区表达GFP和Cyclin D，该表达由Grailed-Gal4转基因驱动。第一个点图以细胞大小对G1期作图，排除了碎片和细胞团块。第二个点图通过门控二对单细胞进行区分，在GFP与DNA含量的图中排除了未染色细胞、亚G1期DNA含量的细胞以及细胞团块。

GFP 阴性细胞和阳性细胞可以被区分开，根据其在 x 轴上的位置可明显看出二倍体（2N）和四倍体（4N）的 DNA 含量。该图以 GFP 测定的细胞大小与前向散射光信号作图，用于设定第五和第六门控。最终的分析结果生成了 DNA 含量与计数的直方图，分别对应于 GFP 或 RFP 阴性细胞群体以及 GFP 或 RFP 阳性细胞。

使用所提供的RFP模板。对于相同类型的组织和表达模式，可获得类似结果。对于RFP，所提供的模板和电压适用于幼虫的眼睛、大脑和翅膀，以及成虫的眼睛、大脑和翅膀的分析。

在匹配的软件中，使用细胞周期或细胞大小直方图的自动缩放功能，可确定每个群体的全局最大值。这些细胞周期图谱代表了在后部表达 GFP 的幼虫眼睛中 GFP 阳性和阴性的细胞。

利用GMR GAL四U-A-S-G-F-P转基因，该叠加图像揭示了后部表达GFP细胞的细胞周期时相差异。GFP阳性细胞与阴性细胞之间的相对细胞大小变化也可进行绘图分析。该细胞周期图谱来源于孵化后46小时的蛹脑。GFP阳性细胞为谱系示踪克隆，表达G1/S期调控因子cyclin D和E2F，可破坏静息状态并促进细胞进入S期。

这与不表达GFP的阴性细胞形成对比，后者在此阶段通常处于停滞状态。在G1期，Attune软件会在直方图上生成用户自定义区域，以界定G1、S期和G2期。每次运行的统计表格可确定用户自定义区域内细胞的绝对数量及所占百分比。

此外，也可以使用 mod fit 等建模软件来估算各时相以及凋亡细胞的百分比。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从黑腹果蝇（Drosophila）中分离并标记多种组织，以进行细胞周期分析。