使用高通量形状的RNA二级结构预测
May 31st, 2013
的高通量选择性2'羟基的酰化反应分析的引物延伸（SHAPE）利用了一种新的化学探测技术，反转录，毛细管电泳确定结构的RNA二级结构预测软件从几百到几千个核苷酸，单核苷酸分辨率。
该程序的总体目标是以单核苷酸分辨率预测 RNA 二级结构。这是通过首先使用亲电试剂对折叠的 RNA 进行化学修饰来实现的，该试剂 S 分离 RNA 的单链或柔性区域。第二步是使用逆转录来检测经过化学修饰的 RNA 位点。
接下来，通过毛细管电泳分离逆转录的 CD NA 产物。最后一步是数据处理和规范化。最终，RNA 结构软件用于使用从形状分析得出的伪自由能约束来预测 RNA 二级结构。
这种方法可以帮助回答分子生物学领域的关键问题，例如 RNA 结构如何控制催化和非当前 RNA 的功能，以及病毒 RNA 基因组如何调节其基因组的多功能性。这项技术的影响延伸到我们对病毒性疾病或癌症的治疗和诊断，因为深入了解 RNA 二级结构可能有助于基于结构的药物的设计。虽然这种方法可以深入了解体外转录产生的 RNA 结构，但由于形状试剂具有细胞渗透性，因此它也可以应用于体内。
在开始此过程之前，通过体外转录制备 RNA。使用商业转录试剂盒。RNA 应储存在零下 20 至零下 80 摄氏度的 TE 缓冲液中，并置于 0.5 微升微量离心管中。
用水将 12 皮摩尔 RNA 稀释至 18 微升，然后轻敲试管加入 2 微升 10 x re 成熟缓冲液混合物，然后短暂旋转将试管中的混合物加热至 85 摄氏度 1 分钟，然后以每秒 0.1 摄氏度的速度冷却至 4 摄氏度。向微量离心管中加入 100 微升水和 30 微升 5 x 折叠缓冲液。然后，将试管中的内容物在 37 摄氏度下孵育 30 至 60 分钟，具体取决于被折叠的 RNA。
一般来说，更长和更结构化的 RNA 的镁依赖性折叠需要更长的孵育时间将 72 μL 等分试样转移到两个 0.5 mL 微量离心管中，分别标记为修饰和对照。下一步是将 8 微升无水二甲基亚砜加入对照混合物中，放在一边。然后将 8 微升 10 x 和 MIA 添加到改性混合物中。
将改性混合物和对照混合物在 37 摄氏度下孵育 50 分钟。加入 8 微升 pH 值为 5.28 的三种乙酸钠、100 毫摩尔 EDTA、240 微升冷乙醇和 1 微升 10 毫克/毫升。糖原到改良的混合管中沉淀改良的 RNA，将试管内容物在零下 20 摄氏度下冷藏 2 小时，然后在 4 摄氏度下以 14， 000 G 离心 30 分钟。
然后用冷的 70% 乙醇离心洗涤沉淀两次，持续 5 分钟。每次洗涤后，用微量移液器去除上清液，并将沉淀物风干 5 分钟。在室温下，在 0.5 mL 微量离心管中制备用于逆转录的修饰样品和对照样品。
对于修饰的反应，混合 5 μL 修饰的 RNA、6 μL 水和 1 μL 的 10 μmol sci Five 标记引物溶液。对于对照反应，混合 5 μL 对照 RNA、6 μL 水和 1 μL 10 μmol sci 5.5 标记引物溶液。将试管放入热循环仪中，然后将引物跪在 RNA 上。
在跪下时准备 2.5 x RT 混合物。对于每个 RT 反应，充分混合并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟，然后加入跪下反应。一旦跪下反应的温度达到 50 摄氏度，加入 8 微升 2.5 XRT。
混合并在 50 摄氏度下孵育 50 分钟。接下来，加入 1 微升 4 摩尔氢氧化钠并加热至 90 摄氏度 3 分钟，水解 RNA。在冰上冷却反应物，然后加入两微升 2 摩尔盐酸来中和它们。
现在合并改性反应和对照反应，加入 0.1 体积或总反应体积的十分之一的 3 摩尔乙酸钠和 100 毫摩尔 EDTA、1.5 体积的冷乙醇和 1 微升 10 毫克/毫升。糖原。这导致 CDNA 从溶液中沉淀出来。将溶液冷藏 2 小时，然后在 4 摄氏度下以 14， 000 G 离心 30 分钟。
用 70% 乙醇重悬的冷溶液洗涤沉淀两次，将沉淀的 CD NA 放入 40 微升去离子形式的酰胺中，加热至 65 摄氏度 10 分钟，然后剧烈涡旋至少 30 分钟，以便在 0.5 毫升微量离心管中制备测序反应，将 40 微升 DDA 终止混合物混合。5 个 PICA 摩尔 DNA 模板、4.6 微升 10 x 蛋白酶缓冲液和 10 微升读取良好的 D 两个标记引物。向该混合物中加入 4.6 μL QUIN A 并用水稀释，使总体积达到 82 μL。
以相同的方式使用 DDT 和 lycor IR 800 标记的引物制备第二次测序反应。接下来，使用给定的 USB 推荐条件进行 PCR 扩增。加入 16 微升 pH 值为 5.2 的三摩尔乙酸钠、16 微升 100 毫摩尔的 EDTA、1 微升 10 毫克/毫升的糖原和 480 微升 95% 乙醇以沉淀 DNA，然后在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，并在 4 摄氏度下以 14， 000 G 离心 30 分钟。
将沉淀的 CD NA 重悬于 100 微升去离子形式的酰胺中，加热至 65 摄氏度 10 分钟，然后剧烈涡旋至少 30 分钟。接下来，将 40 微升混合形状的样品与 10 微升的混合测序梯，并将样品的总体积移液到 96 孔样品板中，程序并准备毛细管电泳仪器并按照制造商的说明开始运行。四组重叠的颜色编码轨迹是通过四组反应产物通过毛细管迁移产生的，如下所示，蓝色轨迹显示由 NMIA 修饰的 RNA 逆转录产生的逆转录产物。
绿色轨迹显示了来自折叠但未修饰的 RNA 的逆转录产物。黑色迹线显示 D-N-A-D-D-G 测序分子量标准，红色迹线显示 DDT 测序分子量标准。使用形状查找软件分离、处理、对齐和集成原始毛细管电泳迹线。
数据分析首先将电泳图从毛细管电泳系统导入 shape finder 中。中央数据视图窗口提供有关每个数据处理步骤的图形反馈。位于屏幕左下角的工具检查器窗口显示在脚本检查器中所选工具的参数。
屏幕顶部的脚本检查器显示已应用于数据的那些工具，调整电泳图以校正荧光背景、荧光通道之间的光谱重叠、迁移率变化、由不同标记的引物赋予的信号衰减、逆转录过早终止导致的信号衰减以及形状查找器中用不同荧光团标记的常见产物的荧光强度差异对齐和整合工具。使用设置功能自动为单个峰分配身份，并将此信息与用户输入和两个测序梯定义的 RNA 序列相关联，以将核苷酸反应性图谱合并到 RNA 结构 5.3 软件使用的二级结构算法中，或比较密切相关的 RNA 的图谱。以标准化方式规范化形状数据。
为此，请从后续计算中排除异常值。确定有效最大反应性，并通过将所有反应性值除以有效最大值进行归一化。RNA 结构软件用于使用形状分析的伪自由能约束来预测实验支持的 RNA 二级结构。
该软件提供 DRNA 结构最低能量的图形表示，以及这些结构的文本表示。在点括号表示法中，序列和点括号注释应导入 RNA 结构查看器中，此处显示的是 HIV rev 反应元件茎环两个区域的 2D 结构，在 RNA 结构 5.3 中使用形状派生的反应性曲线生成，并使用 Java 轻量级小程序进行可视化。蓝色核苷酸的反应性低，而红色的核苷酸反应性较高一旦掌握，如果作得当，该技术可以在两天内完成。
在尝试此过程时，重要的是要记住，在得出有关 RNA 二级结构的最终结论之前，必须仔细解释所得的 RNA 模型遵循此程序。可以执行其他方法，例如通过空间切割方法使用羟基自由基探测，以阐明复杂的三级相互作用，并最终使研究人员能够在三个维度上确定这些 RNA 的结构。
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概述
本文讨论了一种名为SHAPE的新型化学探针技术，该技术能够以单核苷酸分辨率确定RNA结构。该方法结合逆转录和毛细管电泳分析数百到数千个核苷酸的RNA序列。
关键研究组成部分
科学领域
- RNA结构分析
- 化学探针技术
- 逆转录方法
背景
- 理解RNA二级结构对于各种生物过程至关重要。
- 传统方法可能无法提供复杂RNA分子所需的分辨率。
- SHAPE提供了一种高通量的RNA结构测定方法。
- 该技术利用亲电试剂修饰RNA。
研究目的
- 以高分辨率预测RNA二级结构。
- 分离RNA的单链或灵活区域。
- 增强对RNA折叠和功能的理解。
使用的方法
- 使用亲电试剂对RNA进行化学修饰。
- 逆转录以检测修饰的RNA位点。
- 毛细管电泳用于分离cDNA产物。
- 数据处理和归一化以进行准确分析。
主要结果
- 成功分离出灵活的RNA区域。
- 高分辨率预测RNA二级结构。
- 结合伪自由能约束进行形状分析。
- 展示了该方法对大型RNA序列的适用性。
结论
- SHAPE为RNA结构生物学提供了一个强大的工具。
- 该方法增强了我们研究复杂RNA分子的能力。
- 未来应用可能包括多种RNA相关研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput SHAPE enables precise RNA secondary structure prediction, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early-stage drug discovery. By integrating chemical probing with quantitative analysis, this method enhances predictive confidence for RNA-targeted therapeutics and supports risk-adjusted portfolio decisions. Its single-nucleotide resolution and compatibility with in vivo systems position it as a reusable capability across discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RNA structural hypotheses relevant to catalytic and regulatory functions.
- Supports biological de-risking by mapping flexible and structured RNA regions at single-nucleotide resolution.
- Improves predictive confidence for RNA-targeted drug design and functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by clarifying RNA structure-function relationships.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RNA structural models for downstream screening workflows.
- Standardizes quantitative reactivity outputs for reproducible assay development.
- Enables high-throughput, scalable analysis of diverse RNA targets.
- Supports reliable evaluation of compound effects on RNA structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns RNA structure insights with disease-relevant systems, including viral and oncogenic RNAs.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling in vivo RNA probing.
- De-risks translational advancement by clarifying structural determinants of RNA function.
- Supports biomarker alignment when RNA structure is mechanistically linked to disease.
Pipeline & Workflow Integration
SHAPE-based RNA structure prediction integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking at each stage.
- Discovery Biology: Quantitative mapping of RNA flexibility and structure informs pathway clarification and target validation.
- Screening: Standardized reactivity profiles enable reproducible, high-throughput screening of RNA-targeted compounds.
- Analytics: Capillary electrophoresis and ShapeFinder software provide robust, quantitative readouts for comparative analysis.
- Translational Research: In vivo compatibility supports continuity into disease-relevant models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across RNA classes and biological contexts, supporting broad R&D reuse.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted programs.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible RNA structure data.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-centric assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA chemistry, reverse transcription, and capillary electrophoresis.
- Needs access to automated CE instrumentation and specialized analysis software (ShapeFinder, RNAstructure).
- Demands cross-team standardization of data normalization and interpretation protocols.
- Adaptable to both in vitro and in vivo RNA systems, with consideration for reagent permeability and sample preparation.
- Interpretation of RNA models must be cautious; additional probing may be needed for tertiary structure elucidation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
RNA Folding
3:09
Chemical Modification of the RNA
4:33
Reverse Transcription
7:08
Preparation of Sequencing Ladder and Capillary Electrophoresis
9:55
ShapeFinder Software
11:15
Data Normalization
12:53
Conclusion
11:51
Results: RNA Structure Determination using RNA Structure Software
