Name: 使用高通量形状的RNA二级结构预测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: 学习使用SHAPE技术进行RNA二级结构的高通量预测，通过化学修饰、逆转录和毛细管电泳实现单核苷酸分辨率分析。该方法为RNA结构生物学研究提供强大工具。

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S. Lusvarghi、J. Sztuba-Solinska、K.J. Purzycka、J.W. Rausch 和 S.F.J. Le Grice 获得美国国立卫生研究院国家癌症研究所院内研究计划的支持。

<ol><li>Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+regulatory+RNA+elements%3A+ribozymes+that+regulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).</li>
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</ol>

声明无利益冲突。

本文介绍了一种高通量SHAPE技术的详细实验方案，该技术能够以单核苷酸分辨率测定任意长度RNA的二级结构。此外，将实验获得的SHAPE数据与二级结构预测算法相结合，可生成比单独使用任一方法更为精确的RNA二维模型。通过使用荧光标记引物并结合自动毛细管电泳（CE），该方法相较于传统的凝胶电泳SHAPE具有显著优势，能够在单次实验中解析长链RNA序列，并大幅提高多个实验的运行速度和通量。该方法的高效性以及配套数据分析工具的可用性，使其特别适用于此前难以分析的病毒RNA、完整信使RNA和非编码RNA的结构研究。随着这些引人关注的RNA二级结构日益清晰，羟基自由基探针、空间切割技术及分子建模方法的应用将有助于阐明复杂的三级相互作用，并最终使研究人员得以确定这些RNA的三维结构。

为了理解参与剪接、翻译、病毒复制和癌症调控的催化性与非编码RNA的功能，需要对RNA结构有深入的了解1,2。然而，准确预测RNA折叠仍面临巨大挑战。传统的结构探针存在多种缺点，例如具有毒性、对核苷酸的覆盖不完全，以及每次实验通量仅限于100–150个核苷酸。未经辅助的二级结构预测算法同样存在不足，因其无法有效区分能量相近的结构而导致预测不准确。特别是对于较大的RNA分子，由于其构象灵活性以及X射线晶体学和核磁共振（NMR）波谱技术所需的大量高纯度样品，常常难以适用这些三维结构测定方法。
高通量SHAPE通过提供一种高效且简便的方法，在单核苷酸分辨率上探测大型RNA的结构，解决了上述诸多问题。此外，SHAPE所用试剂安全、易于操作，并且与大多数其他化学探针试剂不同，能够与全部四种核糖核苷酸发生反应。这些试剂还能穿透细胞膜，使得在体内环境中探测RNA结构成为可能3。SHAPE最初由Weeks实验室开发4，已被用于分析多种RNA，其中最著名的例子是确定了约9 kb的HIV-1 RNA基因组的完整二级结构5。其他利用SHAPE取得的重要成果包括解析感染性类病毒的结构6、人类长链非编码RNA7、酵母核糖体8以及核糖开关9的结构，并用于鉴定病毒颗粒相关HIV-1 RNA中的蛋白质结合位点3。尽管原始版本及高通量版本的SHAPE实验方案已在其他文献中发表10-12，但本文详细描述了使用荧光寡核苷酸、Beckman Coulter CEQ 8000遗传分析仪以及SHAPEfinder和RNAStructure（v5.3）软件进行高通量SHAPE测定RNA二级结构的具体流程。文中还包含了此前未发表的技术细节和故障排除建议。
SHAPE 的各种变体
SHAPE 及其变体方法的核心原理是将 RNA 水溶液暴露于亲电性酸酐，后者可选择性地酰化核糖的 2'-羟基（2'-OH）基团，在修饰位点形成体积较大的加合物。该化学反应可用于探究 RNA 局部结构动态特性，因为单链核苷酸更易形成有利于这些试剂发生亲电攻击的构象，而碱基配对或空间结构受限的核苷酸则反应性较低或不具反应性10通过从与修饰RNA特定位置杂交的荧光或放射性标记引物（“(+)”引物延伸反应）启动逆转录，可检测加合物形成位点。当逆转录酶（RT）无法通过酰化核糖核苷酸时，将产生一组cDNA产物，其长度对应于修饰位点。同时需进行对照实验，即使用未暴露于试剂的RNA进行“(-)”引物延伸反应，以排除DNA合成提前终止即 由于RNA结构或非特异性RNA链断裂而引起的“停顿”） 等等最后，使用从相同引物起始的两个双脱氧测序反应作为标记，通过电泳后将反应性核苷酸与RNA的一级序列进行比对定位。
在SHAPE技术的原始应用中，使用相同的32P末端标记引物进行(+)、(-)以及两个测序反应。这些反应的产物被加载到5-8%聚丙烯酰胺板胶的相邻加样孔中，并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离（图1）。可使用SAFA（半自动足迹分析软件）对传统SHAPE生成的凝胶图像进行定量分析13。
相比之下，高通量SHAPE技术采用荧光标记的引物和自动化毛细管电泳。具体而言，针对每个待研究的RNA区域，需要合成或购买一组四个具有相同序列但5'端带有不同荧光标记的DNA引物。这些带有不同标记的寡核苷酸用于启动两个SHAPE反应和两个测序反应，反应产物混合后通过自动化毛细管电泳（CE）进行分离和检测。使用原始方法，通过四组反应可获得100–150个核苷酸（nt）RNA的反应活性图谱，而高通量SHAPE则可从单个混合样品中解析出300–600 nt的RNA结构3。最多可同时分离8组反应，而在连续进行的12次毛细管电泳运行过程中，最多可制备96个样品用于分离分析（图2）。此外，为处理和分析CEQ及其他基因分析仪产生的数据而开发的SHAPEfinder软件，相比SAFA13或其他凝胶分析软件包，自动化程度更高，所需人工干预显著减少。
近年来出现了一些更先进的高通量方法，例如 PARS（RNA 结构的并行分析）14 和 Frag-Seq（片段测序）15，这些方法使用结构特异性酶而非烷基化试剂，并结合下一代测序技术来获取 RNA 结构信息。尽管这些技术具有吸引力，但核酸酶探针固有的诸多局限性仍然存在16。这些问题可在 SHAPE 测序（SHAPE-Seq）17 方案中得到克服，该方案在下一代测序之前，通过化学修饰和逆转录 RNA 的方式处理 RNA，类似于传统 SHAPE 中的操作。尽管这些方法可能代表了 RNA 结构测定的未来方向，但必须认识到下一代测序成本高昂，目前仍有许多实验室无法获得。
SHAPE 数据分析
遗传分析仪产生的数据以电泳图谱的形式呈现，其中通过毛细管检测器的样品荧光强度随迁移时间的变化被绘制为曲线图。该图谱由对应于四种用于检测不同荧光染料的荧光通道的重叠轨迹组成，每条轨迹包含对应于单个cDNA或测序产物的峰。电泳图谱数据以制表符分隔的文本文件形式从遗传分析仪导出，并导入到ShapeFinder转换与分析软件18中。
首先使用 ShapeFinder 对数据进行一系列数学变换，以确保迁移时间和峰面积分别准确反映反应产物的身份和数量。随后对峰进行比对和积分，并将结果与原始 RNA 序列一起制表。通过从每个 RNA 核苷酸对应的（+）值中减去对照值，并按如下所述对数据进行归一化，从而获得相应 RNA 片段的“反应活性图谱”。该图谱被导入 RNAstructure（v5.3）软件19,20，该软件将归一化的反应活性值转换为伪能量约束，并将其整合到 RNA 二级结构折叠算法中。将化学探针技术与折叠算法结合，可显著提高结构预测的准确性，优于单独使用任一方法的效果12,21。RNAstructure（v5.3）的输出结果包括以 SHAPE 反应活性图谱进行颜色编码的最低能量 RNA 二级结构图像，以及以文本形式表示的点括号（dot-bracket）结构。后者可进一步导出至专门用于展示 RNA 二级结构的图形化软件，如 Varna22 和 PseudoViewer23。
<img alt="RNA 结构分析示意图；体外转录，凝胶分析，高通量 SHAPE 方法。" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 通过 SHAPE4,10 进行 RNA 结构测定的流程图。 (A) RNA 可来源于生物样本或通过体外转录获得。(B) 根据 RNA 来源，将其进行折叠或其他处理，并用 SHAPE 试剂进行修饰。(C) 使用荧光或放射性标记的引物进行逆转录。(D) 通过毛细管电泳或平板凝胶电泳对 cDNA 产物进行分离。(E) 片段分析。(F) RNA 结构预测。<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图。</a>
<img alt="RNA structure schematic diagram; includes secondary structure and microarray layout for analysis." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 基于毛细管电泳的SHAPE技术具有高通量特性，可实现对多种RNA和/或同一种RNA的多个区段的快速分析。 （A） 表示一段RNA可被分为300-600个核苷酸的片段（以绿色、蓝色和红色进行颜色编码） （B） 使用不同组的荧光引物（黑色箭头）分别对RNA的不同区段进行探针检测 （C） 将多组反应混合后分别加入 A1、B1、C1 孔中， 等等分别对约3 kb的RNA1实现完全覆盖。RNA2、RNA3、RNA4等的反应产物可类似地制备，并在连续的电泳运行中进行分级分离。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">单击此处查看大图。</a>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>N-甲基异邻苯二甲酰亚胺（NMIA）</td><td>Life technologies</td><td>M25</td><td>溶于无水DMSO中</td></tr><tr><td>1-甲基-t-硝基异邻苯二甲酰亚胺（1M7）</td><td>参见参考文献22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 逆转录酶</td><td>Life technologies</td><td>18080044</td><td>10,000 单位</td></tr><tr><td>Thermo sequenase 循环测序试剂盒</td><td>Affymetrix</td><td>78500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;用户自备材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>目标RNA</td><td></td><td></td><td>每反应6 pmol（检测下限由仪器决定）</td></tr><tr><td>四组5'端标记引物（Cy5、Cy5.5、WellRed D2 和 WellRed D1/Licor IR800）</td><td></td><td></td><td>引物与目标RNA互补，用于逆转录和测序反应。所列荧光染料适用于Beckman Coulter 8000 CEQ系统。引物可外购或自行合成。</td></tr><tr><td>DNA模板</td><td></td><td></td><td>DNA用于测序反应，必须包含所研究RNA的序列——包括任何3'端延伸序列（如存在）。在适用情况下，通常可方便地使用RNA转录模板。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;缓冲液&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10× RNA复性缓冲液</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris-HCl pH 8.0，1 M KCl，1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5× RNA折叠缓冲液</td><td></td><td></td><td>200 mM Tris-HCl pH 8.0，25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，2.5 mM EDTA，650 mM KCl。（该缓冲液可根据具体情况调整（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; pH、EDTA、Mg、RNase抑制剂））</td></tr><tr><td>2.5× 逆转录混合液</td><td></td><td></td><td>4 &amp;mu;l 5× 缓冲液，1 &amp;mu;l 100 mM DTT，1.5 &amp;mu;l 水，1 &amp;mu;l 10 mM dNTPs，0.5 &amp;mu;l SuperScript III。注意：5× 缓冲液和100 mM DTT随SuperScript III（Invitrogen）购入时提供。</td></tr><tr><td>GenomeLab 样品上样溶液（Beckman Coulter）</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;注意：&lt;/strong&gt; 避免反复冻融</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>毛细管电泳仪</td><td>Beckman</td><td>CEQ8000</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>型号各异</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用高通量shape进行rna二级结构预测

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

要理解RNA在生物过程中的功能，必须全面了解其结构。为此，一种名为“高通量选择性2'羟基乙酰化引物延伸分析”（SHAPE）的方法，能够以单核苷酸分辨率预测RNA的二级结构。该方法利用化学探针，在水溶液中优先乙酰化RNA的单链区域或柔性区域。通过逆转录检测RNA的化学修饰位点，反应产物经自动毛细管电泳（CE）分离。由于逆转录酶会在被SHAPE试剂修饰的RNA核苷酸处暂停，因此生成的cDNA文库可间接反映在折叠RNA结构中处于单链状态的核糖核苷酸位置。利用ShapeFinder软件，将自动毛细管电泳产生的电泳图谱处理并转化为核苷酸反应活性表，这些数据进一步转化为伪能量约束，输入RNAStructure（v5.3）预测算法中。结合SHAPE化学探针与in silico RNA二级结构预测所获得的二维RNA结构，其准确性显著高于单独使用任一方法所得的结构。

含有HIV-1 rev反应元件（RRE）和3'末端结构盒的RNA4 由线性化质粒制备 体外 转录，随后通过加热、冷却及孵育进行折叠 37 °C 在 MgCl₂ 存在下2RNA经NMIA处理后，通过与3'末端结构盒杂交的5'端标记DNA引物进行逆转录。所获得的SHAPE cDNA文库连同对照及测序反应产物，随后采用贝克曼库尔特CEQ 8000全自动毛细管电泳系统进行分离，得到如图所示的电泳图谱 图4四条重叠且以颜色编码的轨迹由四组反应产物在毛细管中的迁移产生，具体如下：蓝色（来自NMIA修饰RNA逆转录生成的Cy5标记的RT产物）、绿色（来自折叠但未修饰RNA的Cy5.5标记的RT产物）、黑色（使用ddG生成的WellRed D2标记的DNA测序梯度）和红色（Lycor800标记的测序梯度，ddT）。
原始毛细管电泳图谱使用 ShapeFinder 软件进行分离、处理、比对和积分18对应于RRE SLII区域的轨迹部分如图所示 图5，...

高通量选择性2'羟基酰化结合引物延伸分析（SHAPE）利用一种新型化学探针技术，结合逆转录、毛细管电泳和二级结构预测软件，以单核苷酸分辨率测定长度从数百到数千个核苷酸的RNA结构。

利用高通量SHAPE进行RNA二级结构预测

了解参与生物过程的RNA功能需要对其结构有深入的认识。为此，一种被称为...的方法学

本实验的总体目标是实现对 RNA 二级结构的单核苷酸分辨率预测。该目标通过以下步骤实现：首先使用亲电试剂对折叠后的 RNA 进行化学修饰，该试剂可特异性地标记 RNA 中的单链区域或柔性区域；第二步是通过逆转录技术检测发生化学修饰的 RNA 位点。接下来，通过毛细管电泳对反转录得到的cDNA产物进行分离。最后一步是数据处理与标准化。最终，利用来自SHAPE分析的伪自由能约束，通过RNA结构软件预测RNA的二级结构。该方法有助于解答分子生物学领域的一些关键问题，例如RNA结构如何调控催化性RNA和非编码RNA的功能，以及病毒RNA基因组如何调节其基因组的多功能性。该技术的影响延伸至病毒性疾病或癌症的治疗与诊断，因为深入了解RNA二级结构可能有助于基于结构的药物设计。尽管该方法主要提供关于体外转录产生的RNA结构的信息，但由于SHAPE试剂具有细胞膜通透性，也可将其应用于体内研究。在开始此操作之前，通过体外转录制备RNA。使用商业转录试剂盒。RNA应储存于TE缓冲液中，置于-20至-80摄氏度，保存于0.5 µL微量离心管中。将12皮摩尔的RNA用水稀释至18微升，加入2微升10倍复性缓冲液混合液，轻轻弹击离心管混匀，短暂离心后将混合物在85摄氏度加热1分钟，然后以每秒0.1摄氏度的速率冷却至4摄氏度。向微量离心管中加入100微升水和30微升5倍折叠缓冲液。随后，根据所折叠的RNA类型，将管内内容物在37摄氏度孵育30至60分钟。通常情况下，较长且结构更复杂的RNA在依赖镁离子的折叠过程中需要更长的孵育时间。取72微升等份样品，分别加入两个0.5毫升的微量离心管中，并分别标记为“修饰组”和“对照组”。下一步是在对照组反应体系中加入8微升无水二甲基亚砜，混匀后暂时放置。然后在修饰组反应体系中加入8微升10× MIA试剂。将修饰组和对照组混合物在37摄氏度下孵育50分钟。向修饰组混合管中加入8微升3摩尔/升乙酸钠（pH 5.2）、28微升100毫摩尔/升EDTA、240微升冷乙醇以及1微升10毫克/毫升的糖原，以沉淀修饰后的RNA。将管内内容物在零下20摄氏度下冷藏2小时，然后在4摄氏度下以14,000 ×g离心30分钟。然后用预冷的70%乙醇洗涤沉淀物两次，每次离心五分钟。每次洗涤后，用微量移液器吸除上清液，并将沉淀物在室温下晾干五分钟。在室温下，于0.5毫升微量离心管中准备修饰样本和对照样本用于逆转录。对于修饰反应，混合五微升修饰后的RNA、六微升水和一微升10微摩尔的sci5标记引物溶液。对于对照反应，混合五微升对照RNA、六微升水和一微升10微摩尔的sci5.5标记引物溶液。将试管放入热循环仪中，使引物退火至RNA。在跪姿状态下配制 2.5 × RT 反应液。每份 RT 反应液充分混匀后，在加入跪姿反应体系前，于 37 摄氏度孵育 5 分钟。当跪姿反应体系的

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科研

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Biology

生物学

使用高通量形状的RNA二级结构预测

本文描述了使用I-TASSER流程对蛋白质进行基于计算机的结构与功能表征的指南。从目标蛋白质序列出发，通过多序列 threading...

一种基于计算机的蛋白质结构与功能预测方案

ITS2数据库是一个用于系统发育推断的工作平台，可同时分析内转录间隔区2（ITS2）的序列及其二级结构。该平台包含数据收集与精确注释、结构预测、序列-结构多序列比对以及快速建树等功能。简而言之，该工作平台将初步的系统发育分析简化为几次简单的点击操作。...

ITS2 数据库

3DNA 软件包是一种广受欢迎且功能多样的生物信息学工具，能够分析、构建和可视化三维核酸结构。本文介绍了 3DNA...

使用3DNA分析与构建核酸结构

我们开发了计算方法 从头合成 能够应对蛋白质设计多个重要领域的蛋白质设计方法。为了推广这些方法，我们推出了 Protein...

蛋白质WISDOM：一个用于 计算机模拟 从头合成 生物分子设计

本文描述了通过自组装这一自发过程形成高度有序的肽基结构的方法。该方法利用 commercially available peptides...

短肽自组装形成有序生物分子结构

DNA瓦片化是一种构建可编程纳米结构的有效方法。本文描述了通过单链DNA瓦片的自组装来构建复杂二维形状的实验方案。...

单链DNA瓦片自组装形成复杂的二维结构

我们描述了一个结合了简单生化分析与计算分析的框架，用于指导大型卷曲螺旋结构域的表征与结晶。该框架可针对球状蛋白进行调整，或进一步拓展以整合多种高通量技术。...

结合湿实验与干实验技术指导含大型卷曲螺旋结构蛋白的结晶

原子分辨率下的超分子蛋白质组装体结构因其在多种生物现象中发挥的关键作用而具有重要意义。本文介绍了一种利用魔角旋转固体核磁共振波谱技术（MAS...

利用固态核磁共振波谱法对大分子组装体进行原子尺度结构研究

本文介绍了在存在靶向RNA的小分子的情况下，通过引物延伸分析法（SHAPE）进行体外和细胞内选择性2'-羟基乙酰化的详细实验方案，以确定pre-mRNA目标序列的二级结构。...

利用体外和细胞内SHAPE技术研究小分子诱导的pre-mRNA结构变化

该方案提供了使用二甲基硫酸酯对RNA进行修饰以开展突变谱分析实验的操作指导。内容包括 体外 和 体内...

利用二甲基硫酸盐突变谱结合测序技术探究RNA结构 体外 以及在细胞中

蛋白质设计涉及氨基酸序列的构建以及特定基序的引入，以创造具有功能的变体。该方法对于开发抗菌肽（AMPs）以对抗抗生素耐药性病原体至关重要。本文介绍了一种利用多种生物信息学工具进行蛋白质构建的实验流程。...

De Novo 和 In Silico 蛋白质设计中 I TASSER、trRosetta、UCSF Chimera、HADDOCK 服务器及 HEX loria 的应用

学习使用SHAPE技术进行RNA二级结构的高通量预测，通过化学修饰、逆转录和毛细管电泳实现单核苷酸分辨率分析。该方法为RNA结构生物学研究提供强大工具。

利用高通量SHAPE进行RNA二级结构预测

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