利用高通量SHAPE进行RNA二级结构预测

本实验的总体目标是实现对 RNA 二级结构的单核苷酸分辨率预测。该目标通过以下步骤实现：首先使用亲电试剂对折叠后的 RNA 进行化学修饰，该试剂可特异性地标记 RNA 中的单链区域或柔性区域；第二步是通过逆转录技术检测发生化学修饰的 RNA 位点。

接下来，通过毛细管电泳对逆转录产生的cDNA产物进行分离。最后一步是数据处理与标准化。最终，利用来自SHAPE分析的伪自由能约束条件，通过RNA结构软件预测RNA的二级结构。

该方法有助于解答分子生物学领域中的关键问题，例如RNA结构如何调控催化性RNA和非编码RNA的功能，以及病毒RNA基因组如何调节其基因组的多功能性。该技术的影响延伸至病毒性疾病或癌症的治疗与诊断，因为深入了解RNA二级结构可能有助于基于结构的药物设计。尽管该方法主要提供关于体外转录产生的RNA结构的信息，但由于SHAPE试剂具有细胞膜通透性，也可将其应用于体内研究。

开始此实验步骤前，需通过体外转录法准备RNA，可使用商业化的转录试剂盒。RNA应储存于TE缓冲液中，置于-20至-80摄氏度条件下，保存于0.5微升的微量离心管中。

将12皮摩尔的RNA用水稀释至18微升，加入2微升10倍复性缓冲液混合液，轻轻敲击离心管混匀，短暂离心后，将混合物在85摄氏度加热1分钟，然后以每秒0.1摄氏度的速率冷却至4摄氏度。向微量离心管中加入100微升水和30微升5倍折叠缓冲液。随后，根据所折叠的RNA不同，将管内内容物在37摄氏度孵育30至60分钟。

通常情况下，较长且结构更复杂的RNA在依赖镁离子的折叠过程中需要更长的孵育时间。取72微升等份样品，分别加入两个0.5毫升的微量离心管中，并分别标记为“修饰组”和“对照组”。下一步是在对照组混合物中加入8微升无水二甲基亚砜，并暂时放置备用。然后在修饰组混合物中加入8微升10× MIA溶液。

将修饰组和对照组混合物在37摄氏度下孵育50分钟。向修饰组混合管中加入8微升3摩尔/升乙酸钠（pH 5.2）、28微升100毫摩尔/升EDTA、240微升预冷乙醇，以及1微升10毫克/毫升的糖原，以沉淀修饰后的RNA。将管内内容物在-20摄氏度下冷藏2小时，随后在4摄氏度下以14,000 × g离心30分钟。

然后用预冷的70%乙醇洗涤沉淀物两次，每次离心五分钟。每次洗涤后，用微量移液器吸除上清液，并将沉淀物在室温下晾干五分钟。在室温下，于0.5毫升微量离心管中准备修饰样本和对照样本用于逆转录。

对于修饰反应，混合5 µL修饰RNA、6 µL水和1 µL 10 µM sci5标记引物溶液。对于对照反应，混合5 µL对照RNA、6 µL水和1 µL 10 µM sci5.5标记引物溶液。将试管放入热循环仪中，使引物退火至RNA。

在进行跪姿准备时，配制 2.5 × RT 反应液。每轮反转录（RT）反应均需充分混匀，并在加入跪姿反应体系前于 37 摄氏度孵育 5 分钟。当跪姿反应体系的温度升至 50 摄氏度时，加入 8 微升 2.5 × RT 反应液。

混合后于 50 摄氏度孵育 50 分钟。接着，加入 1 µL 4 M 氢氧化钠水解 RNA，并于 90 摄氏度加热 3 分钟。将反应物置于冰上冷却，然后加入 2 µL 2 M 盐酸进行中和。

现在将修饰反应和对照反应混合，加入总体积0.1倍（即十分之一）的3摩尔醋酸钠和100毫摩尔EDTA，再加入1.5倍体积的冷乙醇以及1微升浓度为10毫克/毫升的糖原。这将导致cDNA从溶液中沉淀出来。将溶液置于冰箱中冷藏2小时，然后在4摄氏度下以14,000 ×g离心30分钟。

将沉淀物用预冷的70%乙醇洗涤两次，然后将沉淀的CD NA重悬于40微升去离子甲酰胺中，于65摄氏度加热10分钟，随后剧烈涡旋振荡至少30分钟。在0.5毫升微量离心管中，为准备测序反应，加入40微升DDA终止混合液、5皮摩尔的DNA模板、4.6微升10×sease缓冲液以及10微升well-read D两标记引物。向此混合物中加入4.6微升QUIN A，并用水稀释至总体积为82微升。

采用DDT和lycor IR 800标记引物，以相同方式准备第二次测序反应。接下来，按照USB推荐的条件进行PCR扩增。加入16 µL 3摩尔的乙酸钠（pH 5.2）、16 µL 100毫摩尔的EDTA、1 µL 10毫克/毫升的糖原以及480 µL 95%乙醇以沉淀DNA，然后在4°C下孵育30分钟，并在4°C下以14,000 ×g离心30分钟。

将沉淀的 CD NA 用 100 µL 去离子甲酰胺重悬，先在 65 °C 下加热 10 分钟，随后剧烈涡旋振荡至少 30 分钟。接着，取 40 µL 混合后的形状样品与 10 µL 混合后的测序引物样品混合，将样品总体积转移至 96 孔样品板程序中，并按照制造商的说明准备毛细管电泳仪器并开始运行。通过四组反应产物在毛细管中的迁移，生成四种重叠的颜色编码图谱：蓝色图谱显示由 NMIA 修饰的 RNA 经逆转录生成的逆转录产物。

绿色迹线显示来自折叠但未经其他修饰的RNA的反转录产物。黑色迹线显示D-N-A-D-D-G测序梯度，红色迹线显示DDT测序梯度。原始毛细管电泳迹线通过SHAPE Finder软件进行分离、处理、比对和整合。

数据分析首先将毛细管电泳系统产生的电泳图导入到 Shape Finder 中。中央数据视图窗口为每一步数据处理提供图形化反馈。位于屏幕左下方的工具检查器窗口显示在脚本检查器中所选工具的参数。

屏幕顶部的脚本检查器会显示已应用于数据的工具，可调整电泳图以校正荧光背景、荧光通道间的光谱重叠、不同标记引物引起的迁移率偏移、逆转录提前终止导致的信号衰减，以及用不同荧光染料标记的相同产物在荧光强度上的差异，在“形状查找器”中使用对齐与积分工具。使用“设置”功能可自动为各个峰分配身份，并将此信息与用户输入的RNA序列及两条测序梯带相关联，从而将核苷酸反应性谱图整合到RNAstructure 5.3软件所采用的二级结构算法中，或用于比较密切相关RNA的谱图。以标准化方式对SHAPE数据进行归一化处理。

为此，从后续计算中排除异常值。确定有效最大反应活性，并通过将所有反应活性值除以有效最大值进行归一化。使用RNA结构分析软件，结合SHAPE分析得到的伪自由能约束，预测经实验支持的RNA二级结构。

该软件可提供最低能量状态下的DRNA结构的图形化表示，以及这些结构的文本表示。在点括号表示法中，序列和点括号注释应导入RNA结构查看器。此处显示的是利用RNAstructure 5.3软件，基于SHAPE推导的反应性谱图生成的HIV rev应答元件茎环区域二的二维结构，并通过Java轻量级小程序进行可视化。呈蓝色的核苷酸表示反应性较低，而呈红色的核苷酸表示反应性较高。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两天内完成。

在进行该实验操作时，必须牢记：在依据本方案得出RNA二级结构的最终结论之前，需谨慎解读所获得的RNA模型结果。为进一步阐明复杂的三级相互作用，可采用其他方法，例如通过空间切割法进行羟基自由基探针实验，从而最终帮助研究人员确定这些RNA的三维结构。