Name: 前子宫穿孔和整个半球的外植体早期皮质发育的研究:一个简单的实验方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学习利用离体电穿孔技术制备小鼠胚胎全脑半球外植体，研究早期皮层发育。该方法支持基因功能分析和药理学研究，为神经发育障碍研究提供重要工具。

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本研究获得了美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS，项目号NS066071）和美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIAAA，项目号P50AA017823）向ECO提供的资助。作者感谢Robert Quinn博士以及实验动物资源部门工作人员在动物护理方面提供的支持。感谢Judson Belmont提供的技术支持，以及Nicole Belletier作为暑期本科生研究学者（SURF）给予的协助。同时感谢David Cameron博士对本文早期版本提出的修改意见和编辑建议。

1. 子宫外 绿色荧光蛋白表达质粒的电穿孔实验
<ol>
	<li>质粒DNA注射液的制备：将CAG-eGFP DNA27用ddH2O稀释至终工作浓度0.33 mg/ml。使用Qiagen无内毒素大提试剂盒（Endo-Free Maxi-Preps）从转化细菌中纯化质粒。在DNA溶液中加入约0.02%（w/v终浓度）的快绿染料，作为注射示踪剂。</li>
	<li>准备手术区域时，用70%乙醇溶液喷洒实验台面和解剖显微镜载物台，并擦拭干燥。在解剖前，用70%乙醇喷洒手术剪刀和镊子，并擦拭干燥。</li>
	<li>于E13天将配孕的Swiss/Webster品系母鼠通过转移至充满加压CO2的密闭容器中实施安乐死，持续观察直至动物完全停止活动至少1分钟。通过CO2吸入法处死后，将胚胎从子宫中取出，并置于含有冰上预冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）的10 cm培养皿中。</li>
	<li>小心地将每个胚胎从周围的胚外膜组织中分离出来，并保持在冰上预冷的HBSS中。</li>
	<li>将每个胚胎单独转移至第二个含有冷HBSS的10 cm培养皿中。使用Hamilton注射器将2–3 μl DNA与快绿的混合物注射至左侧大脑半球的脑室中，注意注射部位应选择在与后续分析区域在空间上分离的皮层区域。</li>
	<li>进行电穿孔时，用镊子轻轻夹住胚胎，将镊状电极的正极板轻置于头部背侧中线处，负极板轻置于胚胎下颌下方。使用BTX830电穿孔仪，设定为5次30 V、50毫秒持续时间的脉冲，脉冲间隔为950毫秒。上述参数适用于BTX830型号仪器；其他系统可根据制造商说明进行调整。</li>
</ol>
2. 全脑半球外植体制备
<ol>
	<li>电穿孔后，将胚胎放回冰冻的HBSS中。使用两把#5钟表镊去除胚胎头部的皮肤和软骨性颅骨以暴露脑组织。然后将一把镊子滑入脑组织下方，完整取出脑。将电穿孔侧（左侧）半脑从整个脑组织上分离，并去除附着的中脑组织。在整个解剖过程中，需注意保护覆盖左侧大脑皮层的脑膜不被损伤。</li>
	<li>解剖后，使用剪去尖端的1 ml移液枪头将每个胚胎转移至HBSS中。将半球轻轻挤出并置于胶原包被的培养插件上。每个24 mm插件上可放置最多六个半球外植体，均以内侧朝下排列。排列完成后，移除插件中多余的HBSS，并将插件放入6孔板中的一个35 mm孔内。每孔中准确加入2.7 ml培养基：含Glutamax的DMEM-F12培养基，并添加2% B-27、1% G5和1%青霉素-链霉素。可从孔中吸取少量培养基滴加于每个外植体表面，但切勿使每孔总液体量超过原有的2.7 ml。</li>
	<li>将外植体放置到胶原膜上后，把含有外植体的6孔板放入Billups Rothenberg（BR）培养箱中（同时箱内放置盛有水的加湿皿）。通入95%氧气/5%二氧化碳混合气体2 将气体混合物通入腔室至少1分钟，然后密封腔室并断开95%/5%氧气/二氧化碳2 气体供应管。随后将BR室置于37 °C的组织培养孵育箱中，继续培养1-2 DIV。</li>
</ol>
3. 组织外植体的固定以用于组织学分析
<ol>
	<li>在通风橱中配制Pagano固定液：首先将8 g多聚甲醛溶于100 ml预热（约80 °C）的ddH2O中，加入1–3滴浓NaOH以促进溶解，并轻轻搅拌。待溶解完全后，将8%多聚甲醛溶液与含有500 mM蔗糖、100 mM Hepes（pH 7.4）、50 mM MgCl2和5 mM KCl的溶液按1:1体积比混合，得到终浓度为4%多聚甲醛、250 mM蔗糖、50 mM Hepes、25 mM MgCl2、2.5 mM KCl、pH 7.4的固定液。</li>
	<li>固定组织块时，先将Pagano固定液预热至37 °C。迅速吸去每个培养孔中的大部分DMEM/F12培养基，向每个含有组织块的孔中加入5 ml Pagano固定液，确保完全覆盖所有组织块。室温下固定1小时。在完成1小时固定前，不得将组织块从滤膜上取出。</li>
	<li>固定完成后，吸除Pagano固定液，替换为不含固定剂的Pagano溶液（250 mM蔗糖、50 mM Hepes、25 mM MgCl2、2.5 mM KCl，pH 7.4）。加入数滴10%叠氮化钠，4 °C保存直至包埋。</li>
</ol>
4. 组织学包埋与切片
<ol>
	<li>通过将10 g小牛皮明胶溶于100 ml温水（55–60 °C）中，制备10%的小牛皮明胶溶液。将明胶溶液置于设定为60 °C的加热板上，并定期轻轻摇动，直至完全溶解。</li>
	<li>取约10 ml的10%明胶溶液倒入10 cm培养皿底部，静置30分钟使其凝固，形成用于包埋组织块的“垫层”。这些垫层可提前数天制备，并在4 °C下保存。使用直尺在培养皿底部绘制网格，并将各个组织块转移至网格的每个方格中。去除残留的Pagano溶液后，用移液器将温热的10%明胶溶液覆盖每个组织块，并使其凝固。继续缓慢添加明胶溶液，直至每个组织块完全被明胶包围，注意避免一次性加入过多温热明胶而使垫层融化。静置约1小时使明胶完全硬化。硬化后，可将各个组织块连同周围明胶切割成小块。随后将这些明胶块在Pagano固定液中后固定24–48小时，再使用振动切片机进行切片。</li>
	<li>将含组织块的明胶块以嗅球朝上的方向定位，在冠状面上切成100 μm厚的切片。切片收集后，保存于含0.1%叠氮化钠的PBS中，4 °C保存，直至进行免疫组织化学处理。</li>
	<li>免疫组织化学检测时，将切片转移至24孔板中（每孔2–3片）。首先加入0.5 ml PBST+B（PBS + 0.5% Triton X-100 和 2% BSA）以封闭非特异性抗体结合位点，室温轻摇孵育1小时。然后将适当稀释的一抗加入PBST+B中，每孔加入0.4 ml，于室温下过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次至少10分钟，去除未结合的一抗。随后将二抗与2 μg/ml Hoechst 33342核染料共同稀释于PBST+B中，加入样本孔中，室温轻摇孵育2小时。再进行三次PBS洗涤（每次10分钟），最后将切片用含90%甘油和50 mM Tris（pH 7.4）的封片剂封片。</li>
</ol>

<ol><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).</li>
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<li>Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+reorganization+of+preplate+neurons+and+their+associated+extracellular+matrix%3A+an+early+manifestation+of+altered+neocortical+development+in+the+reeler+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse.</a> J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).</li>
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<li>Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Study+of+Neuronal+Morphogenesis%3A+Ex+vivo+RNAi+Electroporation+in+Embryonic+Murine+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex.</a> J. Vis. Exp. (63), e3621(2012).</li>
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<li>Rehen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+embryonic+culture+for+assessing+global+changes+in+brain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).</li>
<li>Jossin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+fragment+of+Reelin%2C+generated+by+proteolytic+processing+in+vivo%2C+is+critical+to+its+function+during+cortical+plate+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development.</a> J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).</li>
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<li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eomes%3A%3AGFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast%2C+primitive+streak%2C+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45, 208-217 (2007).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们改进并评估了一种用于研究早期皮层发育（E13-E15）的实验模型——全半球脑片培养。该模型已被证明可用于分析构成大脑皮层第6层的兴奋性神经元谱系的迁移与分化过程25,37。该系统的主要优势包括：1）可维持2天体外培养（DIV）的组织型生长；2）制备过程简便；3）在脑发育这一早期关键阶段，可方便地对神经元进行电穿孔、药理学干预及成像观察。我们已利用该系统记录了在前板分裂期间，皮层第6层神经元在形态、取向及树突发育方面的细微差异7,38。
位于第6层的兴奋性神经元主要由皮质丘脑投射神经元组成，这些神经元向背侧丘脑提供双向输入39,40，并被认为在功能上参与大脑皮层神经活动的同步化过程41。尽管这些神经元在生理上具有特化特征，但第6层神经元的发生、迁移和成熟过程与皮层第2–6层的所有兴奋性神经元具有共同的基本特征。具体而言，所有皮层兴奋性神经元均起源于端脑背侧的室管膜区（VZ），以多极神经元形态穿过中间带（IZ），并在皮层板（CP）内完成分化7。兴奋性皮层神经元的成熟由一组依...

哺乳动物的大脑皮层通过相继产生神经元的协同增殖、迁移和分化而形成。每个神经元均起源于脑室区（VZ），从脑室区迁移至中间区（IZ），进而形成皮层板（CP）1。在穿越不同皮层区域的过程中，迁移中的神经元表现出多种迁移模式2,3，这些模式依赖于发育组织中的细胞外环境及其他细胞成分（例如放射状胶质细胞）。随后，皮层神经元在皮层板顶端停止迁移，同时发生神经元迁移终止与树突发育过程4。
皮层发育始于胚胎第11至13天（E11-13）5，最初通过原始网状层6（即前板，PP）的形成启动，该层由覆盖于室下区（VZ）上方的先锋神经元构成。随后，未来将成为皮层第6层的神经元（即在VZ中最早生成的皮层神经元）将其胞体以典型的空间排列方式定向，并在前板内聚集成一个明确的层次7。这些事件将前板分裂为浅层的边缘带（未来的皮层第1层）和深层区域，后者由下板细胞（短暂存在的皮层第7层）组成。这一过程被称为前板分裂，是大脑皮层后续发育的基础性事件8。
已发现许多基因突变会干扰大脑皮层发育的各个方面9。皮层发育还可能因摄入毒素（如可卡因10和酒精11）而受到负面影响。由于发育过程中出现的皮层畸形很可能与神经精神疾病（例如自闭症、精神分裂症）相关，因此对皮层发育异常进行实证研究具有内在的重要性。因此，建立能够快速检测基因或毒素效应、同时又能保留分化中的神经元、其他细胞类型以及细胞外基质（ECM）在脑发育早期阶段可能相互作用的研究方法，具有重要意义12。
脑片外植体13为此类研究提供了有效的体系，并已被广泛用于检测皮层神经元的发育过程14-16。然而，脑片检测方法存在一个缺陷，即神经元迁移和层状结构的形成可能出现异常17，这可能是由于切割损伤了包围发育中脑组织并锚定放射状胶质纤维支架的软脑膜细胞所致。由于放射状胶质纤维是皮层神经元迁移的重要基质18，切片操作对基底层的破坏可能在局部扰乱放射状胶质的结构，从而导致皮层神经元迁移异常。此外，外植体的切面会形成一片死细胞区域，可能改变这些区域细胞外基质（ECM）的正常组成。
近期的研究方法则将分析重点放在切片深层、被适当健康细胞类型和细胞外基质（ECM）包围的细胞上。然而，在某些情况下，这些较新的方法可能要求在固定后将原始的厚培养切片进行冷冻切片或石蜡切片，以便使切片相对正常的内部区域可用于分析19-21。无论是最初用于制备活体切片以进行培养的振动切片，还是后续为分析而对固定切片进行的冷冻切片，都需要谨慎操作和大量努力，才能确保这些检测的成功。
为提供一种简单且互补的方法用于早期皮层发育的研究，我们改进了一种现有的脑片技术 13 以促进早期皮层发育的研究。我们开发了一种全半球外植体模型，类似于已有的E14全半球模型，该模型通过以每分钟65转的速度振荡培养，支持器官型生长持续16–18小时。 22,23 在我们的方法中，将整个半球组织外植体置于半透膜上 13 在高氧培养环境下 21,24 以延长类器官型皮层生长达48小时。该方法还可实现对发育中皮层神经元的稳定电穿孔。将胚胎从子宫中取出后进行电穿孔，以导入质粒DNA，随后解剖分离端脑。分离每个半球，并将其内侧面向下置于胶原包被的滤膜上。外植体随后培养48小时，此时间段涵盖前板分裂过程 8在培养期间，L6神经元由前体细胞发育为分化神经元 25，准确定位于皮质板内。在此期间，发育中的神经元周围始终存在相应的细胞外基质和细胞类型，这些成分将与对应的神经元细胞相互接触。 体内该系统已证明在解析乙醇毒性的细胞事件方面具有重要价值 26第6层形成与先期板分裂 7,25 .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565</td><td></td></tr><tr><td>G5 Supplement 100X</td><td>Invitrogen</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td><td>Invitrogen</td><td>1504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen / Strep Liquid 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 500 ml</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白包被的培养插件</td><td>Costar</td><td>3492</td><td></td></tr><tr><td>牛皮明胶</td><td>Sigma</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX 830 电穿孔仪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 钳式电极</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450166</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Billups Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>哈密尔顿微量注射器（5 µL）</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>哈密尔顿注射器针头</td><td>Hamilton</td><td>7803-04</td><td>注明长度 1&quot;，型号 4</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀，耐切割型，9 cm</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero 电穿孔与全半球外植体：一种用于早期皮质发育研究的简单实验方法

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

皮层发育涉及神经元与非神经元成分之间的复杂相互作用，包括前体细胞、血管、脑膜及其相关细胞外基质。由于能够提供适宜的器官型微环境，皮层切片外植体常被用于研究调控神经元分化与发育的各类相互作用。尽管具有优势，切片外植体模型仍存在一些局限性，例如细胞层状结构异常和迁移紊乱。本文报道一种用于研究早期皮层发育的全大脑半球外植体系统，该系统较皮层切片更易于制备，并能稳定呈现器官型的细胞迁移与层状结构形成。在此模型中，早期的层状结构形成和细胞迁移模式在两天内可正常进行 体外，包括前板分离期，即未来皮层第六层形成的时期。随后，我们开发了一种 子宫外 电穿孔（EUEP）方法，可实现约80%的成功率，将GFP表达靶向定位于背侧内侧皮层发育中的神经元。
全脑半球外植体模型使得早期皮层发育过程可通过电穿孔、药理学干预及活体成像等方法进行研究。该方法避免了传统研究所必需的存活手术操作 在子宫内 电穿孔（IUEP）方法，同时提高转染效率和区域靶向的一致性。该方法将有助于神经元增殖、迁移和分化相关实验研究的开展。

胚胎期啮齿类动物大脑皮层在整个发育过程中表现出横向的神经发生梯度，使得外侧新皮层的成熟度比背内侧新皮层约超前1天 28因此，第6层的大部分神经元得以生成（即 在E12期外侧皮层（也称为40区）表现出其最终的S期5）以及E13时期背内侧皮层（也称为Field 1）5）。前板分离始于第6层神经元生成后约1天，因此在E13时从外侧皮层开始，E14时在背侧皮层开始。为了研究前板分离及皮层板发育的起始过程，我们改进了一种脑片外植体实验方法 21,24 使得整个大脑半球通常从E13培养至E15（图1).
我们通过检测来自 Tg(Eomes::eGFP)Gsat 小鼠的全半球皮质外植体的生长情况，验证了皮质外植体技术的可行性（图 2）。该小鼠品系携带一种转基因，可标记兴奋性皮质谱系中的未成熟神经元7,29,30。在 E13 时期制备全半球皮质外植体，此时背侧新皮质尚未发生预板分裂（图 2...

本方案描述了一种改进的器官块培养方法，涉及胚胎小鼠全脑半球的子宫外电穿孔、解剖与体外培养。ex utero 电穿孔技术有助于在早期皮层发育过程中进行药理学研究及基因功能检测。

Ex utero 电穿孔与全半球外植体：一种用于早期皮质发育研究的简单实验方法

大脑皮层发育涉及神经元与非神经元成分之间的复杂相互作用，包括前体细胞、血管、软脑膜以及……

本实验的总体目标是制备完整的脑半球组织块，用于研究早期皮层发育。首先在胚胎第13天获取小鼠胚胎，随后将质粒DNA混合物注射到脑室中，并进行离体电穿孔操作。然后从电穿孔的胚胎中制备整个半球的外植体。最后一步是固定整个半球外植体并进行切片，以用于组织学分析。最终，可通过针对表达GFP的神经元进行免疫组织化学分析，来评估突变或毒素暴露对皮层神经元发育造成的影响。我叫 Eric Olson。我在雪城大学上州医科大学神经科学与生理学系工作，今天我们将向您展示一种我们开发的方法，称为全半球 X 培养法。与现有的切片培养法相比，该技术的主要优势在于全半球 X 培养的制备过程简单，并可提供长达两天的器官型生长。该方法有助于解答神经发育领域的一些关键问题，例如特定突变或毒素如何干扰早期大脑皮层的发育。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为在不损伤脑膜的前提下制备整个半脑脑片，往往需要一定练习才能掌握。由于组织对机械损伤极为敏感，解剖及脑片转移步骤较难学习，因此对该方法进行直观演示至关重要。示范该操作的是我实验室的博士后 Theresa Ozzi 博士。本方案中，请使用市售试剂盒纯化质粒。将质粒 DNA 用水配制成 0.33 毫克/毫升的浓度，并加入快绿染料作为注射示踪剂，终浓度约为 0.02%（重量/体积）。务必对手术器械、工作区域和显微镜进行消毒。用70%乙醇处理后，通过吸入二氧化碳的方式处死所需数量的Swiss Webster孕鼠（E 13阶段）。取出胚胎后，将其置于盛有冰冻HBSS的10厘米培养皿中，并保持培养皿处于冰冻状态。仔细将每个胚胎从周围的胚外膜组织中分离出来。现在将每个胚胎单独转移至含有冰冻HBSS的干净培养皿中。使用Hamilton注射器，将2至3微升制备好的DNA注入左侧大脑半球的脑室中。切勿将DNA注入或将注射针靠近计划用于后续分析的皮质区域。为了进行DNA电穿孔，用镊子轻轻夹住胚胎，并将镊子电极的正极桨片轻放在头部背侧中线位置。将负极桨片轻轻置于胚胎下颌下方。使用BTX 830型号电穿孔仪运行程序，设置为五个30伏脉冲，每个脉冲持续50毫秒，间隔1秒；若使用其他系统，可按照制造商的说明进行相应设置。将每个胚胎放回冰冻的HBSS中，然后在解剖显微镜下使用两把5号精细镊子进行全半球Explan制备。去除胚胎头部的皮肤和软骨性颅骨。接下来将镊子滑入脑组织下方。从颅骨中取出完整脑组织时，需解剖并移除电穿孔的半脑，包括附着的中脑组织。注意不要损伤覆盖在解剖侧大脑半球上的脑膜。我们发现，最难以掌握的步骤是在不损伤脑膜的前提下完成电穿孔侧半脑的解剖与移除。解剖后，使用扩大的1毫升移液器吸头将每个半脑转移至5毫升冰上预冷的HBSS中。如有需要，可将胚胎分别置于12孔组织培养板的不同孔中。接着，将最多六个半脑轻柔地转移至24毫米胶原包被的培养装置上。将插入物底部朝内侧放入并调整位置。现在，向六孔板中的一个35毫米孔内加入2.7毫升含补充物的培养基。去除插入物上多余的HBSS，将插入物放入含有培养基的孔中，并用移液器将孔中的培养基滴加数滴至每个x explan的表面。不要增加培养基的体积。我们发现，关键是在 X 外植体上方滴加几滴培养基，使 X 外植体不被培养基完全覆盖。这可能意味着在 X 外植体上方原有的 2.7 mL 培养基基础上再添加多达 400 µL 的培养基。将培养皿放入一个含有盛水保湿皿的Billups-Rothenberg密封 chamber 中，该 chamber 需预先通入95%氧气至少一分钟。密封 chamber 后断开气体供应管，将 chamber 置于37°C 培养箱中孵育两天，此时前体细胞分裂（prepl splitting）应已完成。准备中。制作用于包埋样本的垫片。在60摄氏度下配制10%的牛皮明胶溶液。溶解后，将约10毫升溶液倒入一个10厘米的培养皿中。将剩余溶液保持在60摄氏度以备后续使用。如有需要，让凝胶垫固化约半小时。它们可在 4 摄氏度下保存数天，但使用前必须恢复至室温。在通风橱内进行固定操作的当天，配制 Pagano 固定液以及不含固定剂的 Pagano 溶液，并将固定液预热至 37 摄氏度。从培养箱中取出外植体时，需小心且迅速地操作，避免扰动组织。吸除大部分培养基，加入五毫升预热的固定液，确保每个外植体完全浸没。在室温下固定组织 1 小时。然后去除固定液，并用 Pagano 溶液替代。无固定液。向每个孔中加入几滴 10% 叠氮化钠。组织样本现在可保存在 4°C，直至包埋在包埋板上。借助直尺在培养皿底部绘制一个网格。切成2至3厘米的方块。将各个外植体转移至包埋垫上。吸去残留溶液，并用温热的10%明胶溶液覆盖每个外植体。静置使其凝固。待其缓慢凝固后，逐次加入少量明胶溶液，直至每个外植体完全被包裹。注意避免因一次性加入过多明胶而导致垫层融化。现在，让明胶凝固约一小时。凝固后，可将每个离体组织切成小块明胶，再进行切片。重要的是，需将组织块在Pagano固定液中后固定一天或两天。切片时，将外植体的嗅球朝上放置，在冠状面上以100 µm厚度进行切片。将切下的组织片收集至含0.1%叠氮化钠的预冷PBS中。将切片置于 4 摄氏度保存，直至可使用所述技术进行染色。在预裂解前，于 E13 时期制备全半球外植体。位于背侧新皮层。该组织携带一种报告基因，可标记兴奋性皮质谱系中的未成熟神经元。来自同窝的皮质外植体在体外培养期间，于两天内依次进行滴加固定，并进行后续组织学分析。在初始分析时间点（体外培养第0天，DIV 0），视野中尚未发生前体细胞的分裂。CP 开始显现，并持续生长至体外培养第2天（2D IV）。因此，最初在E13阶段培养的整个大脑半球外植体，支持了大脑皮层两天的成熟过程，并捕捉到背侧新皮层中先驱层的分离，以确认背侧新皮层的正常组织学发育。在2D IV时，对外植体进行免疫染色，检测硫酸软骨素、蛋白聚糖以及细胞外基质成分。背侧皮层中出现两条免疫反应带，表明在体外培养期间，PPP已适当地分裂为MZ层和SP层。PP 被表达 CTIP2 和 TBR1 的六层皮层神经元所界定。这些标志物的免疫染色模式证实了这些转录因子在新形成的皮层中表达恰当。综合上述分析，通过使用完整描述的方案，在整个半球脑片培养模型中证实了器官型早期皮层发育；该实验中，向完整 E13 胚胎的左侧脑室进行了注射。可在室管膜区（vz）的神经前体细胞中观察到电穿孔并成功表达GFP。虽然在中间带（IZ）和皮层板（cp）中均观察到较强的GFP表达细胞，但重要的是，在正在形成的皮层板顶部可见大量由箭头所示的GFP阳性神经元，这些神经元已长出新生的树突和轴突。皮层板（CP）与边缘带（MZ）交界处形成的清晰分层表明神经元迁移适当、停止及时且层状结构正常。树突延伸至边缘层（MZ），而皮质下轴突则延伸至CP下方并进入IZ层。不同成熟阶段的分化细胞呈GFP阳性，包括位于放射状胶质纤维旁、具有双极形态的神经元，以及位于其下方IZ层中的多极神经元。树突还延伸至边缘层（MZ），在此处细胞外基质蛋白reelin恰当地呈现免疫定位。因此，电穿孔与组织块培养条件能够支持皮层神经元的正常发育。如预期所示，有丝分裂后的GFP阳性神经元分布于正在形成的皮层板（cp）中。因此，该方案可可靠地靶向研究L6皮层神经元的迁移与成熟过程。该方法的广泛使用已实现 79% 的成功率。在 248 次尝试中，有 195 次适用于成像和分析。一半的失败源于未能表达 GFP 或未成功靶向 GFP。一旦掌握该技术，失败率将显著降低。如果操作得当，该技术可在90分钟内完成。在尝试此操作时，重要的是要记住练习解剖技术，以便在电穿孔处理后，能够将半球以完整的脑膜状态进行培养。在此操作之后，还可进行其他方法，如延时显微成像，以回答更多科学问题，例如目标基因突变如何干扰神经元迁移或树突发育。

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