Ex utero 电穿孔与全半球外植体：一种用于早期皮质发育研究的简单实验方法

本实验的总体目标是制备完整的脑半球组织块，用于研究早期皮层发育。首先在胚胎第13天获取小鼠胚胎，随后将质粒DNA混合物注射到脑室中，并进行离体电穿孔操作。

然后从电穿孔的胚胎中制备整个半球的外植体。最后一步是固定整个半球外植体并进行切片，以用于组织学分析。最终，可通过针对表达GFP的神经元进行免疫组织化学分析，来评估突变或毒素暴露对皮层神经元发育造成的影响。

我叫 Eric Olson。我在雪城大学上州医科大学神经科学与生理学系工作，今天我们将向您展示一种我们开发的方法，称为全半球 X 培养法。与现有的切片培养法相比，该技术的主要优势在于全半球 X 培养的制备过程简单，并可提供长达两天的器官型生长。

该方法有助于解答神经发育领域的一些关键问题，例如特定突变或毒素如何干扰早期大脑皮层的发育。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为在不损伤脑膜的前提下制备整个半脑脑片，往往需要一定练习才能掌握。由于组织对机械损伤极为敏感，解剖及脑片转移步骤较难学习，因此对该方法进行直观演示至关重要。

示范该操作的是我实验室的博士后 Theresa Ozzi 博士。本方案中，请使用市售试剂盒纯化质粒。将质粒 DNA 用水配制成 0.33 毫克/毫升的浓度，并加入快绿染料作为注射示踪剂，终浓度约为 0.02%（重量/体积）。务必对手术器械、工作区域和显微镜进行消毒。

用70%乙醇处理后，通过吸入二氧化碳的方式处死所需数量的Swiss Webster孕鼠（E 13阶段）。取出胚胎后，将其置于盛有冰冻HBSS的10厘米培养皿中，并保持培养皿处于冰冻状态。仔细将每个胚胎从周围的胚外膜组织中分离出来。

现在将每个胚胎单独转移至含有冰冻HBSS的干净培养皿中。使用Hamilton注射器，将2至3微升制备好的DNA注入左侧大脑半球的脑室中。切勿将DNA注入或将注射针靠近计划用于后续分析的皮质区域。

为了进行DNA电穿孔，用镊子轻轻夹住胚胎，并将镊子电极的正极桨片轻放在头部背侧中线位置。将负极桨片轻轻置于胚胎下颌下方。使用BTX 830型号电穿孔仪运行程序，设置为五个30伏脉冲，每个脉冲持续50毫秒，间隔1秒；若使用其他系统，可按照制造商的说明进行相应设置。

将每个胚胎放回冰冻的HBSS中，然后在解剖显微镜下使用两把5号精细镊子进行全半球Explan制备。去除胚胎头部的皮肤和软骨性颅骨。接下来将镊子滑入脑组织下方。

从颅骨中取出完整脑组织时，需解剖并移除电穿孔的半脑，包括附着的中脑组织。注意不要损伤覆盖在解剖侧大脑半球上的脑膜。我们发现，最难以掌握的步骤是在不损伤脑膜的前提下完成电穿孔侧半脑的解剖与移除。

解剖后，使用扩大的1毫升移液器吸头将每个半脑转移至5毫升冰上预冷的HBSS中。如有需要，可将胚胎分别置于12孔组织培养板的不同孔中。接着，将最多六个半脑轻柔地转移至24毫米胶原包被的培养装置上。

将插入物底部朝内侧放入并调整位置。现在，向六孔板中的一个35毫米孔内加入2.7毫升含补充物的培养基。去除插入物上多余的HBSS，将插入物放入含有培养基的孔中，并用移液器将孔中的培养基滴加数滴至每个x explan的表面。

不要增加培养基的体积。我们发现，关键是在 X 外植体上方滴加几滴培养基，使 X 外植体不被培养基完全覆盖。这可能意味着在 X 外植体上方原有的 2.7 mL 培养基基础上再添加多达 400 µL 的培养基。

将培养皿放入一个含有盛水保湿皿的Billups-Rothenberg密封 chamber 中，该 chamber 需预先通入95%氧气至少一分钟。密封 chamber 后断开气体供应管，将 chamber 置于37°C 培养箱中孵育两天，此时前体细胞分裂（prepl splitting）应已完成。

准备中。制作用于包埋样本的垫片。在60摄氏度下配制10%的牛皮明胶溶液。

溶解后，将约10毫升溶液倒入一个10厘米的培养皿中。将剩余溶液保持在60摄氏度以备后续使用。如有需要，让凝胶垫固化约半小时。

它们可在 4 摄氏度下保存数天，但使用前必须恢复至室温。在通风橱内进行固定操作的当天，配制 Pagano 固定液以及不含固定剂的 Pagano 溶液，并将固定液预热至 37 摄氏度。

从培养箱中取出外植体时，需小心且迅速地操作，避免扰动组织。吸除大部分培养基，加入五毫升预热的固定液，确保每个外植体完全浸没。

在室温下固定组织 1 小时。然后去除固定液，并用 Pagano 溶液替代。无固定液。

向每个孔中加入几滴 10% 叠氮化钠。组织样本现在可保存在 4°C，直至包埋在包埋板上。借助直尺在培养皿底部绘制一个网格。

切成2至3厘米的方块。将各个外植体转移至包埋垫上。吸去残留溶液，并用温热的10%明胶溶液覆盖每个外植体。

静置使其凝固。待其缓慢凝固后，逐次加入少量明胶溶液，直至每个外植体完全被包裹。注意避免因一次性加入过多明胶而导致垫层融化。

现在，让明胶凝固约一小时。凝固后，可将每个离体组织切成小块明胶，再进行切片。重要的是，需将组织块在Pagano固定液中后固定一天或两天。

切片时，将外植体的嗅球朝上放置，在冠状面上以100 µm厚度进行切片。将切下的组织片收集至含0.1%叠氮化钠的预冷PBS中。

将切片置于 4 摄氏度保存，直至可使用所述技术进行染色。在预裂解前，于 E13 时期制备全半球外植体。位于背侧新皮层。

该组织携带一种报告基因，可标记兴奋性皮质谱系中的未成熟神经元。来自同窝的皮质外植体在体外培养期间，于两天内依次进行滴加固定，并进行后续组织学分析。在初始分析时间点（体外培养第0天，DIV 0），视野中尚未发生前体细胞的分裂。

CP 开始显现，并持续生长至体外培养第2天（2D IV）。因此，最初在E13阶段培养的整个大脑半球外植体，支持了大脑皮层两天的成熟过程，并捕捉到背侧新皮层中先驱层的分离，以确认背侧新皮层的正常组织学发育。在2D IV时，对外植体进行免疫染色，检测硫酸软骨素、蛋白聚糖以及细胞外基质成分。背侧皮层中出现两条免疫反应带，表明在体外培养期间，PPP已适当地分裂为MZ层和SP层。

PP 被表达 CTIP2 和 TBR1 的六层皮层神经元所界定。这些标志物的免疫染色模式证实了这些转录因子在新形成的皮层中表达恰当。综合上述分析，通过使用完整描述的方案，在整个半球脑片培养模型中证实了器官型早期皮层发育；该实验中，向完整 E13 胚胎的左侧脑室进行了注射。

可在室管膜区（vz）的神经前体细胞中观察到电穿孔并成功表达GFP。虽然在中间带（IZ）和皮层板（cp）中均观察到较强的GFP表达细胞，但重要的是，在正在形成的皮层板顶部可见大量由箭头所示的GFP阳性神经元，这些神经元已长出新生的树突和轴突。皮层板（CP）与边缘带（MZ）交界处形成的清晰分层表明神经元迁移适当、停止及时且层状结构正常。

树突延伸至边缘层（MZ），而皮质下轴突则延伸至CP下方并进入IZ层。不同成熟阶段的分化细胞呈GFP阳性，包括位于放射状胶质纤维旁、具有双极形态的神经元，以及位于其下方IZ层中的多极神经元。树突还延伸至边缘层（MZ），在此处细胞外基质蛋白reelin恰当地呈现免疫定位。

因此，电穿孔与组织块培养条件能够支持皮层神经元的正常发育。如预期所示，有丝分裂后的GFP阳性神经元分布于正在形成的皮层板（cp）中。因此，该方案可可靠地靶向研究L6皮层神经元的迁移与成熟过程。

该方法的广泛使用已实现 79% 的成功率。在 248 次尝试中，有 195 次适用于成像和分析。一半的失败源于未能表达 GFP 或未成功靶向 GFP。一旦掌握该技术，失败率将显著降低。

如果操作得当，该技术可在90分钟内完成。在尝试此操作时，重要的是要记住练习解剖技术，以便在电穿孔处理后，能够将半球以完整的脑膜状态进行培养。在此操作之后，还可进行其他方法，如延时显微成像，以回答更多科学问题，例如目标基因突变如何干扰神经元迁移或树突发育。