前子宫穿孔和整个半球的外植体早期皮质发育的研究:一个简单的实验方法
April 3rd, 2013
该协议介绍了一种改进的外植体的过程，涉及到子宫外
该程序的总体目标是为研究早期皮质发育准备整个大脑半球外表。这是通过在胚胎第 13 天首次收获小鼠胚胎来完成的。接下来，将质粒 DNA 混合物注射到脑室中并进行宫外电穿孔。
然后从电穿孔胚胎中准备整个半球解释。最后一步是固定和切片整个半球解释以进行组织学分析。最终，突变或毒素暴露对皮层神经元发育的影响可以通过表达 GFP 的神经元的免疫组织学分析来评估。
我叫 Eric Olson。我在雪城的纽约州立大学上州医科大学神经科学和生理学系工作，今天我们将向您展示我们开发的一种方法，称为整个半球 X 解释。与切片解释等现有方法相比，该技术的主要优点是整个半球 X 解释易于准备并提供两天的器官型生长。
该方法可以帮助回答神经发育领域的关键问题，例如特定突变或毒素如何破坏早期皮层发育。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在不损坏脑膜的情况下准备整个半球解释可能需要一些练习。这种方法的视觉演示至关重要，因为由于组织对机械破坏的敏感性，解剖和解释转移步骤很难学习。
演示该程序的是我实验室的博士后 Theresa Ozzi 博士。对于该方案，使用市售试剂盒纯化质粒。在水中制备 0.33 毫克/毫升的质粒 DNA，并添加快速绿色染料作为注射示踪剂，体积重量约为 0.02%始终对手术工具、工作区和显微镜进行消毒。
然后，用 70% 的乙醇通过吸入二氧化碳在 E 13 上牺牲了所需数量的瑞士韦伯斯特坝。取出胚胎后，将它们放入 10 厘米的培养皿中，在保持冰冷的培养皿中加入冰冷的 HBSS。小心地从周围的胚胎外膜中解剖每个胚胎。
现在将每个胚胎单独转移到装有 HBSS 冰冷的干净培养皿中。使用 Hamilton 注射器，将 2 到 3 微升制备的 DNA 注射到左大脑半球的脑室中。不要注射到皮质区域或附近，以备将来分析。
要对 DNA 进行电穿孔，请用镊子轻轻握住胚胎，并将镊子电极的正极桨轻轻放在头部的背侧中线。将负桨轻轻放在胚胎下巴下方。使用 BTX 830 型号运行五个 30 伏脉冲的程序，每个脉冲 50 毫秒，间隔为一秒，否则可以根据制造商的说明设置其他系统。
将每个胚胎放回冰冷的 HBSS 中，并在解剖显微镜下使用两个 5 号珠宝镊子进行整个半球 Explan 准备。从胚胎头中取出皮肤和软骨头骨。下一次将镊子滑入大脑下方。
要从颅骨中取出完整的大脑，请解剖掉电穿孔的半球，包括附着的中脑组织。小心不要损坏覆盖在解剖皮质半球上的脑膜。我们发现最难掌握的步骤是在不损伤脑膜的情况下解剖和去除电游行半球。
解剖后，使用加宽的 1 毫升移液器吸头将每个半球转移到 5 毫升冰冷的 HBSS 中。如果需要，可以将胚胎保存在 12 孔组织培养皿的不同孔中。接下来，轻轻地将最多六个半球转移到 24 毫米的胶原包被培养物上。
插入并排列内侧朝下。现在用 2.7 毫升补充培养基填充六孔培养皿的 35 毫米孔。从插入物中取出任何多余的 HBSS，然后用介质移液管将插入物放入孔中，将几滴培养基从孔中滴到每个 x 解释的顶部。
请勿增加介质的音量。我们发现，在 X 解释的顶部滴几滴培养基至关重要，这样 X 外植体就不会完全被培养基覆盖。这可能意味着在 x 解释之上的 2.7 mil 介质中增加多达 400 微升。
将培养皿移入 billups rothenberg 室中，该室包含一个加湿水盘，并注入 95% 的氧气至少一分钟。密封腔室并断开供气管。将腔室放入 37 摄氏度的培养箱中两天，此时准备分离将发生。
准备中。制作用于嵌入解释的垫子。在 10 摄氏度下制作 60% 小牛皮明胶溶液。
溶解后，将大约 10 毫升溶液倒入 10 厘米的培养皿中。将剩余的溶液保存在 60 摄氏度以备后用。如果需要，让垫子半小时凝固。
它们可以在 4 摄氏度下储存数天，但必须在使用前加热至室温。在通风橱中固定的当天，准备 Pagano、固定剂和不含固定剂的 Pagano 溶液。将固定液加热至 37 摄氏度。
从培养箱中取出外植体，不要小心快速地干扰组织。去除大部分培养基，并用 5 毫升加热的固定剂代替。确保每个外植体都完全浸没。
在室温下固定组织 1 小时。然后去除固定剂并用 Pagano 溶液替换。无固定剂。
向每个孔中加入几滴 10% 叠氮化钠。组织现在可以在 4 摄氏度下储存，直到它们包埋在包埋垫上。用尺子在盘子底部画一个网格。
制作 2 到 3 厘米的正方形。将单个外植体转移到包埋垫上。吸走所有残留溶液，并用温热的 10% 明胶溶液覆盖每个外表。
让它凝固。缓慢凝固后，加入更多的明胶溶液，直到每个外植体完全包围。避免熔化垫子，如果一次添加过多的明胶，可能会发生这种情况。
现在，让明胶硬化约一个小时。硬化后，可以在切片前将单个 explan 切成小块明胶。在 Pagano 固定剂中固定块一两天很重要。
切片时。将嗅球向上放置外植体，并在冠状平面上以 100 微米的厚度放置。将切片收集在含 0.1% 叠氮化钠的冷冻 PBS 中。
将切片储存在 4 摄氏度，直到可以使用概述的技术对其进行染色。在主教分裂之前，在 E 13 制备整个半球外植体。在背侧新皮层。
该组织含有一个转基因，该转基因报告了兴奋性皮层谱系的未成熟神经元。将来自同一窝的皮质外植体在体外连续滴加固定，并在 2 天内进行处理以进行后续的组织学分析。在初始分析时间点，DIV 零制备分裂尚未在字段中逐个发生。
CP 变得明显并继续生长到 2D IV.因此，最初在 E 13 培养的整个半球外植体支持了大脑皮层的成熟两天，并在背侧新皮层捕获了主脑分裂，以确认背侧新皮层的正常组织学发育。2D IV 解释是硫酸软骨素的免疫染色， Protag 聚糖和细胞外基质成分。背皮层中的两条免疫反应性带表明在体外培养期间 PPP 适当分裂为 MZ 和 SP。
PP 被 L 6 个皮层神经元分裂，表达 CTIP 2 和 TBR R 1。这些标志物的免疫染色模式证实了这些转录因子在新形成的 cp 中的适当表达。这些分析共同证实了整个半球的器官型早期皮质发育，使用整个描述的方案解释，注射了完整 E 13 胚胎的左心室。
可以从 vz 中的神经元前体中观察到电穿孔和加工的 GFP 表达。虽然在 IZ 和 cp 中观察到强烈的 GFP 表达细胞，但重要的是，在形成 CP 的顶部观察到许多以箭头标记的 GFP 阳性神经元，并带有新兴的树突和轴突。CP 和 MZ 之间界面处的离散层表示适当的迁移、阻拦和层压。
树突延伸到 MZ 中，而皮质轴突延伸到 CP 下方并进入 iz。下面。分化细胞是具有不同成熟状态的 GFP 阳性细胞，包括具有双极形态的神经元与放射神经胶质纤维并列，以及它们下方的 iz 中的多极神经元。树突也延伸到 MZ 中，其中 ECM 蛋白读数蛋白适当地免疫定位。
因此，电穿孔和外植体条件允许皮层神经元的正常发育。正如预期的那样，有丝分裂后 GFP 阳性神经元填充了形成的 cp。因此，该方案可以可靠地靶向 L 六个皮质神经元，以研究它们的迁移和成熟。
广泛使用该程序导致 79% 的成功率。248 次尝试中有 195 次适合成像和分析。一半的失败来自于未能表达 GFP 或错过了目标 GFP 一旦掌握。
如果执行得当，这项技术可以在 90 分钟内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住练习解剖，以便电穿孔半球可以按照此程序培养完整的脑膜。可以执行其他方法，如延时显微镜，以回答其他问题，例如感兴趣的突变如何破坏神经元迁移或树突发育不全。
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概览
该协议描述了一个改进的离体培养程序，包括子宫外电穿孔、解剖和胚胎小鼠整个大脑半球的培养。该准备有助于药理学研究和早期皮层发育过程中的基因功能测定。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 药理学
背景
- 了解早期皮层发育对于洞察神经发育障碍至关重要。
- 子宫外电穿孔允许在胚胎组织中进行靶向基因操纵。
- 整个半球离体培养提供了一个全面的模型来研究皮层神经元发育。
- 组织学分析可以揭示基因修饰对神经元群体的影响。
研究目的
- 准备整个大脑半球离体培养用于研究早期皮层发育。
- 评估突变或毒素对皮层神经元发育的影响。
- 使用离体培养模型促进药理学研究。
使用的方法
- 在胚胎第13天收获小鼠胚胎。
- 将质粒DNA注射到脑室中。
- 进行子宫外电穿孔以引入遗传物质。
- 固定和切片整个半球离体培养用于组织学分析。
主要结果
- 成功准备了整个大脑半球离体培养。
- 在GFP表达的神经元中观察到有效的基因表达。
- 组织学分析证明了基因修饰的后果。
- 可以在离体培养上进行药理学研究以评估药物效果。
结论
- 改进的离体培养程序是研究皮层发育的有价值工具。
- 子宫外电穿孔能够精确操纵基因功能。
- 该模型可以帮助理解环境因素对神经元发育的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Early-stage cortical development models are critical for de-risking neurodevelopmental target hypotheses and enabling predictive evaluation of genetic or pharmacological interventions. The whole hemisphere explant with ex utero electroporation offers a reproducible, organotypic system for interrogating neuronal proliferation, migration, and differentiation. This platform enhances translational continuity and supports robust target validation in neurodevelopmental discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of gene mutations or toxin effects on cortical neuron development.
- Supports mechanistic de-risking by preserving organotypic lamination and migration patterns.
- Facilitates high-confidence target validation through quantitative histological and molecular readouts.
- Improves predictive confidence for early-stage neurodevelopmental targets.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible explant system for downstream pharmacological or genetic screening.
- Delivers consistent transfection and areal targeting for assay development.
- Enables quantitative assessment of neuronal migration and differentiation as screening endpoints.
- Supports platform scalability and reuse for multiple compound or gene function evaluations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neurodevelopmental processes for translational biomarker exploration.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of neuronal phenotypes.
- Reduces risk of late-stage biological failure by modeling early cortical events in vitro.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for neurodevelopmental programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analysis of cortical development in a scalable explant system.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene or toxin effects on neuronal migration and lamination.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of GFP expression, lamination, and migration as comparative readouts.
- Translational Research: Models disease-relevant cortical development for biomarker and phenotype alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable explant platform for diverse neurodevelopmental research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target validation.
- Operational Value: Streamlines preparation, improves reproducibility, and enhances scalability over slice explant models.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and tissue handling to preserve organotypic structure.
- Needs access to electroporation equipment, dissection microscopes, and histological analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible explant preparation and analysis.
- Adaptable to various genetic constructs and pharmacological interventions within the embryonic cortex.
- Success rates depend on technical proficiency in dissection and electroporation steps.
