用于生物医学植入物的石墨烯涂层

本实验的总体目标是展示一种方法，通过在金属形状记忆合金镍钛诺表面涂覆石墨烯，以改善血液接触型植入材料的血液相容性。该方法首先采用化学气相沉积法在铜箔上生长石墨烯；第二步是蚀刻去除铜箔，并将制备好的石墨烯转移至镍钛诺基底上。

接下来，将石墨烯涂层的镍钛合金基底用于培养内皮细胞和平滑肌细胞。为了量化细胞相容性，另一项检测是通过将纤维蛋白原和白蛋白这两种蛋白质固定在石墨烯涂层的镍钛合金基底上，以评估其血液相容性。最终，采用微区拉曼光谱、共聚焦显微镜、体外细胞毒性实验以及SDS-PAGE蛋白质分析，证明了石墨烯涂层的成功制备，并显示出细胞形态改善、细胞活力提高以及更优的血液相容性。

该技术或现有技术（如聚合物涂层）的主要优势在于，石墨烯涂层具有极高的耐久性和抗腐蚀性。该技术的应用前景可延伸至支架技术的改进，因为石墨烯固有的材料特性有望减少蛋白质吸附，并降低因蛋白质构象改变所引发的凝血因子激活。尽管本方法主要针对石墨烯涂层镍钛合金支架提供了研究依据，但也可应用于其他系统，如心脏瓣膜或导管。

首先，将1厘米×1厘米的铜箔放入1英寸石英管炉中，在50 SCCM氢气和450 SCCM氩气氛围下加热至1000摄氏度。接着，在1000摄氏度下，以不同的流速向炉内通入1至4 SCCM的甲烷，持续20至30分钟。最后，在持续通入氢气、氩气和甲烷的条件下，将样品在炉内冷却至室温。

从炉中取出样品后，将其切割成 4.5 毫米的正方形，使用 PMMA 与 4% Anole 稀释后的溶液在铜箔上以 4,000 RPM 转速进行旋涂，随后在 150 摄氏度下热处理 5 分钟。使用 CE 100 蚀刻液蚀刻铜箔，直至铜箔完全被蚀刻。接着用 10% 盐酸冲洗 10 分钟，再用去离子水冲洗 10 分钟。

将石墨烯样品转移至4.5平方毫米的镍钛诺基底上，以获得石墨烯PMMA样品。随后在300 SCCM氩气和700 SCCM氢气氛围中于450摄氏度退火两小时。为去除PMMA，最后用丙酮清洗镍钛诺基底，以溶解残留的PMMA，从而获得石墨烯镍钛样品。

开始进行毒性测试时，将原始镍钛合金、单 SCCM 或四 SCCM 石墨烯-镍钛合金基底加入96孔板中，其中所述的 SCCM 对应于石墨烯化学气相沉积生长过程中所用的甲烷流量。随后，在部分含有原始镍钛合金、单 SCCM 或四 SCCM 石墨烯-镍钛合金基底的孔中接种大鼠主动脉内皮细胞，接种密度为每孔 10⁵ 个细胞。以类似方式，在另一组孔中接种大鼠主动脉平滑肌细胞。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养三天或七天，每隔一天更换一次培养基。在终点时间，吸去含有平滑肌细胞孔中的培养基，每孔加入含有0.5毫克/毫升MTT的新鲜培养基。继续孵育细胞额外三小时。

接下来，轻轻吸出培养基，每孔加入 100 µL 二甲基亚砜。待 MTT 结晶溶解 10 分钟后，将溶液转移至另一块孔板中。对于 MTS 检测，在实验终点时移除含有内皮细胞的孔中的培养基。

加入 120 微升 MTS 溶液，孵育 3 小时。然后将孔内液体转移至新酶标板中。在 490 纳米处读取吸光度，并通过将吸光度归一化至原始镍钛诺样品的平均吸光度来确定细胞活力百分比。

每个样本至少重复此步骤五次。进行大鼠主动脉平滑肌细胞共聚焦成像时，将基底材料置于八孔载玻片中，留出一个孔作为空白对照。随后，将细胞以每孔25,000个细胞的密度接种至所有孔中，并在37°C和5%二氧化碳条件下培养三天。

从载玻片上移除培养基后，用含4%多聚甲醛的PBS缓冲液将细胞在底物上固定20分钟。用PBS洗涤，然后用0.1%Triton X处理1分钟以进行透化。PBS洗涤后，将100微升LOR 4 88 PHIN溶液加入1.9毫升PBS缓冲液中。

用 250 µL LOR 4 88 Phin 对细胞染色 45 分钟，然后用 PBS 缓冲液洗涤两次。接着，使用含 dpi 的荧光封片剂对细胞核进行染色。使用尼康共聚焦 ti 采集共聚焦图像。

在开始白蛋白和纤维蛋白原蛋白吸附实验之前，使用卡尺测量基底的尺寸。对于近似方形样品的每一边，各测量三次并取平均值。为获得长度和宽度，将原始镍钛合金样品、单层石墨烯镍钛合金样品和四层石墨烯镍钛合金样品放入两个12中。

在孔板中加入含有1毫克/毫升白蛋白的PBS缓冲液。将其中一块孔板置于室温下，并分别孵育3小时。用含有1毫克/毫升白蛋白的PBS缓冲液孵育三种样品类型。

用 PBS 洗涤样本后，将纤维蛋白原在室温下放置三小时，将相似样本在微量离心管中与 200 微升还原性上样缓冲液混合，并煮沸五分钟。将样本按 1:9 的体积比稀释于 T 甘氨酸 SDS 缓冲液与去离子水的混合液中，然后在 4 至 15% 的 Tris-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中以 90 伏电压运行 100 分钟。将 Spro 红染液原液用 7.5% 乙酸按 1:5,000 的比例稀释。

接下来，用稀释的Spro Red溶液对凝胶染色60分钟。用铝箔包裹以避光，使用Fluor chem SP成像系统对凝胶进行成像，并使用Image J软件定量荧光强度。然后将每个样品的荧光强度根据底物总面积进行归一化，并比较纤维蛋白原吸附与白蛋白吸附的情况。

化学气相沉积法获得了多晶石墨烯样品，其形貌模拟了铜晶粒。拉曼光谱用于确认在1 SCCM和4 SCCM样品上存在单层石墨烯。1 SCCM样品显示出强烈的GPR峰，表明所制备的石墨烯为单层结构。相比之下，4 SCCM样品的GPR峰相对较弱，证实了存在少数几层石墨烯。此处展示的是将石墨烯转移至镍钛诺基底后的原子力显微镜图像。

对样品进行详细测量后，得到的表面粗糙度值约为五纳米。此处展示了平滑肌细胞在经控制的玻璃载片、原始镍钛合金基底、单标准立方厘米每分钟（SCCM）石墨烯-镍钛合金基底以及四标准立方厘米每分钟（SCCM）石墨烯-镍钛合金基底上生长的共聚焦光学显微镜图像。在两种石墨烯-镍钛合金表面，细胞均呈现高密度和球形形态，表明细胞形态更佳。

MTT和MTS检测结果显示，与原始镍钛合金相比，1 SCCM和4 SCCM的石墨烯-镍钛合金基底在平滑肌细胞活力方面未表现出显著差异。MTS检测显示，内皮细胞在培养三天后的细胞活力与对照组相比无显著差异。扫描电子显微镜图像显示，在原始镍钛合金基底上生长的内皮细胞分布稀疏且呈长条形，而在1 SCCM和4 SCCM石墨烯-镍钛合金基底上则呈椭圆形且密度较高。

这些结果表明，石墨烯涂层可促进内皮细胞形成更佳的球形细胞形态；与原始镍钛合金样品相比，1 SCCM 和 4 SCCM 石墨烯镍钛合金样品表现出较低的纤维蛋白原-白蛋白比值，提示石墨烯可提高血液相容性。纤维蛋白原的能级图与石墨烯的电子态密度图显示了费米能级的平衡。只有当纤维蛋白原分子的占据电子态与石墨烯镍钛合金的未占据电子态处于相同能级时，电子才能从纤维蛋白原转移至石墨烯镍钛合金。

单层和少层石墨烯在室温下均为半金属，其费米能级处的电子密度较低，导致纤维蛋白原向石墨烯的电荷转移较弱。石墨烯的GB带线型或频率未发生任何变化，表明血浆蛋白向石墨烯的电荷转移作用较弱。通过曲线拟合得到的D带解卷积峰以黑色显示，以证明石墨烯作为植入物涂层的有效性和可行性。

一枚铜币表面涂覆石墨烯后被暴露于5%过氧化氢中。该铜币的石墨烯涂层部分保持不变，而未覆盖的部分则被过氧化氢溶液染色。此外，将石墨烯包覆的镍钛诺浸入70%硝酸中后，其石墨烯G带频率未发生改变，证实石墨烯涂层具有极强的耐久性。

此外，石墨烯镀层在石墨烯镍钛合金中降低了底层铜的X速率，表明石墨烯膜具有不透性。观看本视频后，您应能够充分理解如何转移石墨烯并将其应用于生物医学植入物，以提高其生物相容性。