分离，培养和成年小鼠Cardiomyoctyes的功能分析

该程序的总体目标是分离培养并可视化成人镜像心肌细胞的收缩和钙处理。这是通过首先取出 muren heart 并将其置于室温下来实现的。PBS，心脏可以像卡通片中所示在培养皿中插管，也可以直接在连接到灌注系统的针头上插管，就像电影中一样。

第三步是通过泵送灌注、缓冲液，然后通过系统泵送酶缓冲液来洗涤和消化心脏。最后一步是将心室切入转移缓冲液培养皿中，然后用镊子轻轻切碎组织。最终，结果可以通过全细胞和/或肌节长度测量和比率指标显示单个心肌细胞的收缩和钙的处理。

钙指示剂，如 RO 2：00 AM，使用离子光学系统。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为很难在不损坏血管或心脏本身的情况下快速将心脏悬挂在主动脉上。在大约 12 周龄时将 150 USP 的肝素钠注射到成年小鼠的腹部间隙。

如果小鼠脱水，则注射 1 cc 盐水溶液。注射氯胺酮甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠 在体重依赖性剂量下，检查小鼠以确保它们通过后肢脚趾捏反射丧失和呼吸频率减慢而被深度麻醉。将镇静小鼠固定在手术垫上，然后切除心脏并将其放入生理盐水培养皿中。

使用 opti vision 解剖护目镜，识别并暴露主动脉。细胞分离不需要去除主动脉周围的组织。只要主动脉根部清晰可见，就用灌注缓冲液灌注泵。

开始快速泵送以填充管路并检查是否有气泡。然后以慢速泵送，以设置心脏灌注的流速。使用循环水浴将灌注缓冲液的温度保持在 37 摄氏度。

使用显微解剖钳将主动脉像袜子一样放在针头上。确保针头的末端位于升主动脉中，最好位于右侧无名主动脉远端的主动脉根部。接下来，通过在主动脉顶部系上 10 厘米长的缝合丝，将心脏固定在针头上。

确保系带位于右无名动脉下方的升主动脉水平，但也位于针头末端上方和主动脉瓣上方。现在将心脏降低到圆锥形的内部。这有助于保持环境温度。

以每分钟 1 毫升的速度用灌注缓冲液灌注心脏 5 分钟，并固定玻璃腔流出处，使 PERFU 8 聚集在锥形玻璃中并包裹心脏。此时，您应该会看到心脏的体积增加。此外，心脏组织中的血液将被 PERFU 8 引起组织取代。帕洛尔。

停止泵，将管路从灌注缓冲液容器移动到酶缓冲液容器中。松开流出口夹以排空 PERFU 8。重新启动泵以开始灌注心脏。

用酶缓冲液以每分钟 1 毫升的速度，再次夹住流出处，让酶缓冲液包裹心脏。这里。当酶渗透到心脏并消化结缔组织时，心脏会变得苍白，结构完整性会减弱。对于新手来说，将灌注管与压力计连接会很有帮助。

压力计也可用于确保针头的位置位于主动脉瓣上方，而不是在心室中。低压表示针头在心室内，高压表示针头接触瓣膜。当心脏被消化时，压力会迅速下降，因为结缔组织无法保持阻力。

为了确定何时从消化的心脏中切开心室，将心脏从锥形玻璃中取出，用镊子轻轻挤压心脏，然后在一个小培养皿中收集几滴 PERFU 8 进行检查。如果单个细胞在 8 到 10 分钟内下降，则心室压力会下降，您应该能够看到单个细胞进入 Perfu。八 当第一次看到任何一个时，将心室从心脏切开，放入一个装满转移的培养皿中，缓冲液 A 进行更均匀的制备。

切开并切除右心室，留下左心室切碎和研究。如果对右心室感兴趣，可以在分离后将其切碎。使用显微解剖钳分别切碎每个心室，成功的消化在切碎后几乎不会留下固体组织块，大部分组织在解离时变得无定形。

为了进一步解离组织，请将其流经已切割尖端的塑料粘贴移液器。以 45 度角，使用夹子将一块方形网片固定在一个小漏斗上，然后将该过滤装置放入 15 毫升的试管中。使用改良的牧场移液器从培养皿中取出细胞溶液，并将溶液过滤到 15 毫升试管中。

让活细胞沉降到试管底部，这需要几分钟。将体积分成两管可更快获得。阿里之后的造粒。

将四种钙溶液中的每一种 2.5 毫升加入四个独立的 15 毫升试管中。使用标准移液器小心地将沉淀的细胞沉淀转移到第一种钙溶液中。让细胞沉降到试管底部并重复该过程。

通过每种钙溶液转移沉淀的细胞。当细胞转移到第四种钙溶液中时，盖上试管并将其侧翻。为 MM SIS 系统供电，确保首先启动弧光灯。

然后用钙缓冲液灌注系统 B.将泵的管子连接到 MM 顺式腔室的相应入口和出口。在腔室中固定适当大小的玻璃盖玻片，通常为 20 x 25 毫米。将 500 μL 细胞溶液转移到一个小的 eend 孤儿管中。

2：00 AM 向细胞中加入 0.5 μL PHE，并在房间变暗后让它们在室温下在黑暗中孵育 5 到 7 分钟。现在小心地开始让钙缓冲液 B 流过腔室。一旦液流开始，就开始将腔室温度提高到 37 摄氏度。

根据细胞浓度，使用改良移液器将一滴或两滴细胞溶液加载到盖玻片上，并让细胞沉淀。腔室中单元的密度。应该是这样的，单个不重叠的单元可以很容易地在 sys 数据采集平台中。

确保腔室通过连接线连接到 myo Pacer，然后开始设置实验的电压和频率。选择一个以正确频率跳动的单元格，并将其移动到取景光圈中。调整相机和取景孔径尺寸，使整个单元格位于窗口的中心，水平指向 sarco 镜子。

接下来，将框放在包含明确定义的肌节的细胞区域中，并调整焦点以优化功率谱的峰值。还要调整显微镜的亮度，以优化蓝色平滑窗口和黑色对比度信息。打开照片乘数并开始录制。

记录足够的数据后，单击 pause 暂时停止记录。不要点击 stop。这将终止录制，并且无法为该单元格录制任何背景。

现在，在不改变观察窗口的焦点或尺寸的情况下，将显微镜载物台移动到盖玻片上看不到细胞或细胞材料的区域。然后点击 恢复 记录背景测量。录制足够的背景后，单击 Stop 终止录制。

然后单击文件保存以保存该细胞的所有痕迹在单个 ZPT 文件中，成体心肌细胞的分离导致杆状条纹和静止细胞，这些细胞不会自发地跳动箭头，显示圆形死细胞，没有条纹。可以培养静止细胞并用腺病毒转染以纵基因表达。培养 24 小时后，活细胞的形态没有改变。

它们仍然耐钙，可以通过场刺激来调节。85% 至 90% 活细胞的产量是可行的。MM SIS 系统用于测量来自野生 C 型 57 black six 小鼠的肌细胞的收缩力和钙瞬变。同时。

通过测量 fira 2：00 AM 比率的结合形式与未结合形式的比率来测量收缩性和钙处理，测量值可能因设置而异，但健康细胞的得分通常在 1.5 到 2.5 之间。为了分析来自收缩性和钙迹线的数据，对迹线进行平均，为每个细胞创建一个特征迹线。使用在 sys 软件中发现的单瞬时数据分析算法，从特征轨迹中生成收缩压和舒张功能的参数。

看完这个视频，你应该对如何分离单个成体海洋心肌细胞有一个很好的了解。