Name: 分离，培养和成年小鼠Cardiomyoctyes的功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-24T18:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 学习使用Langendorff灌流系统分离成年小鼠心肌细胞，并进行培养、转染及钙处理功能分析。该方法适用于心血管生物学研究，可观察细胞收缩与基因表达调控。

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1. 心肌细胞分离
材料（图1）
显微解剖镊子 
组织镊子 
精细止血镊 
止血镊 
显微解剖用锯齿状弯头镊子 
直头手术剪 
弯头手术剪 
15 ml Falcon 离心管（5 个） 
60 mm 培养皿 
磷酸盐缓冲液（PBS） 
尼龙筛网 - 孔径 400 μm 
小型漏斗 
蜡涂层编织丝线 4-0，19 mm，长 7-10 cm 
非皮下注射针头，钝头，24 G 或商用动物喂养针头（24 x 1 英寸，W/1-1/4） 
肝素钠 
氯胺酮/赛拉嗪混合液 
巴斯德吸管 
OptiVision 解剖护目镜 
IonOptix MMSYS 系统
注意：如果培养细胞，请在开始本方案前参阅第2节关于细胞培养的内容。
注意：所有小鼠均在屏障设施中饲养，并根据批准的IACUC法规、操作规范和程序进行安乐死。
注意：在开始操作之前，应预先加热整个系统，以确保兰格多夫系统（图2A，图3）的所有组件均升温至37 °C，从而保证胶原酶的充分且完全的活性。
<ol>
	<li>将成年小鼠（约12周龄）腹腔注射150 USP单位肝素钠。</li>
	<li>按体重依赖剂量注射氯胺酮/赛拉嗪混合物进行麻醉（表1）。
	<ol>
		<li>80:12 mg/kg 氯胺酮:赛拉嗪配方：2.6 ml 氯胺酮（100 mg/ml）+ 0.4 ml 赛拉嗪（100 mg/ml）+ 37 ml PBS。终浓度：氯胺酮 = 6.5 mg/ml；赛拉嗪 = 1 mg/ml</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将麻醉后的小鼠固定于手术垫上，取出心脏并置于盛有室温PBS或0.9%生理盐水的培养皿中（图1J）。生理盐水可使完整心脏保持收缩，有助于心腔内血液排出，并在步骤1.6之前更易识别主动脉。在开胸术开始前，需确认小鼠已深度麻醉，表现为后肢脚趾夹捏反射消失及呼吸频率减慢。</li>
	<li>使用OptiVision解剖护目镜（图1A）识别并暴露主动脉。虽然清除主动脉周围组织有助于血管可视化，但如果主动脉根部清晰可见，则此操作对于细胞分离的优化并非必需。</li>
	<li>用灌注缓冲液预冲灌注泵（表2）。整个操作过程中应使用控温循环水浴将温度维持在37 °C（图2D）。</li>
	<li>将心脏安装到Langendorff装置上（图2A）。使用两把显微解剖镊子（图1D-E），将远端带有硅胶管的非穿刺性钝头针（24 G）插入主动脉根部进行预冲。也可使用商用动物喂养针（24 x 1 in, W/1-1/4）。24 G针或动物喂养针上的硅胶管可用于固定缝线于凹槽处。将主动脉像穿袜子一样套在针头上（图2C）。
	<ol>
		<li>注意：必须确保针头末端位于升主动脉内，理想位置为主动脉根部，位于无名动脉远端，但不得穿过主动脉瓣进入左心室，否则将严重影响缓冲液通过冠状动脉有效灌注心脏的能力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用一段较短的缝合丝线（7–10 cm长）（图1K）在主动脉顶部结扎，将心脏固定于针头，确保结扎位置位于升主动脉水平，在右无名动脉下方，但高于针头末端。</li>
	<li>将心脏放入锥形玻璃容器内部（图2B），以帮助维持适宜的环境温度。</li>
	<li>以1 ml/min的流速用灌注缓冲液灌注心脏5分钟，并夹闭玻璃容器的流出管，使灌注液积聚在锥形玻璃容器中并包裹心脏。心脏消化过程示意图见图3。
	<ol>
		<li>此时应观察到心脏体积增大。此外，心肌组织中的血液将被灌注液取代，导致组织颜色变苍白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>松开流出管夹，排出灌注液。停止灌注泵，将管路从灌注缓冲液容器切换至酶解缓冲液容器（图2E）。重新启动泵，以1 ml/min流速开始用酶解缓冲液（表2）灌注心脏。再次夹闭流出管，使酶解缓冲液包裹心脏。
	<ol>
		<li>在此阶段，随着酶液灌注并消化结缔组织，心脏将变得更苍白，结构完整性下降。</li>
		<li>为判断何时从消化后的心脏上剪下心室，可将心脏从锥形玻璃容器中取出，用镊子轻轻挤压心脏，并在小型培养皿中收集几滴灌注液，观察是否有单个细胞脱落。</li>
		<li>对于初学者，建议将灌注管路连接压力计。当心脏被消化时，由于结缔组织无法维持阻力，压力会迅速下降。压力计也有助于初学者确认针头位置是否位于主动脉瓣上方而非心室内。低压提示针头位于心室腔内，高压则提示针头接触瓣膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当心室压力开始显著下降，或在灌注液中可见单个细胞时，将心室剪下放入盛有转移缓冲液（A）的培养皿中（表2）。此过程通常需要约7–10分钟。</li>
	<li>再次使用显微解剖镊子（图1C），将心室剪切成小块以进行解离。成功的消化应在剪碎后几乎无固体组织块残留，大部分组织在解离后呈无定形状态。
	<ol>
		<li>为进一步解离组织，可使用尖端以约45°角剪切的塑料巴斯德吸管（图4）反复吹打溶液。该改造可增加吸管尖端的内径，从而在组织吹打过程中降低对细胞的剪切应力。</li>
		<li>在用镊子解剖组织前，可先分离各个心腔，并分别解离心房、左心室或右心室细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用夹子将方形网筛（图1M）固定在小型漏斗（图1L）上，并将该过滤装置放入15 ml Falcon管中（图1I）。</li>
	<li>使用改造后的巴斯德吸管从培养皿中吸取细胞悬液，并过滤至Falcon管中。</li>
	<li>让活细胞自然沉降至管底（活细胞沉降通常需2–4分钟）。</li>
	<li>分别取四种钙溶液各2.5 ml（表3），分装至4个独立的15 ml Falcon管中。</li>
	<li>再次使用标准巴斯德吸管，小心吸取管底的细胞沉淀，并将细胞转移至第一种钙溶液中。</li>
	<li>让细胞沉降至管底，随后在后续的钙溶液中重复步骤1.17，直至细胞进入最后一个溶液中。</li>
	<li>细胞不得在第四种钙溶液中沉降。盖紧管盖并将管子侧放。</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>分离前，将1 µg/mL天然小鼠层粘连蛋白包被到玻璃盖玻片上，在37 °C、2% CO2条件下孵育至少1小时。同时将铺板和培养基（表4）放入37 °C、2% CO2的培养箱中预热，使培养基中的溶解CO2达到平衡。
	<ol>
		<li>不要取下培养基瓶盖，仅松动瓶盖即可，以避免污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让分离的细胞在Falcon管底部自然沉淀成团。</li>
	<li>用标准塑料巴斯德吸管吸出沉淀，并用适量铺板培养基重悬细胞。</li>
	<li>将细胞接种至经层粘连蛋白包被的盖玻片上，置于适当大小的培养皿中，在37 °C、2% CO2条件下孵育至少30–60分钟，使细胞充分贴附于盖玻片。</li>
	<li>**若使用腺病毒转染，将病毒用适量铺板培养基稀释，替换培养皿中的铺板培养基，加入含病毒的培养基。在37 °C、2% CO2条件下孵育2小时，使病毒与细胞作用。**</li>
	<li>移除铺板培养基，更换为培养基。</li>
	<li>每天小心更换培养基，避免扰动盖玻片上的细胞。</li>
</ol>
采用此方法，细胞已成功培养长达72小时。培养后转染GFP的细胞图像见图5。
3. MMSYS 系统
<ol>
	<li>启动 MMSYS 系统，确保首先开启弧光灯。</li>
	<li>将泵的管路连接至 MMSYS 腔室的相应入口和出口（图6）。</li>
	<li>用钙缓冲液（B）（表2）对系统进行预灌注。</li>
	<li>将适当尺寸的玻璃盖玻片放入腔室内并固定（图6E）。大多数 MMSYS 腔室使用 22 mm 或 25 mm 的方形盖玻片。请查阅您的 MMSYS 用户手册以确定适用于您腔室的盖玻片。</li>
	<li>将 500 μl 细胞悬液转移至一个小型离心管中。</li>
	<li>向该小管的细胞悬液中加入 0.5 μl Fura2-AM（储存液浓度为 1 μg/μl），在室温避光条件下孵育 5–7 分钟。此步骤使 Fura2-AM 通过细胞膜的快速被动扩散进入细胞，完成&#34;加载&#34;。
	<ol>
		<li>让加载了 Fura-2 的细胞沉降至管底，用 500 μl 钙缓冲液 B 洗去多余的 Fura。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭室内灯光。</li>
	<li>使用标准巴斯德移液管，将 1–2 滴（根据细胞浓度而定）已&#34;加载&#34;的细胞悬液滴加至腔室中央（图6C），静置 5 分钟使细胞沉降并贴附于盖玻片上。
	<ol>
		<li>腔室内的细胞密度应适中，以便在 MMSYS 数据采集平台上能够清晰观察到单个、不重叠的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地开始向腔室内灌注钙缓冲液（B）。</li>
	<li>将腔室温度升至 37 °C。
	<ol>
		<li>重要提示：必须在开始灌注后才能开启加热装置，否则可能严重损坏反馈热电偶（图6A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保腔室通过连接线与 MyoPacer 相连（图6B），并以细胞起搏阈值的 1.5 倍频率开始以 5 Hz 起搏细胞。</li>
	<li>选择一个以正确频率搏动的细胞，并将其移至成像窗口中央。</li>
	<li>调整相机和成像窗口的尺寸，使整个细胞居中，呈水平方向，且肌节清晰可见。
	<ol>
		<li>为测量细胞长度，将红色和绿色（右、左）光电二极管指示器调整至细胞边缘。调节对比度，以优化细胞边缘的黑白对比度。更多细节请参阅 Ionoptix 操作手册。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在细胞中肌节结构清晰的区域放置测量框，并调节焦距以优化功率谱峰值（红色）。同时调节显微镜亮度，以优化蓝色平滑窗口和黑色对比信息。</li>
	<li>调节绿色阈值条，尽可能包含红色功率谱（峰值），同时尽量减少背景信号。</li>
	<li>开始记录。</li>
	<li>记录足够数据后，点击&#34;暂停&#34;以暂时停止记录，并确保成像窗口的焦距和尺寸未发生改变，移动显微镜载物台至盖玻片上无细胞或细胞碎片的区域。记录时长根据研究者的实验方案而定。
	<ol>
		<li>注意：点击&#34;停止&#34;将终止记录，且无法为该细胞记录背景数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击&#34;继续&#34;以记录背景信号。</li>
	<li>记录足够背景信号后，点击&#34;停止&#34;以结束记录。</li>
	<li>点击&#34;文件 >> 保存&#34;，将该细胞的所有轨迹数据保存为单个 .zpt 文件。</li>
	<li>重复步骤 3.12 至 3.20，直至完成足够数量细胞的记录。</li>
	<li>请参阅 IonOptix-MMSYS 用户手册第 12 版，了解所记录数据的分析方法。野生型心肌细胞的典型记录数据如图7所示。</li>
</ol>
4. 膜片钳
不同细胞类型的膜片钳技术此前已在本期刊中有详细描述25-28。因此，我们重点介绍使用本方案分离的成年心肌细胞进行成功膜片钳记录的一些关键参数。
<ol>
	<li>使用拉针仪和含丝硼硅酸盐玻璃管（外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长度 10 cm）拉制玻璃微电极，当其充满电极内液（表 5）时，阻抗应约为 2.0–3.0 MΩ。</li>
	<li>使用Narishige或其他垂直火焰抛光仪轻柔地对电极尖端进行火焰抛光。火焰抛光后，膜片钳电极的阻抗应为 2–4 MΩ。</li>
	<li>开启计算机、放大器（Axopatch 200B）、A-D转换器（Digidata 1440A，Axon Instruments）和显微操作器（MP-285）。进行全细胞膜片钳记录时，我们采用此前描述的标准参数设置。</li>
	<li>对于培养的成年心肌细胞（CMs），从培养箱中取出后，在室温下用PBS轻柔清洗接种有细胞的盖玻片。</li>
	<li>轻柔取出盖玻片，并将其置于倒置显微镜（Nikon TE 2000）的灌流 chamber 中。
	<ol>
		<li>确保灌流系统的入口和出口（用于抽吸）刚好位于盖玻片表面之上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始灌注适当的细胞外溶液（表 5）。</li>
	<li>对于新鲜分离的成年心肌细胞（CMs），将涂有胶原的盖玻片按上述方式放入灌流系统中。
	<ol>
		<li>由于细胞处于溶液中，需轻柔地用细胞外缓冲液替换原有溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用改良的巴斯德吸管（图 4），在细胞外缓冲液中轻柔重悬细胞，取适量体积滴加至盖玻片上。</li>
	<li>让细胞贴壁 10–15 分钟，然后按照步骤 4.4 开始灌注。</li>
	<li>使用 Microfil 针头（World Precision Instruments，28 G）将细胞内液反向填充至全细胞膜片钳电极中。确保电极尖端无气泡；可轻敲电极，使气泡上浮至溶液表面。</li>
	<li>将填充好的膜片钳电极连接至电极夹持器，确保微电极与内部溶液之间保持良好接触。
	<ol>
		<li>我们使用氯化银电极，但需注意每周至少一次将银丝浸入家用漂白剂中过夜，以完成“氯化”处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻柔地将电极浸入浴槽液中，确保浴槽电极始终完全浸没在浴液/细胞外溶液中。此时应校正任何液接电位。较大的液接电位可能提示电极上的氯化银已发生退化。</li>
	<li>在显微镜下识别健康的圆柱形成年心肌细胞（CMs），并将其置于视野中央。如前所述，通过调节显微操作器移动电极并调整焦距，使膜片钳电极接近心肌细胞表面。
	<ol>
		<li>当电极与细胞处于同一焦平面时，结合细胞图像观察与测试脉冲（Axopatch 200B 提供）进行定位。</li>
		<li>一旦电极阻抗下降约一半（提示电极已接触细胞表面），且细胞仍保持圆柱形态，即可施加轻柔负压以形成吉欧姆密封（gigaohm seal）。</li>
		<li>对于心肌细胞（CMs），我们倾向于采用口吸方式施加负压。若成功形成吉欧姆密封，再通过轻柔、有节奏的口吸“破入”细胞，建立全细胞膜片钳模式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>健康心肌细胞（CMs）的典型静息电位约为 -85 至 -90 mV。获得吉欧姆密封后，使用电流钳模式（I = 0 pA）测量静息膜电位。
	<ol>
		<li>若静息膜电位发生去极化，可能提示细胞受损或密封质量不佳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由于心肌细胞（CMs）体积较大、表面积较广，在研究快速激活的电流（如钠通道电流）时，必须特别注意电容补偿。若无法通过脉冲发生器内置的补偿功能实现充分的电容补偿，则可施加阈下电压、反极性的预脉冲，并将所得电流从记录信号中扣除。此类方案可在Axopatch中轻松编程实现。</li>
	<li>建立全细胞膜片钳模式后，等待 15 分钟，以确保细胞内环境达到平衡，并确认密封稳定性，之后再开始电压钳或电流钳实验程序。我们采用本期刊及其他期刊先前已描述的标准实验程序，此处不再赘述。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在本报告中，我们描述了从小鼠心脏成功分离和培养成年心肌细胞（CM）所需的技术。我们的技术可进一步利用上述方法对CM的功能和兴奋性进行研究。研究成年CM功能性的关键参数在于所分离CM的健康状况和质量。如上所述，我们的技术能够获得大量具有功能的细胞，这些细胞可在培养条件下通过腺病毒/慢病毒感染进行基因表达操作，并可用于细胞兴奋性和收缩功能的分析。
分离功能性成年小鼠心肌细胞（CMs）最重要的参数之一，是将心脏精确且迅速地套接到非皮下注射针头上。必须确保将连接左心室的主动脉解剖至足够长度，以便更轻松、快速地完成心脏插管。插管时，针头尖端必须停留在升主动脉内，不得穿过主动脉瓣进入左心室，以确保灌注液能通过冠状动脉有效灌注组织。下一步关键操作是使用丝线将主动脉固定在针头杆上。结扎应位于升主动脉处，使灌注缓冲液逆向流入冠状动脉和左心室腔，而不会顺向从解剖后的主动脉远端或大血管流出。
一些研究者发现，安装压力计有助于评估插管质量以及后续的酶灌注效果。使用压力计时，左心室的初始压力应为约 80 - 100 cmH2O，当...

小鼠心血管疾病模型已被用作阐明基本疾病机制1,2 以及识别潜在治疗靶点1,3的有效工具。特别是，获得性心脏病（如压力超负荷）的小鼠模型4,5 和转基因小鼠模型的应用，已显著推动了我们对心脏病的理解6-8。细胞培养技术被用于在单细胞水平上研究信号级联3,9,10 以及心脏细胞兴奋性和兴奋-收缩耦联过程中关键蛋白的变化11-13 ，这些研究补充了in vivo小鼠模型的不足。然而，目前缺乏能够反映成年心肌细胞（CM）结构与功能的合适细胞系，这构成了一个重大局限。研究人员曾试图通过在异源表达系统中研究单个蛋白（如离子通道）来克服这一问题14，尽管这些研究在离子通道生物物理特性或蛋白转运方面提供了有用信息，但无法充分模拟CM的天然微环境，仍是一个显著缺陷。其次，由于大多数此类异源表达细胞缺乏成熟的收缩装置，因而无法研究收缩功能以及细胞兴奋性与收缩之间的复杂相互作用。正因如此，研究人员已转向使用原代心肌细胞培养来进行许多in vitro功能研究。最后，分离的心肌细胞研究能够在排除多细胞体系中混杂因素（包括瘢痕或纤维化以及纤维取向的影响）的情况下，评估收缩功能。
原代新生大鼠心室心肌细胞（NRVMs）相对易于培养，可通过腺病毒和慢病毒感染来调控基因表达15，因此已被成功应用1，但其自身也存在局限性。尽管NRVMs可提供生理性的微环境1，并长期作为信号转导研究的主要工具，但其形态学和亚细胞结构与成年心肌细胞存在显著差异，使其难以准确模拟成年心脏中离子流动及兴奋-收缩耦联过程。尤为突出的是，NRVMs缺乏明确的横管（t-tubule）系统4。由于Ca2+的流动与动态变化高度依赖于成熟的横管系统和肌浆网（SR）结构6，因此在NRVMs中对Ca2+动态及心肌收缩功能的研究无法准确反映成年心肌细胞中的关键生理过程。此外，新生期与成年小鼠在某些信号通路组分上存在差异9，这进一步限制了利用NRVMs研究疾病过程及其对细胞兴奋性和收缩性影响的适用性。最后，其收缩装置的分布导致细胞缩短呈多方向性和非均匀性，从而限制了收缩功能测量的准确性。
因此，使用分离的成年心肌细胞可提供更准确的结果 体外 模型系统。通过遗传操作小鼠所实现的知识飞跃，凸显了获取小鼠功能性分离心肌细胞的重要性。事实上，对从小鼠模型中分离出的成年心肌细胞（CMs）进行表征，已揭示了许多生物学和病理学事件的机制。利用转基因小鼠模型分离得到的心肌细胞，使得研究人员能够在单细胞水平上研究特定蛋白功能的获得或缺失对收缩特性的影响。2,16，以及在缺血/再灌注等疾病模型中的存活率17,18，从而补充从……获得的信息 体内 对这些小鼠的研究。使用获得性心脏病小鼠模型分离的成年心肌细胞3,19,20 （如通过横主动脉缩窄诱导的压力超负荷，模拟高血压或主动脉瓣狭窄）或运动5,21 （用于模拟生理性心肌肥厚）可使我们能够在单细胞水平上研究参与这些过程的信号级联与细胞兴奋性及兴奋-收缩耦联之间的相互作用。此外，利用腺病毒介导的基因表达对成年心肌细胞（CMs）进行基因表达操控，使我们能够解析复杂信号通路中的各个组分。 
从电生理学角度来看，对分离的成年心肌细胞（CMs）进行全细胞电压钳和电流钳实验，对于阐明基础状态下以及各种疾病状态下离子流的特性至关重要。由于成年心肌细胞的细胞膜结构复杂，且其蛋白质支架结构与新生大鼠心肌细胞（NRVMs）或异源细胞系存在差异，因此能够对成年心肌细胞进行膜片钳记录，可更真实地反映特定膜蛋白、结构蛋白以及离子通道相互作用分子对成年心脏电生理特性的影响。
尽管成年小鼠心肌细胞在研究中具有显著优势，但分离和培养成年小鼠心肌细胞一直存在挑战，因此迫切需要系统而准确地描述一种可分离出活细胞的小鼠心肌细胞分离方法，并建立可在体外培养中维持其活性的技术体系，以支持后续利用病毒载体进行基因操作。以往的研究多采用急性分离的小鼠成年心肌细胞或培养的大鼠成年心肌细胞。后者相比成年小鼠心肌细胞更易于培养，且大多数基因表达调控实验 体外 使用了大鼠成年心肌细胞（CMs）。少数研究成功地对小鼠成年CMs中的功能基因表达进行了改造与探究，这在实验范围上存在较大局限性。因此，本文详细介绍了基于先前研究改进的、用于分离7,8,22, 培养3,10,15,23腺病毒转染11-13,15以及成年小鼠心室心肌细胞的功能分析。该分离方案可获得具有钙2+耐受性强、具有兴奋性的心肌细胞，我们已成功培养长达72小时，并利用腺病毒进行瞬时转染。可使用MMSYS成像系统评估这些分离细胞的功能性。14,24 以及膜片钳技术，相关内容也将在下文讨论。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖最低量</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟</td><td>Sigma</td><td>B0752</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶B</td><td>罗氏应用科学</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>罗氏应用科学</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>灰色链霉菌蛋白酶XIV</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基</td><td>Sigma</td><td>51411C</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>氯化铯</td><td>Sigma</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=zh&amp;&region=US&quot; 目标=&quot;_blank">289329&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷镁盐</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基&amp;#8211;thylether)-N,N,N',N'-四乙酸</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铯溶液</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>四乙基氢氧化铵溶液</td><td>Sigma</td><td>86643</td><td></td></tr><tr><td>OptiVisor 光学玻璃双目头戴放大镜</td><td>Dohegan Optical Company Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>组织镊，5.5&quot;，1×2 齿</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>莫洛尼钳 - 4.5&quot; （11.5 cm）长，轻度弯曲，带锯齿 </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子，Dumostar，尖端尺寸 0.17 × 0.10 mm</td><td>罗博兹科学公司</td><td>RS-4966</td><td></td></tr><tr><td>Packer 蚊式止血钳 5&quot; 直型扁平</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-7114</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪 4.5&quot; 弯曲双刃/双刃 </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5917</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪 3.5&quot; 直型锐缘/锐缘20毫米</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5907</td><td></td></tr></tbody></table>

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

原代心肌细胞（CMs）在培养中的应用为小鼠心脏疾病模型提供了有力补充，极大地推动了我们对心脏疾病的理解。特别是，研究离子稳态、离子通道功能、细胞兴奋性以及兴奋-收缩耦联，及其在疾病状态和致病突变下的改变，已为心脏疾病的机制提供了重要见解。此外，目前尚缺乏能够有效模拟成年CMs的永生化细胞系，而新生CMs在培养中存在诸多局限（缺乏成年CMs许多典型的结构与功能性生物力学特征），这阻碍了我们对成年心脏中信号通路、离子通道与收缩特性之间复杂相互作用的深入理解，从而进一步凸显了研究成年分离心肌细胞的重要性。本文介绍了从成年小鼠分离心肌细胞、细胞培养、利用腺病毒表达蛋白调控基因表达，以及后续功能分析的方法。这些技术的应用将有助于深入揭示调控细胞兴奋性、Ca2+ 动态变化和收缩功能的信号通路机制，并为心血管疾病提供更具生理相关性的表征。

成年心肌细胞的分离可获得杆状、有横纹且静息状态（不自发搏动）的细胞（图5A）。死亡细胞呈圆形，且无横纹结构。静息状态的细胞可用于培养，并可通过腺病毒转染以调控基因表达（图5B和图5C）。培养24小时后，活细胞的形态未发生改变，仍具有Ca2+耐受性，并可通过电场刺激进行起搏。采用本方案可获得80–90%的活细胞得率。
为了测量细胞的收缩力，MMSYS 系统软件利用显微镜提供的相位信息，报告肌节长度或细胞长度的变化。图 7A 展示了通过肌节长度测量获得的野生型 C57BL6 小鼠细胞收缩力的代表性曲线。对于来自这些小鼠的健康成年心肌细胞，其基础肌节长度约为 1.7–1.9 μm。MMSYS 系统软件能够同时测量收缩力和钙处理能力，方法是测定钙激活荧光染料 Fura2-AM 的结合态与非结合态的荧光比值。尽管不同实验条件下比值可能存在轻微差异，但健康细胞的比值通常在 1.5–2.5 之间（图 7B）...

本文介绍了使用兰格多夫灌流系统分离成年小鼠心肌细胞的方法。所获得的细胞具有钙耐受性，电生理静息，并可进行培养，以及利用腺病毒或慢病毒感染来调控基因表达。此外，还可利用MMSYS系统和膜片钳技术分析其功能特性。

原代心肌细胞（CMs）在培养中的应用为小鼠心脏疾病模型提供了有力补充，推动了我们对……的理解

本实验的总体目标是从成年小鼠心肌细胞中分离、培养并观察其收缩及钙处理过程。首先取出小鼠心脏并置于室温下的磷酸盐缓冲液（PBS）中，随后可在培养皿中对心脏进行插管（如示意图所示），或直接将其插到连接灌流系统的针头上（如视频所示）。第三步是通过灌注泵将缓冲液和酶缓冲液依次泵入系统，对心脏进行冲洗和消化。最后一步是将心室剪下放入盛有转移缓冲液的培养皿中，用镊子轻轻剪碎组织。最终可通过全细胞或肌节长度测量及比率测定法，观察单个心肌细胞的收缩情况和钙离子处理能力。像 RO 2:00 AM 配合离子光学系统这样的钙离子指示剂。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为快速通过主动脉悬挂心脏而不损伤血管或心脏本身具有挑战性。在约 12 周龄的成年小鼠腹腔内注射 150 USP 的肝素钠。如果小鼠脱水，需注射1毫升生理盐水。通过注射氯胺酮与甲苯噻嗪混合物对小鼠进行麻醉。根据体重给予相应剂量，并通过检测后肢脚趾夹捏反射消失及呼吸频率减慢，确认小鼠已进入深度麻醉状态。将麻醉后的小鼠固定于手术垫上，随后取出心脏并置于盛有生理盐水的培养皿中。使用 opti vision 解剖护目镜识别并暴露主动脉。进行细胞分离时，无需去除主动脉周围的组织。只要主动脉根部清晰可见，即可用灌注缓冲液预冲泵。以较快的速度开始泵入液体，以充满管路并检查是否存在气泡。随后以较慢速度泵入，以设定心脏灌注的流速。使用循环水浴将灌注缓冲液的温度维持在 37 °C。使用显微解剖镊子将主动脉像穿袜子一样套在针头上。确保针头末端位于升主动脉内，理想位置是在右无名动脉远端的主动脉根部。接着，用一段10厘米长的缝合丝线在主动脉顶部结扎，将心脏固定在针头上。确保结扎位置位于升主动脉水平，在右无名动脉下方，但同时要高于针的末端且高于主动脉瓣。现在将心脏向下放入锥形容器内部，这有助于维持环境温度。以每分钟1毫升的流速用灌注缓冲液灌注心脏5分钟，并夹闭玻璃室的流出管，使灌注液在锥形玻璃腔内积聚并包裹心脏。此时，应观察到心脏体积增大。此外，心肌组织中的血液将被灌注液取代，导致组织出现苍白。停止泵的运行，将管路从灌注缓冲液容器移至酶缓冲液容器。松开出流夹，排空 PERFU 八。重新启动泵，开始对心脏进行灌注。以每分钟1毫升的酶缓冲液流速，再次夹闭流出管，使酶缓冲液充分包裹心脏。在此过程中，随着酶对心脏的灌注并消化结缔组织，心脏将逐渐变得苍白，结构完整性也会减弱。对于初学者而言，将灌注管路连接至压力计会有所帮助。压力计还可用于确保针头位置位于主动脉瓣上方而非心室内部。低压提示针头处于心室腔内，而高压则提示针头接触到了瓣膜。当心脏组织正在被消化时，随着结缔组织无法维持阻力，压力将迅速下降。为了确定何时从消化后的心脏中切下心室，需将心脏从锥形玻璃管中取出，用镊子轻轻挤压心脏，并收集几滴 PERFU 八液滴入一个小培养皿中进行检查。如果在8到10分钟内观察到有单个细胞滴落，则表明心室压力已下降，此时应可见单个细胞进入Perfu八液。一旦观察到上述任一现象，立即将心室从心脏上切下，放入盛有转移缓冲液A的培养皿中，以进行更均匀的组织制备。剪下并移除右心室，保留左心室用于切碎和研究。若需研究右心室，可在分离后另行切碎。使用显微解剖镊分别切碎每个心室，成功的消化处理在切碎后几乎不残留固体组织块，大部分组织在解离后呈无定形状态。为了进一步解离组织，使用剪去尖端的塑料巴氏 pipette 将其转移。以 45 度角，用夹子将一块方格网固定在小型漏斗上，并将此过滤装置放入一个 15 毫升离心管中。使用经改造的巴氏 pipette 从培养皿中吸取细胞悬液，并将悬液过滤至 15 毫升离心管中。让活细胞沉降至管底，这需要几分钟时间。将体积分装到两个管中可加快沉淀速度。Ali 分装后离心。将四种钙溶液各2.5毫升分别移取到四个独立的15毫升离心管中。使用标准移液器小心地将已沉淀的细胞沉淀物转移至第一种钙溶液中。待细胞沉降至管底后，重复此操作。将已沉淀的细胞依次转移至每种钙溶液中。当细胞转移至第四种钙溶液时，盖紧试管并将其平放。启动MM SIS系统，确保先开启弧光灯。然后用钙缓冲液 B 引导系统。将泵的管路连接到 MM 顺式室的相应入口和出口。在室内固定一片合适尺寸的玻璃盖玻片，通常为 20 乘 25 毫米。将 500 µL 细胞溶液转移至一个小的离心管中。向细胞中加入 0.5 µL 的 PHE 2:00 AM，在暗室中室温避光孵育 5 至 7 分钟。现在小心地开始将钙缓冲液 B 流经小室。一旦开始灌流，立即开始将小室温度升至 37 °C。根据细胞浓度，使用改良的移液器将一到两滴细胞溶液滴加到盖玻片上，并让细胞沉降。腔室中的细胞密度应适中，以便在系统数据采集平台上能够轻松观察到单个不重叠的细胞。确保腔室通过连接线与Myo Pacer相连，然后开始设置实验所需的电压和频率。选择一个以正确频率搏动的细胞，并将其移至成像孔径内。调整相机和成像孔径的尺寸，使整个细胞位于窗口中央，呈水平方向，并清晰显示肌浆网镜面结构。接下来，将方框置于细胞中具有清晰肌节结构的区域，并调节焦距以优化功率谱的峰值。同时调节显微镜的亮度，以优化蓝色平滑窗口和黑色对比度信息。打开光电倍增管并开始记录。在记录了足够的数据后，点击暂停以暂时停止记录。不要点击停止，否则将终止记录，且无法为该细胞记录背景数据。现在，在不改变观察窗口的焦距和尺寸的情况下，移动显微镜载物台至盖玻片上无细胞或细胞成分可见的区域。然后点击“继续”以记录背景值。在完成足够的背景采集后，点击“停止”以结束记录。然后点击文件保存，将该细胞的所有轨迹保存为单个 ZPT 文件。成年心肌细胞的分离可获得呈杆状、有横纹且静息的细胞，这些细胞不会自发搏动，箭头所示为无横纹的圆形死亡细胞。静息细胞可进行培养，并通过腺病毒转染以调控基因表达。培养 24 小时后，活细胞的形态未发生改变。它们仍具有钙耐受性，并且可以通过场刺激进行起搏。获得85%至90%的活细胞是可行的。采用MM SIS系统同时测量来自野生型C57黑六小鼠心肌细胞的收缩力和钙瞬变。通过测量 fura-2 的结合态与游离态的比值来评估收缩力和钙处理能力：00 AM 比值测量在不同实验装置之间可能略有差异，但健康细胞的比值通常在 1.5 至 2.5 之间。为了分析收缩力和钙瞬变曲线的数据，将多条曲线取平均值，为每个细胞生成一条特征性曲线。利用 sys 软件中内置的单相瞬变数据分析算法，从特征性曲线中提取出收缩期和舒张期功能的相关参数。观看本视频后，您应能充分了解如何分离单个成年海洋心肌细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分离，培养和成年小鼠Cardiomyoctyes的功能分析

原代小鼠心肌细胞培养是研究肌原纤维结构与功能的关键工具之一。以下方案描述了从新生小鼠心脏中分离和培养原代心肌细胞的步骤。所获得的心肌细胞培养物可进一步用于多种生物力学、生物化学及细胞生物学检测。...

新生小鼠心肌细胞的分离与培养

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

我们描述了一种分离成年小鼠心肌细胞的可靠方法。该方案可稳定地从多种基因修饰小鼠中培养出具有功能的成年心肌细胞。...

成年小鼠心肌细胞的分离与培养用于细胞信号转导研究 体外 心脏肥大

本方案描述了一种可重复地分离成年小鼠心肌细胞并进行长期培养的逐步操作方法，具有较高的得率、纯度和细胞活性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与转导

本文演示了从小鼠成年个体中分离窦房结心肌细胞（SAMs）的方法，可用于膜片钳电生理学或成像研究。分离的细胞可直接使用，也可在培养中维持，以实现目的蛋白（如基因编码报告蛋白）的表达。...

从小鼠成年心脏窦房结分离、培养及功能表征心肌细胞的方法

本文的总体目标是规范从小鼠成年心脏中分离、鉴定和分化心脏干细胞（CSCs）的实验方案。本文介绍了一种利用密度梯度离心法分离小鼠心脏干细胞的方法，并详细阐述了心脏干细胞的培养、增殖以及向心肌细胞分化的具体方法。...

从小鼠成年心脏中分离、鉴定及分化心脏干细胞

本方案采用组织块消化法从成年小鼠心脏中分离单个心房心肌细胞。该方法可用于分离右心房或左心房心肌细胞，进而用于膜片钳实验中对心房心肌细胞电生理特性的表征研究。...

从成年小鼠中分离心房心肌细胞

本文介绍了一种用于成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养的实验方案。...

成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

在心脏病学领域，细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非兰格多夫技术进行的改进，用于分离小鼠心肌细胞。...

一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

学习使用Langendorff灌流系统分离成年小鼠心肌细胞，并进行培养、转染及钙处理功能分析。该方法适用于心血管生物学研究，可观察细胞收缩与基因表达调控。

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

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