Name: 使用的非肥胖型糖尿病小鼠胃排空的评估 13 C-辛酸呼气试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 了解如何使用¹³C-辛酸呼气试验在小鼠体内无创测量胃排空。该方法适用于神经科学和胃肠病学研究，可重复追踪糖尿病胃轻瘫等疾病的进展。

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本视频出版物的完成得益于美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）为项目资助项目“肠道系统的病理生物学”DK 68055提供的资金支持。Christopher T. Creedon 得到了罗切斯特公立学校导师计划的支持。
我们感谢 Gary Stoltz 先生提供的技术协助，Kristy Zodrow 女士提供的秘书协助，以及来自加利福尼亚州芒廷维尤市 Los Gatos Research 公司的 Douglas Baer 博士。

1. 小鼠的训练与适应
<ol>
 <li>分析前，将所有小鼠放入检测室中，保持持续气流，持续 2-4 小时，以使其适应检测条件。这能显著降低应激水平，避免因应激导致胃排空延迟的异常检测结果。操作方式应与进行胃排空实验时完全相同。准备蛋黄（见下文），不添加辛酸，每只小鼠喂食 0.2 g。</li>
 <li>重复此过程，直至小鼠充分训练（通常 2-3 次）。只要环境条件保持一致，小鼠通常很容易适应。</li>
</ol>
注意：未适应环境的小鼠在转移至实验箱后会持续活动约1小时，并频繁排便和排尿；而经过环境适应的小鼠则会迅速安顿于新环境中，安静休息。
注意： 实验过程中：应监测动物是否出现习惯化丧失的迹象，例如过度排尿、排便、对食用鸡蛋缺乏兴趣等。若出现此类情况，建议在获取胃排空数据前，于空箱中重新进行1至2次习惯化。本实验中保持一致性极为重要。只有每次以完全相同的方式操作，才能获得可靠且可重复的结果。这包括每天在同一时间给予处理（例如胰岛素），除非绝对必要否则不将小鼠与其笼内同伴分离，同时进行禁食并在同一时间开始胃排空检测，以及以相同方式抓取和处理小鼠。
2. 含同位素测试餐的制备
<ol>
 <li>在50 ml离心管中称取5 g蛋黄。每次实验当天均需重复这些步骤，以制备新鲜的测试餐。</li>
 <li>向含有蛋黄的50 ml离心管中加入10 μl浓度为2 μl/g的辛酸，并用刮勺在离心管中剧烈搅拌1分钟。</li>
 <li>然后将蛋黄转移至玻璃烧杯中，用本生灯加热至凝固，使其质地适合制成小球状。此过程通常需要约30秒。</li>
</ol>
注意：每只小鼠所用的蛋黄小球重量应为 0.2 g。这一点对于保持所有小鼠的累积剂量一致非常重要。
3. 开始实验
<ol>
 <li>小鼠经训练并准备进行胃排空实验后，将其置于金属“网底”禁食架上过夜禁食（12小时），以防止食粪行为。确保小鼠可自由饮用饮水。由于本实验使用糖尿病小鼠，禁食时间不应超过16小时。</li>
 <li>首先设置胃排空检测室。使用已清洁并风干的检测室和盖子。连接检测室与分析仪或CO2气源的任何管路均应无水分；水分可能干扰分析仪的信号读数。</li>
 <li>将检测室连接至提供持续气流的进气管，再将检测室的出气管连接至仪器。关闭管路并开启气流。</li>
</ol>
注意：在盖子末端涂抹极少量凡士林，以便盖子易于闭合并严密密封。这种紧密密封对于收集小鼠产生的全部二氧化碳至关重要。
4. 实验步骤
<ol>
 <li>首先对每只小鼠进行称重。体重是衡量其持续健康状况的指标。然后将每只小鼠放入相应的代谢笼中。此时必须确保有气流进入代谢笼。 </li>
 <li>开始测量前，需让小鼠在调整气流水平前先适应代谢笼环境。 </li>
 <li>当小鼠表现平静后（可能需要几分钟），调节每只小鼠代谢笼的气流速率。每只小鼠的气流速率可能不同。通常在实验开始时调节气流，以确保呼出的 CO2 浓度达到所用检测设备可检测的水平，同时保证浓度足够低，以维持健康的空气交换。我们使用的初始 CO2 浓度为每百万1,000至1,500份。 </li>
 <li>若在调节过程中遇到困难，请检查是否存在漏气情况。然后对每个代谢笼重复该过程，并观察下一轮测量结果，以确认气流调节是否已将 CO2 浓度调整至合适水平。在给小鼠喂食前，必须获得稳定的基线读数。我们使用的仪器具备自动校准功能。若仪器不具备此功能，则应手动检查校准状态。 </li>
 <li>达到稳定基线后，向第一只小鼠给予蛋餐，并记录每只小鼠进食的时间。 </li>
 <li>我们持续运行该程序4小时，以获得足够的数据点，用于拟合每只小鼠的13CO2富集曲线。每隔30至60分钟检查一次小鼠状态，确保 CO2 浓度仍处于对小鼠安全的范围。 </li>
 <li>在测试结束前准备好含有食物的新笼盒，以便测试一结束小鼠即可立即进食。 </li>
</ol>

<ol><li>Yeung, C. K., McCurrie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+investigate+the+inhibitory+effects+of+drugs+on+gastric+emptying+in+the+mouse+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method to investigate the inhibitory effects of drugs on gastric emptying in the mouse in vivo.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 45, 235-240 (2001).</li>
<li>Osinski, M. A., Seifert, T. R., Cox, B. F., Gintant, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+evaluation+of+drug-evoked+changes+in+gastric+emptying+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method of evaluation of drug-evoked changes in gastric emptying in mice.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 47, 115-120 (2002).</li>
<li>Ghoos, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gastric+emptying+rate+of+solids+by+means+of+a+carbon-labeled+octanoic+acid+breath+test%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Measurement of gastric emptying rate of solids by means of a carbon-labeled octanoic acid breath test.</a> Gastroenterology. 104, 1640-1647 (1993).</li>
<li>Symonds, E., Butler, R., Omari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+breath+tests+can+detect+alterations+in+gastric+emptying+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Noninvasive breath tests can detect alterations in gastric emptying in the mouse.</a> Eur. J. Clin. Invest. 32, 341-344 (2002).</li>
<li>Symonds, E. L., Butler, R. N., Omari, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+gastric+emptying+in+the+mouse+using+the+%5B13C%5D-octanoic+acid+breath+test%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of gastric emptying in the mouse using the [13C]-octanoic acid breath test.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27, 671-675 (2000).</li>
<li>Verhulst, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ghrelin+in+the+relationship+between+hyperphagia+and+accelerated+gastric+emptying+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of ghrelin in the relationship between hyperphagia and accelerated gastric emptying in diabetic mice.</a> Gastroenterology. 135, 1267-1276 (2008).</li>
<li>Schoonjans, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+13C-octanoic+acid+breath+test%3A+validation+of+a+new+noninvasive+method+of+measuring+gastric+emptying+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">The 13C-octanoic acid breath test: validation of a new noninvasive method of measuring gastric emptying in rats.</a> Neurogastroenterol. Motil. 14, 287-293 (2002).</li>
<li>Choi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+gastric+emptying+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Determination of gastric emptying in nonobese diabetic mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 1039-1045 (2007).</li>
<li>Atkinson, M. A., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes%3A+as+good+as+it+gets%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The NOD mouse model of type 1 diabetes: as good as it gets?</a> Nat. Med. 5, 601-604 (1999).</li>
<li>Camilleri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+practice.+Diabetic+gastroparesis%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical practice. Diabetic gastroparesis.</a> N. Engl. J. Med. 356, 820-829 (2007).</li>
<li>Choi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+oxygenase-1+protects+interstitial+cells+of+Cajal+from+oxidative+stress+and+reverses+diabetic+gastroparesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Heme oxygenase-1 protects interstitial cells of Cajal from oxidative stress and reverses diabetic gastroparesis.</a> Gastroenterology. 135, 2055-2064 (2008).</li>
<li>Kashyap, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+reverses+diabetic+gastroparesis+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+GI%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide reverses diabetic gastroparesis in NOD mice.</a> Am. J. Physiol. GI. G298, G1013-G1019 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

本文所述技术可对小鼠的固体胃排空进行重复且无创的体内测量。该系统的优点在于，动物在测量过程中无需被固定，可在测量腔内自由移动和转身。由于该环境对小鼠而言较为陌生，仍需对其进行训练并使其适应测试腔，以避免应激反应对胃排空的影响。通常情况下，若同一只小鼠在连续胃排空测试中的个体内变异小于10%，则认为胃排空数据可靠。
本报告是对我们先前关于小鼠胃排空测量研究的进一步详细阐述8,11,12 ，并新增了有关系统故障排查的补充信息。主要改进之处在于采用LGR同位素分析仪来测定气体水平。本研究所使用的分析仪可每秒连续测定12CO2、13CO2和H2O的浓度。多通道进样单元中的计算机控制阀门可自动在25秒间隔内轮流将各小鼠代谢舱的气流切换至检测器。因此，可同时对12只小鼠进行分析，每次读数间隔为5分钟。需要注意的是，数据也可通过手动采集呼出气体样本并进行后续分析获得。若采用手动采样或使用其他设备，应确保读数间隔约为10分钟。本系统的高灵敏度以及高频...

本文阐述了在小鼠中进行胃排空无创测量所涉及的技术与方法学考量。通过遵循此处描述的实验方案，研究人员能够可靠且可重复地监测疾病发展所致的胃排空变化，研究药物对胃排空的影响，并评估基础疾病或缺陷治疗后胃排空的反应6,8,11,12。在以往的研究中，13C辛酸呼气试验已被证明是测量人类和动物胃排空的有效方法3,8。本文详细描述了在糖尿病小鼠胃排空纵向研究中，为获得可靠数据所需在6至8个月内执行的各项操作步骤。与先前发表的方法相比，遵循本方案的优势在于研究人员可确保所获得的数据具有可靠性和可重复性。此外，本文所述用于采集和分析气体样本的自动化系统，可提高在一项研究中同时监测的动物数量。总体而言，本文旨在确定维持小鼠对检测适应性的关键因素，并减少实验结果的变异性。
为了进行胃排空的体内测量，小鼠需禁食过夜，然后放入具有恒定气流的透明塑料测试舱中。待小鼠适应测试管后，测定其呼出气体中13CO2的基础水平，并相应调整气流。随后，给予小鼠一种由蛋黄与13C标记的辛酸混合组成的测试餐。由于小鼠处于禁食状态且经过训练，通常会在2分钟内吃完测试餐。所给予的辛酸在胃中不被吸收，而是在十二指肠被吸收，并在肝脏中代谢为13CO2，随后释放并经呼气排出，导致周围空气中的13CO2富集。在预定的时间间隔采集空气样本，并通过碳同位素分析仪进行分析。该过程的限速步骤是胃排空，而13CO2的肺排泄直接反映标记餐的胃排空情况。
<img src="/files/ftp_upload/50301/50301fig1.jpg" alt="同位素分析示意图，小鼠实验装置，测量[13C]/[12C]比值，呼气试验实验。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50301/50301fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 胃排空实验装置示意图。 经过一夜禁食后，将小鼠置于透明的实验舱内，使其可自由活动和转身。进气管持续通入新鲜空气，出气管连接至同位素分析仪，用于检测呼出气体中13C与12C的比值。实验舱中央设有给食口，用于提供含有[13C]-辛酸的食物。

<table><tbody><tr><td>恒定的空气供应源，包括流速和气体成分</td><td>研究设施中的中央空气供应系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>130 ml采样室，带有空气入口、空气出口和食物给入孔&lt;br/&gt; 用于供气的塑料管</td><td>自行研制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>辛酸</td><td>Cambridge Isotope Laboratories（安多弗，马萨诸塞州）</td><td>CLM-293-1</td><td></td></tr><tr><td>制备蛋餐所需材料：&lt;br/&gt; &lt;ul&gt; &lt;li&gt;小烧杯&lt;/li&gt; &lt;li&gt;50 ml塑料离心管&lt;/li&gt; &lt;li&gt;本生灯&lt;/li&gt; &lt;li&gt;鸡蛋&lt;/li&gt; &lt;li&gt;刮勺&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td><td>任意供应商</td><td></td><td>尽量保持鸡蛋供应商的一致性，因为鸡蛋的营养成分和适口性可能影响摄食量和胃排空速度</td></tr><tr><td>二氧化碳同位素分析仪</td><td>Los Gatos Research Inc.（芒廷维尤，加利福尼亚州）</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用[13c]-辛酸呼气试验评估非肥胖型糖尿病小鼠的胃排空

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

由于缺乏能够在同一只动物体内连续监测胃排空变化的技术，小鼠胃排空研究一直受到限制，因为最常用的方法需要处死动物并通过死后取餐法来检测食物残留量1,2。这种方法无法开展纵向研究，因而难以评估胃排空随年龄增长或疾病进展发生的变化。常用于人类的[13C]-辛酸呼气试验3 已被改良并应用于小鼠4-6 和大鼠7，我们先前的研究表明，该改良方法在检测药物干预及糖尿病进展过程中胃排空变化方面具有良好的可靠性和敏感性8。本视频演示将详细讲解该改良呼气试验的原理及实际操作流程。与之前的研究一致，本实验采用NOD LtJ小鼠，这是一种1型糖尿病模型9。其中部分小鼠会发展出胃轻瘫症状，这是糖尿病的一种并发症，表现为在无胃机械性梗阻的情况下出现胃排空延迟10。
本文演示了如何训练小鼠进行检测，如何制备测试餐并获取4小时胃排空数据，以及如何分析所获得的数据。本研究所使用的碳同位素分析仪适用于同时自动采集最多12只小鼠的空气样本。该技术可实现对患有糖尿病或其他慢性疾病的小鼠群体进行胃排空的纵向随访观察。

来自三只不同小鼠的代表性数据集如图2所示。黑色曲线代表胃排空正常小鼠的数据点，显示的是呼出气体中回收的13C占给药剂量的百分比随时间（每小时）的变化情况。蓝色曲线来自胃排空加速的小鼠，其半排空时间（T half）为40分钟；红色曲线来自胃排空延迟的小鼠，其半排空时间为168分钟。根据本实验室先前的一项研究7，非糖尿病NOD小鼠（9–15周龄）的正常胃半排空时间范围为62至131分钟，如图中灰色区域所示。随后，数据点通过以下方程进行非线性回归曲线拟合8：
y = atbe-ct
其中 y 表示每小时呼出气体中13C 的回收百分比（t），a、b 和 c 为针对每条呼气与时间曲线估算的回归常数。半排空时间（T1/2）
通过使用逆伽马函数的数值积分过程进行计算。我们已从数千项研究中获得结果，其小...

采用无创的[13C]-辛酸呼气试验测定雌性NOD LtJ小鼠胃排空，用于追踪胃轻瘫。

使用[13C]-辛酸呼气试验评估非肥胖型糖尿病小鼠的胃排空

小鼠胃排空研究受限于无法在同一只动物体内连续监测胃排空的变化，因为最常用的方法……

本实验的总体目标是建立一种利用¹³碳辛酸呼吸试验在活体小鼠中测定胃排空的方法。小鼠及其他小型动物当然对帮助我们理解疾病的病理生理机制非常有用，我们的实验室研究胃轻瘫，而研究胃轻瘫的一个问题是，为了研究疾病进展，我们需要随时间推移监测胃排空情况。现有的技术存在这一难题，因为当前的技术要求将某种物质以液体或固体形式注入小鼠胃内，随后在某一时间点处死小鼠，再估算胃内容物的排出量。我们的目标是建立一种无创的胃排空测量技术，为此我们将已知的碳13氨基酸呼气试验进行改良，使其能够应用于小鼠。该方法使我们能够在不同时间点进行重复测量，并将观察结果与组织学和生理学数据进行关联分析。我们所使用的设备可实现操作流程的自动化，当然，该过程也可以手动完成。自动化的优点不仅在于我们可以在更长时间内完成更多的胃排空实验，还在于我们能够同时对多只小鼠进行操作。接下来我们将展示一种可同时对多达12只小鼠进行实验的方法。以下动画展示了用于活体测量胃排空的胃排空实验的设置过程。将小鼠放入具有恒定气流的透明塑料管中。待小鼠适应塑料管环境并调节气流稳定后，给予测试餐，其中包含与¹³C标记的辛酸混合的蛋黄。由于小鼠已被固定并经过训练，通常会摄取测试餐。两分钟内，给予的小鼠辛酸钠（OCT NOIC acid）将被十二指肠吸收，并在肝脏中代谢后释放并经呼吸排出，导致周围空气中¹³CO₂富集，该信号由我们的同位素分析仪测定。让我们更详细地了解小鼠体内的过程。在摄入含有¹³C标记的辛酸钠（OCT NOIC acid）的测试餐后，食物进入胃部。OCT NOIC 酸在胃中保持完整。经过幽门后，该物质在十二指肠中被迅速吸收。标记化合物经门静脉到达肝脏，并代谢为¹³C标记的二氧化碳。标记的二氧化碳在静脉血中释放，并通过呼气排出。整个过程的限速步骤是胃排空。这意味着肺部排出的¹³碳二氧化碳与标记餐的胃排空直接对应。在特定时间间隔采集空气样品，并使用碳同位素分析仪进行分析。可采用多种同位素分析仪。在本研究中，我们选择使用低功耗GATOS研究型LGR 13碳同位素分析仪。采集四小时的样本可获得可重复的13二氧化碳动力学数据，这些数据反映了胃排空速率。曲线拟合。采用非线性回归可计算半排空时间。该方法适用于慢性疾病小鼠的后续观察。在本项研究中，我们使用雌性非肥胖型糖尿病小鼠（N-O-D-L-T-J），该品系是人类1型糖尿病的动物模型。在分析前，所有小鼠均允许在检测舱内适应环境，以尽量减少应激水平。由于胃排空延迟是应激状态的一个特征性指标，未适应的小鼠在转入实验箱后会持续活动约一小时，并伴有排便和排尿现象。通常认为，小鼠能够迅速安顿于新环境中即为成功适应。转入实验箱后，经过短暂的探索，已适应的小鼠会在箱内安静休息。在已适应的小鼠中，胃排空试验结果应显示个体内变异小于10%。小鼠经训练并准备进行胃排空实验后，必须在实验前一天开始

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使用的非肥胖型糖尿病小鼠胃排空的评估[<sup&gt; 13</sup&gt; C-辛酸呼气试验

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本文描述了一种用于深入评估听觉和认知能力（这些能力与听力技能相关）的测试组合（IMAP）。该测试组合易于实施、适合儿童，且不受语言混杂因素的影响。刺激材料的生成和测试流程的管理均由一个软件平台（IHR-STAR）控制，以确保实验程序的可重复性。...

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