直接成像诱导ER钙有针对性的酯酶染料装载（TED）
May 7th, 2013
有针对性的酯酶诱导染料吸附量（TED）支持通过荧光成像分析细胞内钙库动态。该方法的基础上针对重组羧酸酯酶的内质网（ER），在那里它提高了合成的低亲和性钙本地揭露 +指示剂染料在ER腔。
以下实验的总体目标是直接在活细胞内质网腔中可视化钙动力学。这是通过使用靶向酯酶诱导的染料或 TED 载体构建体转导细胞，以在内质网中过表达 carbox 酯酶 CS 2 来实现的。接下来，将细胞与乙基甲酯钙指示剂 flu oh five NA 一起孵育，后者通过血浆和 ER 膜扩散。
然后羧基酯酶裂解。酯基在 ER 中释放钙敏感指示剂。形成管腔和荧光钙复合物。
根据活细胞成像获得的结果显示 ER 中游离钙浓度的变化。这种方法可以帮助回答有关细胞钙稳态调节的关键问题。钙信号在胞质溶胶中最频繁地被监测，因此不容易区分钙从细胞外间隙或细胞内 ER 钙储存流入胞质溶胶的位置。
为了克服这一限制，我们开发了靶向酯酶诱导的下载。使用这种方法，可以直接监测 ER 释放的钙。该方法具有非破坏性。
质膜保持完整，细胞内信号级联反应得以保留。一般来说，个人 n tous 方法会很挣扎，因为他们需要经验。在 TED 载体表达中，我们开发了表达与羧化酶 CES 二融合的 cent 蛋白的载体构建体。
这使我们能够在实验过程中轻松识别适合 AR 钙成像的细胞，这些细胞将以强红色荧光和仅中度至强钙指示剂荧光为特征的细胞。这种荧光标记应均匀分布在整个内质网中，并且在核区域中不存在。开始之前。
根据文本协议准备人工脑脊髓液或 A CSF 和流感 oh five NAM。将 A CSF 预热至室温，并加入深葡萄糖，用碳水化合物对 A CSF 充气 5 分钟。然后加入 1 摩尔的氯化钙和氯化镁储备溶液，使最终浓度各为 2 毫摩尔。
启动实时成像显微镜和计算机程序后，在虚拟成像室上开始大量加热，并平衡管系统，预热在线溶液加热器和显微镜载物台上的成像室，并将系统平衡至 32 至 37 摄氏度。在开始下载程序以将染料加载到细胞中之前，将 100 微升预热的 A CSF 加入到一份 0.5 微升 5 毫摩尔流感 oh 5 NAM 等分试样中，并将溶液溶解在水浴超声处理液中 90 秒，将 400 微升预热成像溶液转移到 4 或 24 孔板的一个孔中。将 D 溶液添加到同一孔中，以产生 500 微升的 5 微摩尔溶液。
接下来，小心地将带有细胞的盖玻片放入孔中，孵育适当的时间 在 37 摄氏度的细胞培养箱中，DI 加载时间和 D 浓度取决于细胞类型、细胞密度和实验的具体需要。较长的孵育时间可能会损害细胞，尤其是原代细微差别和神经胶质细胞，这对于对生理刺激的反应至关重要。孵育超过 30 分钟仅适用于 ER 钙定位实验，以研究 ER 钙在小微结构域中的分布，例如，脊柱的 MUE孵育后立即将盖玻片转移到另一个含有成像溶液的细胞培养孔中。
要准备将细胞安装在成像室中，请使用油漆刷将高真空润滑脂涂抹在成像室中。我们使用自制的成像室进行 10 至 12 毫米的小体积盖玻片，从而允许每分钟高达 15 倍缓冲液更换的高灌注速度。拿起装有流感 oh five 和加载细胞的盖玻片，加入一小滴成像溶液以保持湿润。
然后将盖玻片倒置并将细胞安装到成像室中。使用棉签将盖玻片压入硅胶中，并擦去玻璃盖玻片底部的残留缓冲液。接下来，将虚拟成像室更换为实验成像室。
通过连续灌注洗涤细胞 5 至 10 分钟以进行细胞筛选。使用最少量的激光照明以防止流感 oh five 和钙 2 在 ER 中的快速光漂白，2 到 4 赫兹的高扫描速率，小图像尺寸和在显微镜上设置的高增益。根据植物实验。
在实验开始时，记录 flu oh five 和钙标记的细胞分布以及红色 carbox cel 酯酶构建体的红色荧光标记。在您感兴趣的细胞中，高分辨率 X、YZ 图像堆栈的代表性神经元执行 XYT 成像，以监测特定实验条件下的 ER 钙动力学。我们系统的典型设置列在文本协议的表 2 中，在连续灌注下监测 ER 钙的变化，成像溶液缓冲液交换速率为每分钟 1.5 毫升，用于细胞洗涤和储存耗竭，通过阻断肌内质网钙，两个 a TPA 和每分钟 3 毫升用于刺激 TP 和 DHPG 以及代谢型谷氨酸受体的激动剂。
在这里，神经胶质细胞用 200 微摩尔 A TP 刺激 10 秒。要处理图像，请在 Image J 程序中打开图像堆栈以进行多色成像。当软件询问时拆分 RBG 通道。
确定感兴趣的区域。根据目的，在整个 ER 或 ER 的小区域周围绘制感兴趣的区域。使用 Time Series analyzer 插件读出感兴趣区域中的平均像素强度。
使用此公式通过 F 零上的 delta F 计算背景校正的荧光相对变化。将荧光的相对变化表示为一条迹线，其中 Y 轴的 delta F 超过 F 零，x 轴的 delta F 超过 F，x 轴的时间。在该图中，he A 细胞、皮质星形胶质细胞和海马神经元表达红色荧光 TED 载体，并用低亲和力钙指示剂标记。
Flu oh five N.荧光钙指示剂复合物定位于所有细胞类型的内质网。该图显示了 flu oh 5 个 N 标记的神经胶质细胞。在 CIN 处理期间，如果细胞的质膜在 CIN 处理前后都受损，则会看到明亮的胞质标记。
这表明 flu oh five N 也由内源性酯酶在胞质溶胶中释放。在这个实验中，用 flu oh five N er 标记 TED 后，培养的海马神经元的钙耗竭是由 circa 阻断剂环流酸引起的。请注意，此处观察到的每个感兴趣区域的平均荧光密度的巨大变化是用 TP 刺激的小鼠皮质 GL 细胞的延时序列。荧光突然下降并恢复，代表 ER 钙释放和再填充同时，由于石板漂白图显示在某些（但不是所有）实验中荧光强度随时间的变化，红色荧光蛋白的荧光略有降低。
荧光值不会恢复到初始荧光强度水平，因为一些 flu oh five N 复合物在刺激过程中丢失。这部电影以高分辨率展示了一个羧化酶 2 感染的 BHK 21 细胞，由流感 oh 5 N 钙复合物标记并用 TP 刺激。请注意，TP 诱导的钙释放和 ER 钙储存再填充在 ER 小管的精细结构中可见。在参加此程序时，重要的是要记住，只有完全健康的细胞才会表现出生理钙反应。
因此，我们建议在一天内用相同的细胞批次进行一系列相互关联的钙稳态实验。根据我们的经验，5 N 的染料流感效果最好，但这种钙指示剂不是很抗裂。因此，该方法将受益于开发更耐漂白的低亲和力钙指示剂。
看完这个视频后，您应该对如何使用合成的低亲和力钙指示剂对 E 钙瞬变进行成像有了很好的了解。这些指标使您能够以高时间分辨率监测 e 钙动力学。出于这个原因，我们的方法可能有利于研究涉及突触可塑性的钙信号级联反应，并监测神经退行性疾病细胞模型中钙稳态的变化。
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概述
本研究介绍了一种通过荧光成像分析细胞内钙动力学的靶向酯酶诱导染料负载（TED）方法。通过将重组羧酸酯酶靶向内质网（ER），该技术增强了ER腔内合成的低亲和力Ca2+指示剂染料的显现。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 荧光成像
背景
- 了解钙动力学对细胞信号传导至关重要。
- 内质网在钙储存和释放中起关键作用。
- 传统方法可能无法有效可视化ER中的钙变化。
- TED提供了一种增强成像分辨率的新方法。
研究目的
- 可视化活细胞ER中的钙动力学。
- 使用靶向酯酶改进钙指示剂的检测。
- 促进对细胞内钙信号传导的更好理解。
使用的方法
- 用TED载体构建物转导细胞。
- 在ER中过表达羧基酯酶。
- 与乙酰甲酯钙指示剂孵育。
- 荧光成像以可视化ER腔内的钙复合物。
主要结果
- 成功可视化ER中的钙动力学。
- 增强了钙敏感指示剂的荧光信号。
- 证明了TED方法在细胞内研究中的有效性。
- 提供了对活细胞钙信号传导机制的洞察。
结论
- TED是研究ER中钙动力学的有力工具。
- 该方法可以推动对细胞信号传导的理解。
- 未来的应用可能包括各种细胞类型和条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct imaging of ER calcium using TED enables precise quantification of intracellular calcium dynamics, a critical parameter in early drug discovery and mechanistic de-risking. This method addresses the challenge of distinguishing ER-derived calcium flux from cytosolic or extracellular sources, supporting predictive confidence in target validation and pathway interrogation. Its application in live cell models enhances translational continuity for neurodegenerative and signaling-focused portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of ER calcium handling, clarifying mechanistic hypotheses in cellular signaling.
- Supports functional target validation by isolating ER-specific calcium release and refilling events.
- Improves predictive confidence for pathway modulation and target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated live-cell systems for quantitative calcium imaging assays.
- Enables reproducible, high-resolution measurement of ER calcium dynamics for compound screening.
- Supports assay standardization by providing robust, compartment-specific readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neurodegeneration and synaptic plasticity research.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal calcium homeostasis studies.
- De-risks translational advancement by offering direct, quantitative ER calcium measurements in physiologically relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The TED method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a bridge to preclinical model validation for calcium signaling targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct ER calcium flux measurement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts suitable for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Provides time-resolved fluorescence intensity data (ΔF/F₀) for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant cellular models for neurodegenerative research.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform adaptable across cell types and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in calcium signaling studies.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct, quantitative ER calcium data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways in neurobiology and cell signaling portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and vector-based protein expression.
- Demands access to confocal microscopy and quantitative image analysis tools.
- Necessitates cross-team standardization of dye loading and imaging protocols.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for primary or sensitive cells.
- Photo-bleaching and dye retention limitations should be considered for longitudinal studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:07
Preparation of Live Cell Imaging
4:06
ER-calcium Live Cell Imaging with an Inverted Laser Scanning Confocal Microscope
5:57
Image Processing and Data Analysis
6:38
Representative Endoplasmic Reticulum Calcium Imaging Results
8:18
Conclusion
2:50
Dye Loading of Cells
