靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术对内质网钙的直接成像

以下实验的总体目标是直接在活细胞内质网腔内可视化钙动态变化。为此，首先通过转导靶向酯酶诱导型染料（TED）载体构建体，使细胞在内质网中过表达羧酸酯酶 CS2。随后，将细胞与乙酰甲酯类钙离子荧光探针 Fluo-5N AM 共同孵育，该探针可穿过质膜和内质网膜扩散进入细胞内。

然后羧酸酯酶将酯基切除，释放内质网腔内的钙离子敏感指示剂，并形成荧光钙复合物。

通过活细胞成像获得的结果显示了内质网中游离钙浓度的变化。该方法有助于解答有关细胞钙稳态调控的关键问题。钙信号最常在细胞质中进行监测，因此难以明确区分进入细胞质的钙是来自细胞外空间还是来自细胞内内质网的钙库。

为了克服这一局限性，我们开发了靶向酯酶诱导的下载技术。通过该方法，可直接监测内质网释放的钙离子。该方法具有非侵入性。

细胞质膜保持完整，细胞内信号转导级联得以保留。通常，使用此方法的个体将面临困难，因为他们需要相关经验。在TED载体表达中，我们已开发出载体构建体，表达一种中心蛋白与羧化酶CES2的融合蛋白。

这使我们能够在实验过程中轻松识别适合进行AR钙成像的细胞，这些细胞具有强烈的红色荧光，且钙指示剂荧光强度为中等到强。这种荧光标记应均匀分布于内质网中，并在细胞核区域无分布。在开始之前。

根据文本方案配制人工脑脊液（A CSF）和氟代五氮杂环（flu oh five NAM）。将A CSF预热至室温，并加入足量葡萄糖，用碳氧混合气（carbogen）对A CSF鼓泡充气5分钟。随后加入氯化钙和氯化镁的1摩尔储备液，使其终浓度均为2毫摩尔。

启动活细胞成像显微镜和计算机程序后，先在模拟成像腔室中开始灌注，平衡管路系统，预热管路中的溶液加热器以及显微镜载物台上的成像腔室，并将系统平衡至32至37摄氏度。在开始下载程序以将染料加载到细胞之前，向一份0.5微升的5毫摩尔Fluo-5N AM中加入100微升预热的aCSF，在水浴中超声溶解90秒，然后将400微升预热的成像溶液转移至4孔或24孔板中的一个孔内。再将上述D溶液加入同一孔中，配制成终体积为500微升、浓度为5微摩尔的溶液。

接下来，小心地将带有细胞的盖玻片放入培养孔中，在37摄氏度的细胞培养箱中孵育适当的时间。DI染料的加载时间及D浓度取决于细胞类型、细胞密度以及实验的具体需求。长时间孵育可能对细胞造成损伤，特别是对原代神经元和胶质细胞，这会影响细胞对生理刺激的反应性。超过30分钟的孵育仅适用于内质网钙定位实验，以研究内质网钙在微小区域（例如树突棘的MUEs）中的分布情况。孵育结束后，立即将盖玻片转移至另一个含有成像溶液的细胞培养孔中。

为将细胞装入成像室做准备，使用画笔将高真空润滑脂涂抹到成像室上。我们使用自制的成像室，适用于10至12毫米的盖玻片，且体积较小，因此可实现高达每分钟15倍缓冲液交换的高灌注速度。用镊子夹取带有荧光标记且已加载细胞的盖玻片，并滴加少量成像溶液以保持其湿润。

然后将盖玻片翻转，使细胞朝下装入成像室。用棉签将盖玻片压入硅胶中，并擦去玻璃盖玻片底部残留的缓冲液。接着，将假的成像室更换为实验用的成像室。

通过持续灌流 5 到 10 分钟以进行细胞筛选。使用最低限度的激光照明，以防止荧光染料 fluo-4 和钙离子探针在内质网中快速光漂白；根据植物实验要求，显微镜设置应采用每秒 2 至 4 赫兹的高扫描速率、较小的图像尺寸以及高增益模式。

实验开始时，记录细胞内Fluo-5N和钙标记物以及红色羧基荧光素酯构建体的红色荧光标记的分布情况。针对您感兴趣的细胞（此处为典型神经元），通过高分辨率的X、YZ图像堆栈进行XYT成像，以在特定实验条件下监测内质网钙动态变化。本系统典型设置详见文本方案中的表2。在持续灌注成像溶液的条件下监测内质网钙的变化，细胞清洗和通过阻断肌浆/内质网钙2A型ATP酶（SERCA）实现钙库耗竭时的缓冲液交换速率为每分钟1.5毫升，而使用ATP和DHPG（代谢型谷氨酸受体激动剂）进行刺激时的流速为每分钟3毫升。

此处用 200 微摩尔的 ATP 刺激胶质细胞 10 秒。为处理图像，在 Image J 多色成像程序中打开图像堆栈。当软件提示时，分离 RGB 通道。

确定感兴趣区域。根据实验目的，在整个内质网或内质网的小区域周围绘制感兴趣区域。使用时间序列分析插件读取感兴趣区域内像素的平均强度。

使用此公式通过 ΔF/F₀ 计算经背景校正的荧光相对变化。将荧光的相对变化以轨迹形式呈现，其中 Y 轴为 ΔF/F₀，X 轴为时间。在该图中，A 细胞的皮层星形胶质细胞和海马神经元表达红色荧光 TED 载体，并用低亲和力钙指示剂标记。

Fluo-5N。这种荧光钙离子探针复合物定位于所有细胞类型的内质网。该图显示了被Fluo-5N标记的神经胶质细胞。在CIN处理过程中，如果细胞的质膜在CIN处理前后均受到损伤，则可见明亮的细胞质标记。

这表明，荧光染料Fluo-5N也会被内源性酯酶释放到细胞质中。本实验中，在用Fluo-5N对细胞进行TED标记后，通过环状酸（cyclonic acid）这一钙阻滞剂诱导培养的海马神经元发生胞内钙耗竭。需要注意的是，此处展示的感兴趣区域平均荧光密度的巨大变化，是一组经ATP刺激的小鼠皮质胶质细胞的时间推移序列。荧光信号急剧下降后又恢复，代表内质网中钙离子的释放与再充盈。同时，作为漂白效应的后果，红色荧光蛋白的荧光信号仅出现轻微下降。部分但并非所有实验中均观察到如图所示的荧光强度随时间变化的曲线图。

荧光值无法恢复到初始荧光强度水平，因为在刺激过程中部分Fluo-5N复合物丢失。本视频展示了一个经Fluo-5N钙复合物标记并用ATP刺激的高分辨率羧化酶2感染的BHK-21细胞。请注意，ATP诱导的钙释放以及内质网钙库的再填充可在内质网小管的精细结构中被观察到。在进行该操作时，必须牢记只有完全健康的细胞才会表现出正常的生理钙反应。

因此，我们建议在同一天内使用同一批细胞进行一系列相互关联的钙稳态实验。根据我们的经验，使用五个 N 的染料荧光效果最佳，但这种钙离子指示剂的抗漂白能力较弱。因此，开发出抗漂白性更强的低亲和力钙离子指示剂将有助于改进本方法。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用合成的低亲和力钙离子指示剂对细胞外钙瞬变进行成像。这些指示剂可使您以高时间分辨率监测细胞外钙离子动态变化。因此，我们的方法可能有助于研究突触可塑性相关的钙信号级联反应，并可用于监测神经退行性疾病细胞模型中钙稳态的变化。