Name: 评估神经退行性表型果蝇爬坡试验和全脑多巴胺能神经元免疫组化染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 了解利用果蝇攀爬试验和酪氨酸羟化酶免疫染色评估多巴胺能神经元神经退行性变的方法。该技术可量化神经元数量变化，为研究帕金森病等神经退行性疾病的机制和治疗策略提供重要模型。

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我们感谢Leo Pallanck提供的果蝇品系，Christine Sommers提供的技术协助，以及Gerasimos P. Sykiotis富有启发性的讨论。本研究由NIH培训基金T32CA009363资助，项目负责人：M.C.B。

1. 惊吓诱导的负向趋地性实验
<ol>
 <li>选择所需基因型的果蝇，按性别分离，随机分为每组20-30只的群体，每2-3天更换至新的培养管中；每组果蝇均进行测试（即 年龄匹配的队列（每个基因型一个队列），每周至少一次。</li>
 <li>负向重力趋性测试前30分钟，用CO₂麻醉果蝇2 并将它们放入预先标记的透明塑料管中，该塑料管由两个空的食物瓶制成（参见 材料表）在其开口处用透明胶带连接（腔室尺寸：19 cm × 2.85 cm）。在我们的实验中，通常每管使用25只果蝇。 
 注意。 麻醉恢复时间可能从几分钟到几小时不等（例如 过夜（O/N）孵育时间应根据所测试的具体基因型进行优化。</li>
 <li>在一张吸水纸上标记不同高度（从1到20 cm），并将该纸用胶带固定在垂直于实验台的垂直表面上。</li>
 <li>将试管置于纸张前方：所有试管应排列整齐，并尽可能靠近纸张，以便准确测量高度。</li>
 <li>将数码相机（参见 “特殊设备”表格) 在支架上，距离纸张20-30厘米处，置于试管前方例如 选择“movie”选项并开始录制；此时还应启动计时器，以记录连续试验之间的时间间隔。</li>
 <li>轻轻敲击试管数秒，使果蝇聚集到试管底部（例如 10 秒）。此步骤应始终保持一致（即 整个实验过程中保持相同的持续时间、相同的强度和相同的操作者。</li>
 <li>用数码相机记录果蝇的运动，持续10秒。</li>
 <li>以1分钟间隔重复步骤1.5至1.7，共十四次。</li>
 <li>分析数据：
 <ol type="a">
 <li>通过目视检查录制的视频，在10秒后统计位于2 cm标记线以上的果蝇数量。 
 注意： 在我们的实验条件下，果蝇的负向趋地性行为在惊吓后并未持续超过前10秒。即 果蝇在受到惊吓后10秒开始向各个方向移动）。对照组果蝇爬行的最短距离为即 表达 THGal4 驱动子的 1 周龄果蝇，参见图注 图1在此时间窗口内，果蝇的爬行距离为 2 cm。因此，我们以 2 cm 标记作为参考，用于分析不同年龄和基因型果蝇在行为启动后 10 秒内的爬行活动。这些参数可能需要根据所测试果蝇的行为差异（例如由于不同的遗传背景或实验室条件所致）进行调整。需要注意的是，在我们的实验条件下，所有被测试的基因型果蝇的表现均差于或等同于对照基因型果蝇。</li>
 <li>取十五次试验结果的平均值。</li>
 <li>将平均值表示为试管中果蝇总数的百分比（= 爬行活动百分比）；重复次数（N）由重复实验的次数决定 独立队列 对每种基因型进行检测</li>
 <li>评估不同基因型随时间变化的统计学显著性。这可以通过 Student's t 检验实现。 t 使用商业软件（如 GraphPad（GraphPad Software, Inc.，La Jolla, CA, USA））进行双基因型比较时采用 t 检验，或多组比较时采用双向方差分析（two-way ANOVA）并随后进行 Bonferroni 事后检验。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
注意
我们所有实验均在每天的同一时间、室温下以及相同的光照条件下进行。建议将果蝇置于12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，以控制昼夜节律对果蝇运动行为的影响。
2. 全脑组织切片的酪氨酸羟化酶免疫荧光检测
溶液与缓冲液
固定液：磷酸盐缓冲液（PBS）中含4%多聚甲醛（PFA）
洗涤缓冲液：含0.1% Triton X-100的PBS
封闭缓冲液：0.1 M Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl，0.1% Triton X-100 和 0.5% BSA
封片剂：Mowiol-Dabco（参见 Harlow E, Lane D 所著《抗体——实验室手册》，冷泉港实验室出版社，美国纽约冷泉港，10:418 (1988) 中描述的方案）
实验步骤
<ol>
 <li>将果蝇放入盛有70%乙醇的解剖皿中约1分钟，以去除表皮蜡质。</li>
 <li>将果蝇转移至另一盛有冰冻PBS的解剖皿中。</li>
 <li>解剖脑组织：
 <ol type="a">
 <li>将果蝇腹面朝上放置（可选：去除翅膀和足）。</li>
 <li>将头部从身体上拉开：用一组镊子夹住身体，另一组镊子夹住眼下方的表皮，以防止损伤脑组织。</li>
 <li>去除喙部。</li>
 <li>用镊子夹住喙部移除后留下的裂口两侧的头壳，向相反方向拉扯，直至脑组织从头壳中完全取出。</li>
 <li>彻底清除脑组织周围的表皮。</li>
 <li>去除所有含空气的气管组织；这可防止脑组织在后续孵育步骤中漂浮。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>剪去P-200移液器吸头尖端几毫米，并用0.1% Triton X-100/PBS溶液平衡吸头。</li>
 <li>使用准备好的P-200移液器吸头，将脑组织转移至装有0.5 mL 4%多聚甲醛/PBS的0.5 mL离心管中，置于冰上直至解剖完成。</li>
 <li>在室温下固定脑组织20分钟：将离心管置于支架上，并将支架放在摇床上进行轻柔旋转。</li>
 <li>使用P-1000微量移液器去除固定液，加入0.5 mL 0.1% Triton X-100/PBS，轻轻颠倒混匀，孵育1分钟；重复此洗涤步骤一次。</li>
 <li>去除第二次洗涤的缓冲液，加入0.5 mL 0.1% Triton X-100/PBS，在室温下孵育20分钟；重复此步骤两次。</li>
 <li>去除洗涤缓冲液，将脑组织在封闭缓冲液（0.1 M Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl，0.1% Triton X-100 和 0.5% BSA）中于室温孵育1小时。</li>
 <li>在封闭液中加入1:100稀释的抗-TH抗体（见“特异性试剂表”），于4 °C孵育两天，并持续轻柔旋转（见步骤2.6）。</li>
 <li>重复步骤2.7和2.8的洗涤过程。</li>
 <li>在封闭液中加入1:200稀释的二抗，于4 °C孵育两天，并持续轻柔旋转。</li>
 <li>重复步骤2.7和2.8的洗涤过程。</li>
 <li>按图2A所示准备封片载玻片：
 <ol type="a">
 <li>在盖玻片（24 × 60 mm，1.5号）上加入两滴25 μL封片介质。</li>
 <li>在封片介质上放置两张盖玻片（18 × 18 mm，2号），中间留出间隙，然后使其干燥。</li>
 </ol>
 注意：请检查共聚焦显微镜载物台上的样品 holder。可通过将一块22 × 22 mm的1.5号盖玻片用指甲油和胶带固定在末端，使盖玻片尺寸与25 × 75 mm载玻片相同。</li>
 <li>去除洗涤缓冲液，加入50 μL封片介质，通过上下吹打使脑组织与介质充分平衡。</li>
 <li>使用剪切过的P-200移液器吸头（见步骤2.4），将脑组织转移至两张盖玻片之间的空隙中，并用1.5号盖玻片覆盖（见图2A；如需定向脑组织，请参见7）。 
注意：样品被夹在两张盖玻片之间，以便观察脑组织的前侧和后侧。</li>
 <li>用封片介质完全填充两张盖玻片之间的空间；从一个角落开始加样以排除所有气泡；待其干燥后用指甲油密封。</li>
 <li>为评估特定簇中多巴胺能神经元的数量，使用共聚焦显微镜沿z轴采集一系列光学切片，步长为1.0 μm（有关成年Drosophila脑内多巴胺能神经元簇的解剖学鉴定，请参见7）。</li>
</ol>

<ol><li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
<li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li>
<li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li>
<li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil%3A+anatomical+and+physiological+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5(2009).</li>
<li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson%27s+Disease+and+Related+Synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706(2011).</li>
<li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li>
<li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li>
<li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205(2010).</li>
<li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li>
</ol>

我们声明不存在任何竞争性财务利益。

本文所述的检测方法为研究特定基因、信号通路或小分子化合物在衰老过程中以及不同疾病相关遗传背景下维持多巴胺能神经元中的作用提供了有效的手段（详见文献5）。
由惊跳诱发的负向趋地性行为 果蝇 已广泛用作评估不同遗传背景下多巴胺能神经元功能的功能性读数，特别是在存在帕金森病相关突变的情况下。不同研究之间已观察到一些差异（参见 12 （有关更详细的讨论，请参见正文）。这些差异至少部分归因于不同的实验设置和条件，包括每根试管中测试的果蝇数量（单只果蝇） 与 果蝇群体）在 CO 处理后的恢复时间2介导的麻醉以及连续试验的次数（参见 4 和 11 作为不同检测设置的示例）。因此，建议对这些参数进行控制，并在必要时根据特定检测需求进行优化。
通过TH免疫染色/共聚焦显微镜对多巴胺能神经元进行定量，可与基于THGal4驱动的GFP表达并通过GFP荧光/共聚焦显微镜识别多巴胺能神经元的方法互换使用。...

本实验方案的特异性依赖于使用一种Gal4果蝇品系，该品系利用酪氨酸羟化酶基因的调控序列，实现多巴胺能神经元中的特异性表达。 3酪氨酸羟化酶催化多巴胺合成的首个且限速步骤。在成年果蝇脑中，酪氨酸羟化酶（TH）的免疫反应性与多巴胺的分布重叠，因此TH是鉴定多巴胺能神经元的良好标志物。 体内 （例如参见 6此外，THGal4 的表达模式比其他 Gal4 品系（如 DdcGal4）更具特异性。DdcGal4 包含来自多巴脱羧酶基因的调控序列，可在多巴胺能神经元中驱动转基因表达，同时也可在5-羟色胺能神经元及部分胶质细胞亚群中驱动表达。 3.
Feany 和 Bender（2000 年）首次发现，在 Drosophila 中广泛表达与帕金森病（PD）相关的的人源 α-突触核蛋白基因会加速惊吓诱导的负向趋地性行为的进行性丧失。我们使用多巴胺能神经元特异性的 THGal4 品系驱动 α-突触核蛋白转基因的表达，也观察到了类似的结果10，并利用这一功能性表型读数来研究 Nrf2 通路在此帕金森病 Drosophila 模型中的神经保护作用14。本文所述的具体实验方法改编自文献2和3。
Drosophila 大脑包含超过 100 个多巴胺能（DA）神经元，这些神经元至少分为 5 个不同的簇（PPL1、PPL2、PAL、PPM1/2、PPM3），可通过共聚焦显微镜在完整脑组织切片中观察到（例如参见11和7）。目前仍存在争议的是，Drosophila 大脑中 DA 神经元的数量是否会随年龄增长而减少9, 11；然而，在果蝇中模拟人类疾病的帕金森病（PD）相关基因发生突变或过表达时，可观察到与年龄相关的神经退行性变5。在 DA 神经元中表达人类 α-突触核蛋白即具有此类效应，因此已被用作帕金森病的模型。本文中，我们描述了一种利用酪氨酸羟化酶（TH）作为细胞标记物，在完整脑组织切片中对 DA 神经元进行计数的检测方法。该方法改编自文献13和10。

<table><tbody><tr><td>兔抗酪氨酸羟化酶抗体</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔IgG抗体（TRITC标记）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>711-026-152</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>聚苯乙烯小瓶</td><td>VWR</td><td>89092-734</td><td>28.5 x 95 mm</td></tr><tr><td>数码相机</td><td>佳能</td><td>PowerShot A3100IS（型号）</td><td>1210万像素 4倍光学变焦</td></tr><tr><td>1.5号玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366 205 48393 252</td><td>尺寸：18 × 18 毫米，24 × 60 毫米</td></tr><tr><td>2号玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td>尺寸：18 x 18 mm</td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>70543-01</td><td>尺寸：30 mm 外径</td></tr><tr><td>Dumostar 5号镊子</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72705-01</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>Stemi 2000（型号）</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP2 或 SP5（型号）</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;材料表&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

评估神经退行性表型 黑腹果蝇 通过攀爬实验和全脑免疫染色检测多巴胺能神经元

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster 是研究神经系统衰老及病理性退行性过程的重要模式生物。果蝇作为实验系统具有诸多优势，包括遗传操作简便、生命周期短，以及能够观察并进行复杂行为的定量分析。通过在 Drosophila 大脑特定神经元群体中表达与疾病相关的基因，可用来模拟帕金森病和阿尔茨海默病等人类神经退行性疾病5。
多巴胺能（DA）神经元是人类大脑衰老过程中最易受损的神经元群体之一。在帕金森病（PD）——最常见的神经退行性运动障碍疾病中，DA神经元的加速丢失导致运动功能进行性且不可逆地下降。除了年龄和环境毒素暴露外，多个基因编码区或启动子区域的特定突变会进一步加剧DA神经元的丢失。这些与PD相关的等位基因的鉴定为以下研究提供了实验基础 果蝇 作为研究多巴胺能神经元神经退行性的模型 体内例如，在帕金森病相关的模型中表达人源α-突触核蛋白基因 果蝇 多巴胺能神经元重现了人类疾病的某些特征， 例如 多巴胺能神经元进行性丢失及运动功能下降 2因此，该模型已成功用于识别帕金森病（PD）中潜在的治疗靶点。 8.
本文介绍了两种常用于研究果蝇（Drosophila）中多巴胺（DA）神经元年龄依赖性神经退行性变的实验方法：一种是基于惊吓诱导的负向趋地性反应的攀爬实验，另一种是对成年果蝇完整脑组织进行酪氨酸羟化酶免疫染色，以监测不同年龄时DA神经元的数量。在这两种方法中，均可利用酪氨酸羟化酶（TH）启动子驱动的Gal4品系（TH-Gal4）特异性地在DA神经元中实现UAS转基因的体内（in vivo）表达3, 10。

我们已采用此处描述的检测方法，在帕金森病（PD）的Drosophila模型中研究应激保护性Nrf2通路的作用14。该模型利用TH Gal4驱动子在多巴胺能（DA）神经元中表达人源α-突触核蛋白基因2, 10。
图1展示了在TH Gal4驱动下表达不同转基因的雄性果蝇进行惊跳诱导的负向趋地性（爬行）实验的代表性结果。所有测试的基因型均表现出随时间推移运动活性下降；然而，表达与帕金森病相关的入类α-突触核蛋白转基因的果蝇相较于同龄对照果蝇（仅含TH Gal4驱动）或共表达Nrf2 DNA结合伴侣Maf-S的果蝇，其运动能力下降更为迅速。在雌性果蝇中也观察到类似结果。
图2展示了一项基于TH免疫荧光染色的多巴胺能神经元计数的代表性结果。图注中所述方法用于量化不同遗传背景对4周龄雄性果蝇脑内PPL1神经元数量的影响。请注意，在表达α-突触核蛋白的果蝇脑内，PPL1神经元出现虽小但具有显著性的丢失。
...

本文介绍了两种已建立的实验方法，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）中多巴胺能（DA）神经元随年龄增长而发生的神经退行性变化：攀爬/惊吓诱导的负向趋地性实验，可用于研究DA神经元功能退化的效应；以及酪氨酸羟化酶免疫染色，用于在全脑制片中识别并计数DA神经元。

黑腹果蝇是研究神经系统衰老及病理性退行性过程的重要模式生物。其优势在于……

本实验的总体目标是评估转基因果蝇中多巴胺能神经元的神经退行性变。首先，通过GAL4-UAS系统，在酪氨酸羟化酶启动子的调控下表达目标转基因，以实现这一目的。实验的第二步是收集具有目标基因型的果蝇，按性别分离并进行年龄同步化培养。第三步是通过负向趋地性检测果蝇在衰老过程中的攀爬活动能力。最后一步是计数在不同年龄阶段采集的解剖脑组织中多巴胺能神经元的数量。最终，实验结果将展示动物运动行为及其多巴胺能神经元群体数量的变化情况。该方法的应用前景涉及帕金森病等神经退行性疾病的治疗。此方法有助于鉴定具有神经保护作用的基因以及药理学干预手段。建立该检测方法时，应选择基因型符合实验要求且年龄相匹配的果蝇，按性别分离后，随机分为每组20至30只果蝇的实验群体。每个队列代表一个统计学样本。将队列维持在12小时光照-12小时黑暗的循环条件下，以控制昼夜节律对运动行为的影响，并保持在可于测试房间内复制的温度环境中。每两到三天更换一次队列的试管，并每周在固定时间对其进行测试。测试前30分钟，用二氧化碳麻醉每组果蝇，并将其转移至用空食品瓶用胶带连接制成的已标记塑料管中。果蝇应在5到10分钟后苏醒，但完全从麻醉中恢复的情况因年龄和基因型而异，必须进行优化。现在，在测试管后方设置一个高度刻度尺以便观察。在一张白纸上标记出1至20厘米之间的距离刻度。然后将该刻度尺固定就位。将待测试管置于距离刻度尺约20至30厘米处，并与刻度对齐。将数码相机置于可清晰拍摄小瓶的正方形视野位置。确保管壁上的标签和刻度清晰可见。相机定位后，开始录像并启动数字计时器。现在轻敲试管几秒钟。所有果蝇应聚集到试管底部。在整个实验过程中，务必以相同的持续时间和相同的力度一致地执行此步骤。一分钟后，重复进行敲击，完成15次连续试验中的第二次。当15次试验全部完成后，通过目视检查录像将果蝇转移至新的小瓶中。针对每组进行的15次试验中的每一次，统计位于两厘米标记线以上的果蝇数量。经过10秒后，通过实验确定2厘米标记的位置，该位置是各对照组在所测试的多个年龄段下，经过10秒后均达到的距离。取15次试验的平均得分，并以达到该标记的群体成员百分比表示。统计重复次数等于每组所测试的群体数量，而非15次试验次数。使用学生 t 检验、方差分析（ANOVA）或其他适当的分析方法评估不同基因型之间的统计学显著性。将果蝇放入含有 70% 乙醇的解剖皿中约一分钟，以去除表皮蜡质。然后将果蝇转移至另一个盛有冰冻 PBS 的解剖皿中，继续解剖以取出脑组织。将果蝇腹面朝上放置，可选择性地去除翅膀和足。用一对镊子夹住身体，另一对镊子夹住眼下方的体壁。然后将头部从身体上拉开。接着，通过将吻喙从头部拉下来将其移除。然后抓住新孔两侧相对边缘的头部角质层，向相反方向拉扯，直到将脑组织从头壳中完全取出。现在小心地去除脑表面残留的角质层。然后移除所有含空气的气管组织。这将防止脑组织在后续孵育步骤中漂浮。使用 P200 移液器吸头制备脑组织移液吸头。剪去几毫米尖端，并用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 平衡。将脑组织完全转移至一个装满含 4% PFA 的 PBS 的 0.5 毫升离心管中。在室温下轻轻旋转固定脑组织 20 分钟。20 分钟后，使用 P1000 移液器将固定液更换为 0.5 毫升洗涤缓冲液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）。通过倒置混匀，使脑组织在洗涤缓冲液中孵育 1 分钟，然后更换洗涤缓冲液。一分钟后，第二次更换洗涤缓冲液，将脑组织在室温下孵育20分钟。然后第三次更换洗涤缓冲液，再将脑组织在室温下孵育20分钟。现在，移除洗涤缓冲液，加入半毫摩尔的封闭缓冲液，让脑组织在室温下孵育1小时。一小时后，在封闭液中加入1:100稀释的抗一抗抗体。在4摄氏度下轻轻旋转孵育两天。为去除封闭液，重复使用用于去除固定的洗涤步骤进行清洗。然后在4°C下，用0.5毫升封闭液中1:200稀释的二抗溶液平衡脑组织，轻轻旋转孵育两天。数天后，采用相同的洗涤步骤去除二抗。制备封片时，在盖玻片上加入两滴25微升的封片介质。将两张盖玻片置于封片剂上，中间留出间隙。让载玻片自然干燥。如果载玻片的宽度与共聚焦显微镜载物台不匹配，可用指甲油将一块22 mm × 22 mm的盖玻片固定在载玻片上，使其适配。现在将大脑所在的溶液更换为50微升封片介质。使用剪去尖端的P200枪头吹打，使大脑与封片介质充分平衡。接着，使用剪去尖端的P200枪头将大脑转移至凹槽中。在载玻片封片时，将脑组织调整至可观察其前部或后部的位置。然后盖上一张1.5号盖玻片，并从一个角落开始，用封片介质填充盖玻片之间的空隙，以完全排除空气。让载玻片自然干燥，然后在检查前用指甲油密封。 在攀爬实验中，使用TH-GAL4驱动子在多巴胺能神经元中表达人源α-突触核蛋白。表达该转基因的雄性果蝇相较于同龄对照组以及共表达NRF2的DNA结合伴侣的果蝇，表现出更加快速的运动能力衰退。Math S雌性在比较不同基因型的四周龄雄性果蝇时，也观察到类似结果。通过基于免疫荧光的多巴胺能神经元计数来定量PPL1神经元的数量。在表达α-突触核蛋白的果蝇中，发现PPL1神经元出现轻微但显著的丢失。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用CLA检测和酪氨酸羟化酶免疫荧光技术，在转基因果蝇中评估varg神经元的神经退行性变。感谢观看。

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