Name: 重组工程同源重组构建果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学习利用重组工程技术构建果蝇同源重组载体的方法，通过克隆同源臂和缺口修复技术实现基因敲除或内源蛋白标记，为遗传学研究提供精确的基因操作工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Hugo Bellen和Bloomington品系中心提供的试剂。我们还感谢Koen Venken、Hugo Bellen以及Buszczak实验室和Hiesinger实验室所有成员的有益讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院向ACR（T32GM083831）、PRH（RO1EY018884）和MB（RO1GM086647）提供的资助，以及得克萨斯州癌症预防研究所向MB和PRH（RP100516）提供的资助，还有Welch基金会（I-1657）向PRH提供的资助。MB是UT西南医学中心生物医学研究领域的E.E.和Greer Garson Fogelson学者，PRH是该中心生物医学研究领域的Eugene McDermott学者。

<ol><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li>
<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li>
<li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ends-out%2C+or+replacement%2C+gene+targeting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
<li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5Bacman%5D%3A+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li>
<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+P%5Bacman%5D+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

作者对本文所述技术不存在任何利益冲突。

遗传模式生物在生物医学研究中的强大作用在很大程度上依赖于可用于遗传操作的工具。尤其是小型模式生物 C. elegans 和 Drosophila，能够以较低成本快速开展针对参与多细胞发育或功能的完整通路及基因家族的分子遗传学分析。近年来，在 Drosophila 基因操作工具的开发方面取得了显著进展14,15。例如，原本广泛应用于小鼠遗传学中以操作Bac DNA构建体的重组工程（recombineering）技术，最近已通过P[acman]载体和ΦC31介导的转基因技术被成功应用于Drosophila6。利用具有重组能力的细菌，结合不同的筛选盒，可在构建体内的任意位置插入或删除特定序列4,13。我们对原始的P[acman]载体进行了改造，使其可用于构建靶向Drosophila内源位点的体内同源重组载体。该新型载体能够生成比传统“剪切-粘贴”克隆方法更易构建的、具有更长同源臂的靶向盒。此外，该载体还整合了Gateway克隆盒，可快速高效地将新的基因组DNA引入系统中。...

在内源性位点对单个基因进行分子定义明确的精确操作，为研究真核生物学中众多相关问题提供了宝贵的工具。 果蝇 直到戈利克及其同事引入了用于产生功能缺失等位基因的反向遗传学技术，该领域才得以取得进展 体内 利用同源重组进行基因靶向 果蝇 1-3他们证明了可以利用整合型转基因构建体中的线性DNA片段来靶向特定基因组位点。这种线性的“供体”DNA由以下方式产生 体内 通过FRT介导的重组（将DNA从染色体上以环状分子形式切除），随后用巨核酸酶I-SceI进行线性化。尽管该方法已成功用于产生多种明确的损伤，但由于每个单独的敲除构建体都需要独特且定制的设计，该技术难以扩展应用于平行操作大量基因。例如，在无缝操作大片段DNA方面存在困难（&gt;5 kb 体外 使用传统的限制性内切酶/连接克隆或PCR方法，以及传统方法在片段大小上的限制 体内 转化载体常常会干扰同源重组靶向载体的快速构建。为克服这些局限性，我们将可实现长达100 kb DNA片段的亚克隆和转基因操作的重组工程/转基因P[acman]系统与ends-out基因靶向技术相结合，建立了一个高效且相对快速的平台，以促进 果蝇 基因靶向
基于重组的基因工程（recombineering）是一种强大的、以同源重组为基础的克隆技术4,5。与传统的限制性内切酶/连接酶克隆方法不同，recombineering 不受操作 DNA 序列或大小的限制。该技术利用一种特殊的E. coli菌株，该菌株携带由缺陷型λ前噬菌体提供的重组系统4。近年来，该技术已被应用于Drosophila6,7。在Drosophila中的recombineering依赖于一种经过改造的、条件性可扩增的细菌人工染色体（BAC）载体，称为P[acman]6,7。该载体包含两个复制起点：OriV，在化学诱导下可实现高拷贝数扩增，用于纯化大量DNA，以满足测序和胚胎显微注射的需求；以及OriS，在基础条件下维持低拷贝数。此外，P[acman]载体还携带一个细菌附着位点（attB）。attB位点可作为ΦC31整合酶介导转基因的底物，从而将大片段DNA整合至Drosophila基因组中的预定插入位点8,9。
我们构建了一种P[acman]载体（称为P[acman]-KO 1.0），可作为末端外同源重组的靶向载体使用 10,11为了将末端外基因靶向技术整合到该系统中，我们添加了两个FRT位点和两个I-SceI位点。我们还在这一改良载体中引入了一个Gateway盒，以简化将同源臂插入P[acman]-KO 1.0的过程。该设计提供了一种快速且简便的方法，可将几乎任何感兴趣的基因组区域引入靶向载体。在本方案中，我们将描述如何利用P[acman]-KO 1.0构建靶向载体，以及如何对该载体进行动员 体内 以靶向内源性位点。在本实验方案中，我们将使用RFP/Kan表达盒替换目标基因，但本方案也可适用于包含抗生素筛选标记的多种其他表达盒。我们已设计并成功应用了一系列用于基因替换和标签标记的表达盒 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 重组活性细菌</td><td>NCI-Frederick</td><td>重组细菌（SW102、SW105 和 SW106）</td><td>&lt;a href=&quot;http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx&quot; target=&quot;_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 电转感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>包含 CopyControl 诱导溶液</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA 聚合酶</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II 酶试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak 和 Hiesinger 实验室</td><td>按需提供</td><td></td></tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak 和 Hiesinger 实验室</td><td>按需提供</td><td></td></tr><tr><td>果蝇品系</td><td>Bloomington 品系中心</td><td>品系编号：25680、25679</td><td>y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4&lt;br/&gt; y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Biorad GenePulser Xcell 配 PC 模块</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>电转杯</td><td>Fisher Brand</td><td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

在drosophila中利用重组工程构建同源重组载体

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

内源基因位点的快速、大规模操控技术的持续发展将拓宽其应用范围 黑腹果蝇 作为人类疾病相关研究的遗传模式生物。近年来，同源重组和重组工程等技术不断进步。然而，对于大多数基因而言，产生明确的无效突变或对内源性蛋白质进行标记仍然是一项艰巨的工作。本文中，我们介绍并演示了利用基于重组工程的克隆方法构建载体的技术，这些载体可用于靶向和操控内源性基因座 体内 具体而言，我们已建立了一种结合三种技术的方法：（1）BAC 转基因/重组工程，（2）末端外同源重组，以及（3）Gateway 技术，以提供一种稳健、高效且灵活的内源基因组位点操作方法。在本方案中，我们将逐步详细介绍如何（1）设计各个载体，（2）利用缺口修复将基因组 DNA 的大片段克隆至同源重组载体中，以及（3）通过第二轮重组工程在这些载体中替换或标记目标基因。最后，我们还将提供一种将这些表达盒转移的方案 体内 通过基因敲除或基因敲入实现基因敲除或标记基因的构建。这些方法可轻松并行应用于多个靶点，并提供了一种操控基因的手段 果蝇 以及时且高效的方式完成基因组测序。

扩增LA和RA同源臂应产生500 bp的产物，PCR-SOE反应应得到1.0 kb的产物（第2.1–2.4节；图2）。第2.5节中进行的BP反应通常效率很高，将产物转化至细菌后平均可获得5–100个菌落。几乎所有经PCR检测的菌落均显示出预期的PCR产物。
在第一轮重组工程（第3节）中，将含有左同源臂（LA）和右同源臂（RA）的经酶切处理的P[acman]-KO-1.0质粒转化至SW102细胞后，预期可获得20–40个菌落。其中40–60%的克隆将携带目标重组产物。与热激处理的细胞相比，非热激对照组应几乎没有或仅有极少量菌落。若样品组与对照组平板上的菌落数量相近，通常表明存在未切割的质粒或其他污染物。在此情况下，应弃去实验并重新进行，此次需严格按照步骤3.2所述条件，确保携带左、右同源臂的P[acman]-KO-1.0质粒完全酶切。在约获得60个菌落的情况下，对目标基因组区域是否成功回收至P[acman]-KO 1.0进行PCR验证的示例如图3所示。在该示例中，经检测的菌落中有60%携带目标重组产物。必须注意观察到...

同源重组技术通过实现分子水平上精确突变的构建，极大地推动了黑腹果蝇（Drosophila）遗传学的发展。近年来，重组工程（recombineering）技术的应用使得研究人员能够操作大片段DNA并将其转化到黑腹果蝇（Drosophila）中6。本文所介绍的方法结合了这些技术，可快速构建大型同源重组载体。

在Drosophila中利用重组工程构建同源重组载体

果蝇黑腹（Drosophila melanogaster）作为模式生物的应用范围将随着对内源基因位点进行快速、大规模操控技术的持续发展而进一步拓展

本实验的总体目标是快速构建可用于靶向和操控内源性 oph 位点的大片段同源重组载体。首先选择一个覆盖目标基因组区域的后克隆，完成第一步。实验的第二步是将同源臂克隆到同源重组载体中。第三步是利用缺口修复技术将基因组DNA克隆到同源重组载体中。最后一步是用靶向盒替换基因组区域。最终，这些步骤将构建一个用于Enzo同源重组的靶向载体，从而在果蝇中通过基于重组的技术产生明确的无效突变或对内源性蛋白质进行标记。此外，书面文稿还包括一种在体内移动这些盒式结构的方案，以通过基因敲入实现基因敲除或基因标记。该技术相较于现有方法的主要优势在于，可轻松并行应用于多个靶点，并为及时、高效地操控嗜虫霉（oph）基因组提供了手段。为实现这一目标，我们的方法结合了重组和Gateway技术，以构建同源重组载体。与传统的限制性内切酶克隆技术不同，这些技术不受DNA大小或序列的限制，从而简化了克隆过程。尽管本方案描述的是生成用于基因敲除的靶向表达盒的方法，但它也可用于以几乎任何理想的方式对任意内源性基因座进行操作。这包括对目的基因进行标记、用GAL4替换目的基因、产生蛋白质截短突变或报告基因细胞系，以获得携带目的基因CG32095的遗传背景。在此示例中，打开对基因@flybased.org 的搜索。获取载体列表。在“品系与试剂”部分下查找，并查看名为“基因组克隆”的部分。在可选的克隆中，找到一个包含目标基因上游至少10千碱基和下游五千碱基的克隆。这些区域将用作同源臂。可通过将反向序列的5'端和3'端序列与果蝇基因组进行比对来实现。此外，Pac-Man 载体中的克隆也可在 pacmanfly.org 网站找到。接下来选择引物以扩增每条同源臂末端的 500 个碱基对。这些片段称为 LA 和 RA，用于将同源臂之间的基因组区域重组到 Pacman 中。KO 1.0 质粒。务必确保 500 个碱基的同源臂中不含 BAM H 一位点，因为这些位点将被消化以线性化质粒。设置两个独立的 PCR 反应，分别扩增 LA 和 RA 片段；对于 LA 片段，在正向引物中引入 TTV 一位点，在反向引物中引入 ISC 一位点序列。在与相对同源臂互补的序列的3'端下游7个碱基处，引入AB MH单一位点。对于RA片段，在正向引物中包含位于与相对臂互补序列3'端下游7个碱基处的AB MH单一位点，反向引物中则以at TB2和I sce E1序列为模板。在本实验及所有后续PCR中，使用1微升来自去污小量提取的质粒DNA，或使用半微升经隔夜培养并煮沸的含质粒细菌液。务必使用具有校对功能的DNA聚合酶。但此要求不适用于PCR检测。将PCR样本在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，并使用XMO凝胶DNA回收试剂盒提取产物。用10微升无菌水洗脱DNA。接着，从每份扩增的DNA中取10至30纳克，进行重叠延伸PCR拼接。通常使用约五分之一的纯

recombineering-homologous-recombination-constructs-in-drosophila

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

重组工程同源重组构建<em&gt;果蝇</em

利用由fosmid携带的基因组DNA为Caenorhabditis...

利用带有galK可筛选标记的重组工程法构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）转基因

在本视频中，我们描述了使用放射性标记探针通过Southern印迹技术鉴定小鼠胚胎干细胞基因组中同源重组事件的方法。当含有探针结合DNA的膜暴露于X射线时，包含同源重组事件的DNA区域会呈现为清晰的条带。...

利用Southern印迹法检测小鼠胚胎干细胞基因组中的同源重组

基因靶向技术可用于产生带有基因敲除、基因敲入和标记等位基因的转基因小鼠。本文中，我们描述了一种在大肠杆菌（E.

亚克隆加插入（SPI）——一种用于快速构建基因靶向载体的新型重组工程方法

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。...

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

蛋白质通常包含多个可发挥不同细胞功能的结构域。基因敲除（KO）无法考虑这种功能多样性。本文中，我们报道了一种基于重组介导的盒式交换（RMCE）的结构-功能研究方法，该方法应用于基因敲除的胚胎干细胞，可实现对蛋白质不同功能结构域或变异体的分子解析。...

利用重组酶介导的盒式交换在小鼠胚胎干细胞中进行结构-功能研究

本文介绍一种通过将基因的第一个编码外显子替换为转录驱动元件，从而在Drosophila中构建组织特异性双元转录系统的方法。该基于CRISPR/Cas9的技术将转录激活序列置于被替换基因的内源性调控元件控制之下，从而实现转录激活因子仅在特定基因时空表达模式中特异性表达。...

一种通过基因组编辑在Drosophila中高效构建组织特异性双元转录系统的方法

本文介绍了一种利用 Southern 印迹法和/或 PCR 鉴定小鼠胚胎干细胞中同源重组事件的详细实验方案。该方法以采用传统基于胚胎干细胞的同源重组介导靶向技术构建非肌肉肌球蛋白 II...

利用Southern印迹与聚合酶链式反应鉴定小鼠胚胎干细胞中的同源重组事件

本实验方案的目的是概述在Drosophila...

利用Drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究

Drosophila 转基因的胚胎显微注射

果蝇中的沃尔巴克氏菌感染

学习利用重组工程技术构建果蝇同源重组载体的方法，通过克隆同源臂和缺口修复技术实现基因敲除或内源蛋白标记，为遗传学研究提供精确的基因操作工具。

在Drosophila中利用重组工程构建同源重组载体

探索更多视频