一种新型的高分辨率在体内成像技术研究肿瘤生长及治疗颅内结构的动态响应

该程序的总体目标是获得骨髓来源的祖细胞的高分辨率单细胞图像，这些细胞遵循它们随时间募集到正常脑和脑肿瘤相关脉管系统的募集模式。这是通过从供体小鼠中去除胫骨和股骨以获得荧光骨髓祖细胞，然后将这些细胞注射到辐射受体小鼠中来实现的。第二步是在颅窗腔内的嵌合小鼠中产生颅内 GB M 异种移植物。

接下来，小鼠接受各种治疗方案，包括立体定向引导辐射。最后一步是在双光子共聚焦显微镜上对小鼠进行成像。最终，这种方法可用于动态研究各种模型中颅内血管形成的机制。

与离体组织组织病理学等现有方法相比，该技术的主要优点是我们可以研究与大脑中血管形成相关的关键动态信息。因此，我们可以回答围绕颅内新生血管形成机制的关键问题。虽然这种方法可用于深入了解颅内新生血管形成，但它也可以应用于大脑中的其他系统和疾病过程，例如颅内缺血或中风神经退行性疾病以及肿瘤细胞转移到大脑的机制。

出于本视频的目的，我们无法遵循严格的无菌技术。因此，生物安全罩的开口超过 12 英寸，并且动物没有披风，使观看者能够获得更清晰的图像，并更好地定位实验工作的程序。应严格遵循无菌技术。

通过确认 GFP 供体小鼠的荧光表达并根据机构动物护理委员会指南对其进行安乐死来开始此过程。接下来，在无菌条件下工作时清洁双侧后肢并去除胫骨和股骨。从骨骼上剥离所有多余的组织。

然后从提取的四块骨头的两端取下端板。用 22 号针头和 1 毫升无菌 PBS 冲洗它们。一旦所有骨髓都被冲洗出来，它们就会变得清晰。

然后，混合提取的骨髓悬液。嗯，它应该包含大约 2000 万个细胞，这足以进行三只宿主小鼠的重建。接下来，准备 3 个 27 号结核菌素针，并将 300 微升骨髓悬液吸入每个针头中。

当鼠标位于限制器中时。标记背尾表面以定位自己。然后将悬浮液注射到先前照射的三个外侧尾静脉中。

在此过程中，Nod 滑移小鼠在无菌条件下工作。麻醉嵌合骨髓点头滑行小鼠，并施用 iacuc 批准的抢先镇痛。涂抹泪液凝胶以防止角膜脱水。

先用 Betadine 溶液清洁头部，然后用酒精清洁头部并去除多余的毛发。然后用酒精进一步清洁下面的头皮。从耳朵的中点到眼睛上方做一个切口。

去除第一个切口两侧的头皮，露出大约 5 毫米的底层颅骨。然后确定颅骨表面的解剖标志。接下来，通过注射 2% 利多卡因和肾上腺素溶液来识别并提升骨膜。

随后用锋利的器械从颅骨表面解剖骨膜。然后使用 2.7 毫米 TR 精炼钻头削弱颅骨右半球与 Lambda 和 bgma 等距的 2.7 毫米圆形骨瓣。不要用钻头穿透骨骼，以保护下面的硬脑膜和组织。

现在，使用解剖、镊子和牙钩以故意但可控的力量去除脆弱的骨瓣。接下来，在 30 号汉密尔顿注射器中加入 10 微升细胞悬液，并将针头放在立体定向框架上。然后将鼠标放在立体定向框架上。

将针对准之后生成的窗口中心点，降低针头直到它接触到皮质表面。然后重置数字坐标。现在将针头降低 3.2 毫米进入皮质组织。

然后缩回 0.2 毫米并在 3 毫米处注射。深度注射应以每分钟 10 微升的速度进行。注射完成后，将针头留在原位一分钟，然后慢慢缩回。

然后从框架中删除鼠标。随后，保持大脑表面水分。使用无菌 PBS 滴剂。

在大脑表面放置一个 3 毫米的盖玻片以密封 2.7 毫米的窗口。然后擦干周围的颅骨。接下来，应用兽医粘合剂将头皮组织粘在颅骨上，并将盖玻片保持在原位。

不要涂抹太多，因为它会泄漏到玻璃下并降低成像潜力。接下来，在引擎盖中混合新鲜的牙科丙烯酸粉末和溶液，并使用 22 号针头将混合物涂抹在兽医粘合剂上。为确保密封，请将亚克力与玻璃盖玻片的边缘略微重叠，但不要盖住玻璃盖玻片。

在此步骤中，将麻醉的鼠标放入房屋设计的 XAD 2 25 立体定向辐照器内的定制头套中。通过 2 毫米铝制滤光片，X 射线管以 40 峰值千伏和 0.05 毫安电流运行，获得 360 度锥形束 CT 扫描。使用图像定位载物台，使辐射 ISO 中心对准右半球，并位于背腹方向的中心。

有多种准直器可用于瞄准辐射，这证明了该模型的适应性。在这种情况下，我们使用 8 毫米 x 11 毫米进行半球照射。将半球准直器插入 X RAD 2 25 立体定向辐照器。

通过准直器从顶部和底部获取单个 CT 正交图像，通过定位解剖骨骼结构并在监视器上手动微调载物台位置，确保头部的正确定位。将 XAD 2 25 IRRADIATOR 铝制滤光片更换为 0.93 毫米铜处理滤光片。然后以 225 峰值 illa 电压和 13 毫安运行 X 射线管程序，并从顶部沿 AP 方向施用一半的辐射剂量。

将机架返回到底部位置，并从底部沿 PA 方向施用后半部分辐射剂量。在此过程中，麻醉先前生成的颅内窗鼠标并使用酒精喷雾清洁窗。在共聚焦显微镜上设置通道，由集成到生成的嵌合小鼠中的荧光染料确定。

或者，重复使用以前的设置以减少成像会话之间的可变性。在这种情况下，将成像所需的任何标签注射到外尾静脉，右旋糖酐用于脉管系统。将鼠标倒置到定制的头部限制器上，用可塑橡皮泥支撑，确保头部垂直于激光，并将限制器平放到可移动的显微镜载物台上。

打开第一通道激光，直接观察腔室窗口上的激光束交点，将其定位到颅内窗的中心。使用 5 倍镜头拍摄整个窗口的每个通道的图像，并使用 10 倍和 20 倍长距离镜头将其用作其他更高分辨率图像的映射。此示意图突出显示了与手术过程相关的技术错误，并演示了每个错误对生成的图像的影响。

窗户下方的滞留空气将在图像上显示为气泡。玻璃上堆积的丙烯酸在远红通道中会发出自发荧光，并会阻挡部分视野。同样，成像过程中窗口上的污垢在图像中显示为自发荧光弯曲。

即使是完美的颅内窗，一旦在显微镜下也会遇到问题。呼吸伪影会导致图像出现线条，而鼠标在帧上的位置不正确会导致图像分段。由于激光在图像后处理中仅穿过组织的一部分，因此可以为 CFP 标记的细胞添加一个额外的通道，从而可以从 CFP 图像中减去 GFP 图像以揭示真正的 CFP 信号。

此外，利用胶原四纤维的二次谐波产生自发荧光特性，我们能够对脉管系统的基底膜进行成像。五个荧光通道的可用性使用户能够对本文中描述的新型镜像模型进行很大的灵活性和适应性。在尝试此程序时，请务必记住外科手术过程中使用的有害产品。

丝不苟并特别注意细节以确保脑组织在整个长期成像过程中保持完好无损也很重要。观看此视频后，您应该对如何创建具有荧光祖细胞的嵌合小鼠有很好的了解，从而能够在有或没有治疗干预的情况下捕获肿瘤细胞植入后颅内脉管系统的高分辨率实时图像。