一种新型高分辨率 体内 研究颅内结构对肿瘤生长及治疗动态响应的成像技术

本实验的总体目标是，通过观察骨髓来源的前体细胞在正常脑组织及脑肿瘤相关血管中的归巢模式随时间的变化，获得这些细胞的高分辨率单细胞图像。该目标通过以下步骤实现：首先，从供体小鼠中分离胫骨和股骨以获取荧光标记的骨髓前体细胞，随后将这些细胞注射到经辐射处理的受体小鼠体内。第二步是在嵌合小鼠的颅窗装置内建立颅内胶质母细胞瘤（GBM）异种移植模型。

接下来，小鼠将接受多种治疗方案，包括立体定向引导的放射治疗。最后一步是在双光子共聚焦显微镜上对小鼠进行成像。最终，该方法可用于在多种模型中动态研究颅内血管化机制。

与现有的离体组织病理学等方法相比，该技术的主要优势在于能够研究与脑内血管形成相关的关键动态信息。因此，我们可以解答围绕颅内新生血管形成机制的核心问题。尽管该方法可用于深入了解颅内新生血管化过程，但它也可应用于脑内的其他系统和疾病过程，例如颅内缺血或脑卒中、神经退行性疾病，以及肿瘤细胞向脑部转移的机制。

本视频出于演示目的，未能遵循严格的无菌操作技术。因此，生物安全柜的开口超过12英寸，且未对动物进行铺巾，以便观众更清晰地观察操作过程，并更好地理解实验操作的步骤。实际实验工作中应严格遵守无菌操作规范。

开始此操作前，需确认GFP供体小鼠的荧光表达情况，并根据机构动物护理委员会的指南将其实施安乐死。随后，在无菌条件下清洁双侧后肢，分离胫骨和股骨，并去除骨骼上所有多余组织。

然后从四根已取出的骨骼两端去除骨端板。使用22号针头和1毫升无菌PBS冲洗骨骼。当所有骨髓均被彻底冲洗干净后，骨骼将变得透明。

随后，混匀提取的骨髓悬液。该悬液应含有约2000万个细胞，足以用于三只受体小鼠的重建。接下来，准备3支27号结核菌素注射针，分别吸取300 µL骨髓悬液。

当小鼠置于固定器中时，标记尾部背侧表面以确定方位。然后将悬浮液注射至三只预先经辐照的小鼠的尾侧静脉。

在此操作过程中，于无菌条件下使用嵌合型骨髓 nod skid 小鼠。对嵌合型骨髓 nod skid 小鼠进行麻醉，并给予经 IACUC 批准的预先镇痛处理。涂抹眼用凝胶以防止角膜脱水。

首先用聚维酮碘溶液清洁头部，然后用酒精擦拭并去除多余的毛发。接着用酒精进一步清洁下方的头皮。从耳部中点至眼睛上方做一切口。

在第一次切口两侧去除头皮，暴露下方颅骨约五毫米。然后识别颅骨表面的解剖学标志。接着，通过注射含肾上腺素的2%利多卡因溶液，识别并抬起骨膜。

随后使用锐器将骨膜从颅骨表面剥离。然后使用2.7毫米TR精修钻头，在颅骨右侧半球距人字缝（Lambda）和前囟（bgma）等距处，磨薄一块直径2.7毫米的环形骨瓣。钻孔时切勿穿透骨质，以保护下方的硬脑膜及组织。

现在，使用解剖器械、镊子和牙科钩，以谨慎而可控的力度移除变弱的骨瓣。接着，用30号Hamilton注射器吸取10 µL细胞悬液，并将针头安装到立体定位仪上。然后将小鼠置于立体定位仪中。

将针头对准此后生成的窗口中心点，然后降低针头直至接触皮层表面。随后重置数字坐标。现在将针头向下插入皮层组织 3.2 毫米。

然后回撤 0.2 毫米，并在 3 毫米深度处注射。注射应以每分钟 10 微升的速度进行。注射完成后，将针头留置原位 1 分钟，再缓慢回撤。

然后将小鼠从固定架上取下。随后，使用无菌 PBS 滴液保持脑表面湿润。

将一个3毫米的盖玻片放置在脑表面，以封闭2.7毫米的窗口。然后干燥周围的颅骨。接着，使用Vet Bond将头皮组织粘附到颅骨上，以固定盖玻片。

切勿使用过多，否则会渗入盖玻片下方，降低成像效果。接下来，在通风橱内将新鲜的牙科丙烯酸粉末与溶液混合，并使用22号针头将混合物涂布于 Vet Bond 表面。为确保密封严密，应将丙烯酸涂至略微覆盖盖玻片边缘，但不可覆盖整个玻璃盖玻片。

在此步骤中，将一只麻醉后的小鼠放入定制的头部固定器中，该固定器位于专门设计的XAD 2 25立体定向辐照仪内。使用X射线管在40千伏峰值和0.05毫安条件下，经2毫米铝滤过，获取360度锥形束CT扫描图像。利用该图像调整载物台位置，使辐射等中心对准右侧半脑，并在背腹方向上居中。

有多种多样的准直器可用于靶向辐射，这体现了该模型的适应性。在此情况下，我们采用8毫米×11毫米的半球形照射准直器。将半球形准直器插入X RAD 2 25立体定向辐照器中。

通过准直器从上方和下方获取单个 CT 正交图像，以定位解剖骨性结构，并在监视器上手动微调载物台位置，确保头部正确放置。将 XAD 2 25 IRRADIATOR 铝滤片更换为 0.93 毫米铜治疗滤片。然后以 225 千伏峰值电压和 13 毫安运行 X 射线管程序，并从上方以 AP 方向给予一半的辐射剂量。

将机架返回到底部位置，并从底部以腹侧向背侧（PA）方向给予第二半剂量的辐射。在此步骤中，麻醉先前制备的颅窗小鼠，并用酒精喷雾清洁颅窗。根据所构建的嵌合小鼠体内整合的荧光染料，设置共聚焦显微镜的通道。

或者，可重复使用先前的设置，以减少成像会话之间的变异性。在此情况下，通过尾静脉侧支注射成像所需的标记物，如用于血管造影的葡聚糖。将小鼠倒置于定制的头部固定装置上，用可塑性橡皮泥支撑，确保头部与激光垂直且平整，然后将固定装置加载到显微镜的可移动载物台上。

打开第一通道激光器，并通过直接观察激光束在颅窗上的交叉点，将激光束定位至颅窗中心。使用5倍物镜对整个颅窗区域拍摄每个通道的图像，并将其作为使用10倍和20倍长工作距离物镜获取其他高分辨率图像的定位参考图。该示意图重点说明了手术过程中可能产生的技术误差，并展示了每种误差对成像结果的影响。

窗口下方滞留的气泡在图像中会以气泡形式可见。玻璃上的丙烯酸积聚物在远红通道中具有自发荧光，会遮挡部分视野。同样，成像过程中窗口上的污物会在图像中表现为自发荧光的伪影。

即使完美的颅窗在显微镜下也可能出现问题。呼吸伪影会导致图像出现条纹，而小鼠在支架上位置不佳则会导致图像分段。由于激光仅穿过部分组织，结合后期图像处理，可以为CFP标记的细胞添加额外通道，通过从CFP图像中减去GFP信号来揭示真实的CFP信号。

此外，利用胶原四型纤维的二次谐波自发荧光特性，我们能够对血管基底膜进行成像。本研究所描述的新型镜像模型具备五个荧光通道，为使用者提供了极大的灵活性与适应性。在实施该操作过程中，需特别注意手术期间所使用的有害物质。

在整个长期成像过程中，细致入微并特别关注细节也至关重要，以确保脑组织不受损伤。观看本视频后，您应能充分掌握如何构建带有荧光标记前体细胞的嵌合小鼠，并能够继而获得高分辨率的实时图像，以观察肿瘤细胞植入后颅内血管系统的变化，无论是否进行治疗干预。