胰岛β细胞胰岛素分泌过程中细胞外蛋白相互作用的共培养分析

本实验的总体目标是研究涉及特定跨膜蛋白胞外域的跨细胞相互作用如何影响β细胞功能，特别是胰岛素分泌。该目标通过以下步骤实现：首先将含有目的蛋白的质粒转染至一种哺乳动物细胞系中，随后将β细胞系与这些哺乳动物细胞进行共培养。

最后一步中，将共培养物在含有不同葡萄糖浓度的培养基中孵育，以评估葡萄糖刺激的胰岛素分泌情况。最终，采用胰岛素放射免疫分析法或ELISA来检测培养的β细胞分泌到培养基中的胰岛素水平。该技术相较于现有方法（如基因过表达和基因敲低）的主要优势在于，它避免了对mRNA和蛋白质表达的干扰，从而防止可能对β细胞的健康和/或功能产生影响，进而干扰对特定蛋白质相互作用的分析。

首先将 HEC 293 细胞以每孔 0.5 毫升 HEC 293 培养基的量接种至 24 孔板中，确保细胞均匀分布在孔底。每次沿一个方向轻轻摇动培养板，摇动速度应与孔中液体形成的波浪同步。当 HEC 293 细胞融合度达到 100% 时，用含有 0.8 微克编码目标蛋白的质粒和 2 微升 Lipo 2000 的转染试剂对细胞进行转染。

根据脂质体实验方案，此处展示了即将演示的共培养实验的整体流程，该流程使用非酶解细胞去除剂。首先，从T75培养瓶底部收集约70%至80%汇合度的INS-1细胞。在室温下以150 ×g离心3分钟后，使用P1000移液器将细胞沉淀重悬于1 mL由一半INS-1培养基和一半其他培养基组成的混合液中。

然后使用10毫升移液管向其中加入额外的24毫升混合培养基，并重悬细胞。吸出含有HEC 293细胞的24孔板各孔中的培养基。接着，使用P1000移液器沿孔壁轻柔地将500微升INS-1细胞悬液加入六孔细胞层中。每处理六个孔后，使用10毫升移液管重新混悬INS-1细胞。

再次确保细胞悬液均匀。根据实验方案，将细胞孵育24至48小时。在细胞孵育达到所需实验时间后，每次处理一个孔，一只手吸除共培养培养基，另一只手立即用250微升含有2.5毫摩尔葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液替换培养基。

在共培养物预孵育一小时后，将低葡萄糖KRB缓冲液更换为250微升的2.5毫摩尔或20毫摩尔葡萄糖溶液。再孵育一小时后，将KRB缓冲液转移至微量离心管中，并在离心机中以1500 × g、4°C离心五分钟。立即向孔板中加入含蛋白酶抑制剂的100微升RIPA细胞裂解缓冲液，并将孔板在4°C孵育20分钟。

当离心管完成离心后，取出 200 µL 上清液，用于后续的胰岛素放射免疫分析或 ELISA 分析。最后，将此时的细胞裂解液在 10,000 ×g 条件下离心 15 分钟，然后取 50 µL SNAT，用于胰岛素放射免疫分析或 ELISA 分析。此处展示了将 INS-1 β 细胞与转染表达一种神经配体同工型（本文简称为 NLX）的 HC293 细胞共培养后获得的结果。

NLX的表达增加了共培养的INS-1细胞的基础和刺激性胰岛素分泌。NLX的胞外域必须与INS-1细胞表面的另一种蛋白质或分子相互作用，从而促使INS-1细胞分泌更多的胰岛素。接下来的两个图表展示了利用共培养系统进行其他类型分析的结果。

在第一张图中，展示了NLY对共培养的INS-1细胞胰岛素含量的增加作用。而在本实验中，从细胞层收集RNA，并通过反转录定量聚合酶链式反应（R-T-Q-P-C-R）进行分析。与NLY共培养可提高胰岛素及PDX-1 mRNA的表达水平。

采用此方案后，可进一步进行QPCR或定量免疫组织化学等方法，以回答更多问题，例如转染蛋白的细胞外相互作用是否会引起细胞结构或基因表达的变化。