多路复用讯问癌症相关的信号转导在培养的细胞中的荧光素酶的筛选平台
July 3rd, 2013
实现系统级的细胞过程的理解，是现代细胞生物学的目标。我们在这里描述的各种细胞功能的复用荧光素酶记者的战略点审问基因的功能基因组规模的RNAi库。
以下协议的总体目标是通过同时监测多个细胞读数来实现基因功能的基因组规模询问。在本演示中，基于 Firefly RAN 和 Cipro Dina 荧光素酶的报告基因分别用于监测 P 53 WINT 和 KRAS 通路活性。这三个报告基因用 irna 进行 cot 横切，将目标基因靶向 HCT one 16 细胞，一种结直肠癌细胞系。
随后，测量细胞裂解物中的萤火虫和香草荧光素酶活性，同时测量 Cipro DEA 荧光素酶的活性。在培养物中测量分泌的酶。获得的中等结果显示了检测系统的可重复性以及揭示这三种癌症相关通路中基因的共享和独特作用的能力。
与现有方法（如微射线或多色撬动）相比，该技术的主要优点是它是查看转录细胞输出的经济实惠、通用且具有成本效益的方法。这种方法可以帮助回答癌症研究中的问题，例如开发分子靶向治疗策略。尽管我们的瞬时转染方案努力 IL 和筛选设置的前期时间承诺最少，但它可能会增加井间信号的可变性，这可以通过查看报告比率而不是查看孔的绝对失败来抵消。要开始此程序，洗涤五个 10 厘米见方的 80% 至 90% 汇合 HCT 板，一个 16 细胞与 PBS，然后通过胰蛋白酶化收获每个板的细胞。
使用 1 毫升胰蛋白酶溶液，然后用 10 毫升含有 2% FBS 和 1% 青霉素的 DMEM 中和。链霉素将悬浮细胞转移至 50 mL 锥形管中，并以约 130 G 离心 5 分钟。去除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 毫升培养基中。
用细胞计数器计数细胞数，然后制备每毫升 10 到 5 个细胞的细胞溶液。保留 150 毫升细胞悬液以备下一步使用多滴自动液体分配板。100 μL 或 10 至 96 孔培养板每个孔中的第四个细胞。
在这种情况下，细胞悬液应足以进行 1296 铺板。孔板将板与细胞在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳的培养箱中孵育，同时制备转染混合物。使用标准 MIDI 制备试剂盒分离此处使用的高质量报告基因构建体 DNA，并稀释至终浓度为 1 毫克/毫升。
对于每个报告基因，通过混合以下 30 微升 P 53、FL、30 微升 8 X-T-C-F-R-L、30 微升麋鹿 1 G 4 6 微升 U-A-S-C-L 和 4 微升 H 2 oh 来制备 100 微升报告基因构建储备液。这将产生 DNA 混合物，最终比例为 1：1：1：0.2 的报告基因，最终 DNA 浓度为 0.3 毫克/毫升。接下来，制备足以转切片 1296 的 I-R-N-A-D-N-A 转染混合物。
孔板将 80 μL 报告基因构建储备液稀释在 QIAGEN 效应试剂盒中的 8 mL EC 缓冲液中，得到终浓度为 3 μg/mL板的 DNA 溶液。将 20 μL DNA 溶液加入 96 孔 PCR 板的每个孔中。96 孔板的数量将取决于要测试的 irna 池数量。
例如，在这种情况下，我们需要 4 个 96 孔板进行评估。384 个不同的 SIR A 混合使用生物群落自动液体处理器将每 5 微摩尔 siRNA 的 2 微升转移到含有稀释 DNA 储备液的 PCR 板的相应孔中。接下来，向 DNA siRNA 板的每个孔中加入 1 μL 增强子溶液。
让增强剂反应在室温下发生 5 分钟。然后向每个孔中加入 3 μL 有效转染试剂，并在室温下再孵育 10 分钟。为了阻止转染复合物的形成，向 PCR 板的每个孔中加入 10 微升含有 2% FBS 和 1% 青霉素链霉素的 DMEM。
从培养箱中取出含有 HCT one 16 细胞的 1296 孔板。将 10 μL 转染混合物转移至含有细胞的 96 孔板的每个孔中，每次转染一式三份进行。相同的混合物将应用于两个额外的 96 孔板，其中包含细胞。
将细胞与转染混合物在 37 摄氏度下，在 5% 二氧化碳的潮湿环境中孵育 36 小时。转染细胞后 36 小时。荧光素酶活性已准备好进行测量。
由于本研究包含多个报告基因，一个分泌到培养基中，另外两个在细胞质中表达。将从培养基和细胞裂解物中获得测量结果，以检测培养物中的 Cipro Dina 荧光素酶或 CL 活性。中等复制板。
将 20 μL 培养基加入白色不透明 96 孔板中。使用多滴向每个孔中加入 20 μL CL 测定缓冲液。接下来，向每个孔中加入 10 微升 Cipro Dina Lucifer 和底物，并使用发光计检测 CL 活性以检测萤火虫荧光素酶和香草荧光素酶活性，必须首先制备细胞裂解物。
将每个板倒置并将培养基倒置在水槽中，从细胞中取出培养基。在纸巾上轻轻敲击倒置的板，去除剩余的培养基。向每个细胞孔中加入 30 μL 1 x 惰性裂解缓冲液。
将板放在室温下以中速设置的平台摇杆上 5 分钟。5 分钟后，向每个细胞孔中加入 20 μL 荧光素酶检测试剂，并立即使用光度计测量萤火虫荧光素酶活性。接下来，添加终止剂和辉光试剂以淬灭萤火虫荧光素酶活性，然后测量荧光素酶活性。
在多重检测之前，单独评估了三种不同筛选平台的稳定性。用 8 个 XTCF PP 53、ta、Luke 或 ALK、1 个编码报告基因构建体的萤火虫荧光素酶以及分别靶向 WINT、β-连环蛋白、P 53 或 KAS 的 siRNA 库转染指定的结直肠癌细胞系。指出了每种细胞系的通路相关基因型。
通过这些诱导效应对相关信号转导通路的可重复性来评估每个筛选平台的强度。如这些代表性结果所示，甜菜碱和 siRNA 对 RKO 细胞中的 8 个 XTCF 报告基因活性没有影响。与 DLD one 和 HCT one 相比，16 个细胞分别缺乏 A PC 通路、抑制蛋白并表达 beca tenin 的活化形式。
随后，结果表明这些报告基因可以一起使用，使用这些图中指示的 IRNA 池同时测量风 β-catenin P 53 和 KRAS 信号转导通路的基因活性。Y 轴上显示了相对荧光素酶活性，X 轴上显示了靶向指定目标基因的 siRNA。例如，靶向 β-catenin 的 siRNA 库会降低 wind β-catenin 通路活性，而不会显著影响 P 53 和 KRA S 通路。
在尝试开发多重报告基因系统时，优化转染区域和报告基因信号意图的目标细胞系非常重要。
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概述
该协议通过同时监测多个细胞读数来实现基因功能的基因组规模探究。使用萤火虫和环丙沙星萤光素酶报告基因，在结直肠癌细胞中评估关键癌症通路的活动。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 肿瘤学
- 基因功能分析
背景
- 理解细胞过程在现代细胞生物学中至关重要。
- 多重萤光素酶报告基因可以增强基因功能探究。
- RNAi库促进基因相互作用的研究。
- P53、WNT和KRAS等通路在癌症研究中具有重要意义。
研究目的
- 开发同时监测多个细胞功能的方法。
- 评估特定基因敲低对癌症通路的影响。
- 证明测定系统的可重复性。
使用的方法
- 将萤光素酶报告基因和RNAi共转染到HCT116细胞中。
- 测量细胞裂解物中萤火虫和香草萤光素酶的活性。
- 评估培养基中分泌的环丙沙星DEA萤光素酶的活性。
- 分析癌症通路中共同和独特的基因作用。
主要结果
- 证明了测定系统的可重复性。
- 揭示了癌症通路中基因的共同和独特作用。
- 提供了对P53、WNT和KRAS通路功能的见解。
- 验证了基因功能研究的多重方法。
结论
- 该协议允许全面分析基因功能。
- 多重萤光素酶报告基因有效用于通路分析。
- 这种方法可以增强对癌症生物学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This multiplexed luciferase screening platform enables simultaneous interrogation of multiple cancer-associated signal transduction pathways, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By providing quantitative, reproducible readouts of P53, WNT, and KRAS pathway activity, the method enhances predictive confidence in early-stage target prioritization and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by monitoring pathway-specific responses to gene knockdown.
- Operational Value: Supports functional target validation through multiplexed readouts that clarify mechanistic basis of phenotypic outcomes.
- Predictive Value: Facilitates pathway de-risking by revealing shared and unique gene actions across key oncogenic signaling networks.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, normalized luciferase readouts that enable reliable comparison of gene effects across pathways.
- Operational Value: Delivers a cost-effective, adaptable platform for high-content screening of large molecular libraries.
- Scalability: Compatible with automated liquid handling and 96-well formats for scalable assay deployment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Alignment: Uses disease-relevant colorectal cancer cell models to monitor pathway activity with direct relevance to human cancer biology.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-phase target hits to mechanistic understanding of pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by clarifying whether gene effects are pathway-specific or pleiotropic.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling mechanistic insight before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene knockdown to specific signaling outputs.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, multiplexed measurements compatible with library-scale applications.
- Analytics: Provides ratio-based luciferase readouts that normalize for transfection variability and enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical work by using cancer-relevant pathways and cell models with known pathway genotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening capability for iterative target validation across multiple oncology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing mechanistic ambiguity in phenotypic screening data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through internal reporter controls and ratio-based analysis.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets before costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by distinguishing pathway-selective from broad-effect gene modulators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and luciferase assay protocols.
- Dependent on luminometer access and standardized reagent preparation for consistent signal detection.
- Necessitates cross-team alignment on assay normalization methods (e.g., ratio-based vs. absolute values).
- Involves adaptation considerations when transferring to different cell lines or pathway reporters.
- Subject to well-to-well variability in transient transfection, mitigated by internal reporter ratio analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:54
Preparation of Cells for siRNA and Reporter Transfection
5:42
Adding Transfection Mixtures to Cells
4:10
Preparing siRNA/DNA Transfection Mixtures
6:21
Determine Luciferase Activities from Cell Samples
8:04
Results: High-throughput Interrogation of Gene Function in Wnt/β-catenin, p53, and Kras Singaling
9:53
Conclusion
3:22
Preparing Reporter Construct DNA
3:19
siRNA and Reporter Transfection of Cells
