动态相互作用三维结构分析的关联显微技术

本实验的总体目标是通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，展示相关荧光光镜与冷冻电子显微镜技术的应用。该过程首先在玻璃底培养皿中的金标记电子显微镜载网上接种并培养HeLa细胞，并用GFP标记的HIV-1颗粒感染HeLa细胞。第二步是采集HIV-1感染细胞的时间序列高速三维活细胞共聚焦图像，并在玻璃化处理后通过自动化的三维颗粒追踪技术对图像进行分析，以研究单颗粒的动力学行为。

通过冷冻荧光成像，在活细胞成像数据中的相同病毒颗粒被定位，以进一步进行高分辨率三维冷冻电子断层扫描分析。最后一步是针对所有含有HIV-1病毒颗粒的已识别位置，采集倾斜角度的冷冻电镜投影序列，并使用imod软件通过加权反投影算法重建三维断层图像。最终，结合先进的三维关联活细胞荧光显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术，可直接观察动态的、衍射受限的病毒颗粒及其与宿主细胞的相互作用。

我们的研究旨在开发一种关联成像方法，能够直接可视化仅由一次HIV感染事件所引发的过程。通过将活细胞荧光显微成像、冷冻荧光显微成像与冷冻电子断层扫描技术相结合，可利用活细胞及冷冻荧光信号显著指导冷冻电子断层扫描中的样本筛选。此外，冷冻电子断层扫描所获得的结构信息还可与通过活细胞成像获取的荧光标记靶标的动态功能数据相互补充。该技术相较于现有方法的主要优势在于，将先进的关联式高速三维活细胞成像与高分辨率三维冷冻电子断层扫描技术相结合，用于研究那些本质上难以捕捉的动态过程，例如HIV-1型病毒与宿主细胞在感染早期的相互作用。

为准备用于细胞培养的载网，将200目R型二比二Quantifoil金质EM寻边载网的碳膜面在25毫安电流下进行25秒的电晕放电处理。将载网碳膜面向下漂浮于40微升、浓度为50微克/毫升的纤连蛋白溶液液滴上，以实现EM载网的纤连蛋白包被。随后将其置于紫外灯下的组织培养罩中消毒两小时，再将HeLa细胞以每毫升2×10⁴个细胞的密度接种到载网上，置于玻璃底培养皿中培养。

在添加适当补充物的 DMEM 中，于 HIV 感染前约 18 小时，将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育。在感染前，向玻璃底培养皿中的 HeLa 细胞加入荧光细胞示踪剂，并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，以使细胞摄取荧光染料。用 PBS 洗涤细胞，然后加入 50 µL 预热的新鲜培养基。将培养皿放入活细胞成像室，置于扫描场共聚焦显微镜下，保持 37 摄氏度环境。由于冷冻电镜需要相对薄的样品区域。

选择多个视野区域，每个区域包含一个到三个细胞，且细胞处于两次有丝分裂之间、形态最铺展和扁平的阶段，使用NIS元素软件记录这些位置，以供后续成像使用。接着，用含有G-F-P-V-P-R的VSVG假型HIV-1颗粒感染细胞，并将病毒颗粒加入培养皿的底部小室中，注意不要扰动电镜网格。由于成像位置已预先选定并保存，因此在加入病毒后立即在先前选定的位置采集20至40分钟的时间序列高速3D共聚焦图像。

共聚焦活细胞成像后，立即将培养皿放置于冰上预冷的铜块上，并转移至冷冻电镜样品制备室。将电镜载网装入专用镊子中，用滤纸迅速吸去残留的培养基，立即在载网上滴加数微升含有15纳米金颗粒和0.2微米荧光微球的混合溶液。其中荧光微球用于辅助荧光成像与冷冻电镜之间的关联定位。

将镊子装载到玻璃化冷冻装置上，用于浸入式冷冻，并优化吸水参数以获得最佳结果。开始进行冷冻荧光显微镜实验时，将干燥的氮气管路连接至套在物镜镜头上的套筒，以保持镜头温暖并防止结霜；将自制的冷冻荧光样品台安装到倒置荧光显微镜上。将冷冻样品台的液氮进液口连接至自加压杜瓦瓶，并将液氮溢流保护出口置于合适的容器中。

将冷冻水合样品载网放入铜块上的电镜样品盒中，并在上方放置预冷的 C 形夹环以固定载网。将样品盒置于冷冻载台内腔中，搜索并定位活细胞成像数据中相同的病毒颗粒。由于电镜载网具有索引标记，可在活细胞图像与冷冻荧光图像中直接定位同一颗粒。

在低温条件下，使用配备长工作距离物镜的光学显微镜，在已确定的位置获取低温微分干涉（DIC）图像和荧光图像。在进行低温荧光成像时，需定期检查低温载物台中的液氮液位，并根据需要使用自加压液氮罐补充液氮，以确保样品载物台温度始终低于零下170摄氏度，满足低温电子断层扫描的要求。将样品载网装载至配备场发射枪的电子显微镜的低温转移站中，在低剂量搜索模式下以140倍放大倍率进行观察。

确定已获取冷冻荧光图像的区域或网格方格。在低剂量搜索模式下，以 3,500 倍放大倍数记录相关区域的低倍冷冻透射电镜图像，并将位置信息保存至一个载物台文件中。插入一个 100 微米的物镜光阑进行搜索，并将所有与 GFP 信号相关联的位置保存至第二个载物台文件中。

设置用于采集倾转系列图像的断层扫描参数，包括倾转角度范围、电子剂量、离焦值以及倾转方案。对所有已保存的位置采集倾转系列图像，以启动此流程。配置主窗口，以便可同时调整或监控Tomo Graham计算的多个阶段，修改必要的参数，并执行各处理步骤所需的具体程序。

在最后阶段，创建一个主残差误差小于0.6的完全对齐的图像堆栈，并使用加权反投影算法重构断层图像（Toms），以表征病毒颗粒的动态行为。通过高速共聚焦活细胞显微镜对感染HIV-1的HeLa细胞进行成像，并利用自动化的三维颗粒追踪技术分析颗粒的运动。

在此代表性图示中，通过黄色箭头所示的一个绿色荧光病毒颗粒，在三维共聚焦图像序列中进行追踪，帧间时间间隔为三分钟，以避免在获取最后一张共聚焦活细胞图像与 plunge 冷冻之间出现数分钟的时间延迟。为此，设计并构建了一种用于在冷冻电镜样品盒内对冷冻水合样品进行成像的冷冻荧光显微镜载台。

图A显示了光学显微镜下的一个自加压杜瓦瓶，其中装有液氮，用于冷却铜制冷冻样品台。图B显示了冷冻样品台内部的顶部视图，白色箭头所指为内腔。样品载网放置在EM样品 cartridge 上，该 cartridge 位于铜块平台的中央，黑色箭头所示即为此平台。

该平台专为与非偏振电子显微镜配合使用而设计。将载有样品的载网装入后， cartridges 转移至内腔进行冷冻荧光显微成像。显微镜面板 C 和 D 分别显示了在使用非偏振冷冻电子显微镜时，用于固定载网的铜环放置前后，样品 cartridge 的状态。

通过直接观察荧光标记的HIV V一型颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，展示了该方法在高级相关性活细胞显微镜和冷冻电子断层扫描中的应用价值。图A所示为使用冷冻光学显微镜载物台记录的微分干涉差（DIC）图像，与图B中显示的GFP标记颗粒的冷冻荧光图像叠加。标记的颗粒被着色。图C、D和E（红色边框）分别为包含图B和图C中圈出的荧光颗粒区域的低剂量冷冻透射电镜图像，放大倍数分别为140 × 3、5,500 × 和27,500 ×。

图E插图是采集断层倾斜系列图像后记录的放大视图，图FG和H展示了在Z方向上相距21纳米的三个厚度为4纳米的断层切片。粒子与helo细胞膜之间的连接在插图的投影图像、图E以及断层切片中均以箭头标示。在图F和g中。

我们提出了一套简明的实验方案，以提供一种先进的关联分析方法，用于通过延时共聚焦脂质细胞荧光成像结合冷冻电子断层扫描技术，研究病毒与无菌环境之间的动态相互作用。在实施该流程时，需特别注意荧光图像与电子显微镜图像之间精确且可靠的关联，这对成功获取冷冻电子断层图像至关重要。本方法所获得的数据将广泛适用于细胞生物学中涉及动态细胞过程的多种研究，例如细胞信号转导及表面受体内化等。