相关显微镜的动力相互作用的三维结构分析
June 24th, 2013
我们描述了相关显微镜方法，结合高速的3D活细胞荧光显微镜和高分辨率低温电子断层扫描。我们的相关方法，小HIV-1颗粒与宿主相互作用的HeLa细胞成像动态演示的能力。
该程序的总体目标是通过对与宿主 hela 细胞相互作用的动态小 HIV one 颗粒进行成像来展示相关荧光和冷冻电子显微镜方法的用法。这是通过首先在玻璃底培养皿中的金探测器 EM 网格上接种和培养 heela 细胞，然后用 GFP 标记的 HIV one 颗粒感染 heela 细胞来实现的。第二步是收集 HIV 1 感染细胞的延时高速 3D 活细胞共聚焦图像，并通过自动 3D 粒子跟踪分析图像，了解玻璃化后的单粒子动力学。
样本，来自活细胞成像数据的相同病毒颗粒位于冷冻荧光图像中，用于进一步的高分辨率 3D 冷冻电子断层扫描分析。最后一步是收集所有已识别的包含 HIV one 颗粒的位置的倾斜冷冻电镜投影系列，并使用 imad 软件通过加权反向投影算法重建 3D toms。最终，先进的 3D 相关活细胞荧光显微镜和高分辨率冷冻电子断层扫描用于直接可视化动态衍射受限的病毒颗粒及其与宿主细胞的相互作用。
我们的工作旨在开发一种相关方法，该方法允许仅直接可视化 HIV one 感染事件 通过以这种方式结合活细胞荧光样显微镜、冷冻荧光显微镜和冷冻电子断层扫描，活细胞和冷冻荧光信号可用于极大地指导冷冻电子断层扫描中的采样。此外，从冷冻电子断层扫描获得的结构信息可以与通过荧光标记靶标的生活方式成像获得的动态功能数据相辅相成。该技术或现有方法的主要优点是，先进的相关高速 3D 生活方式成像与高分辨率 3D 珊瑚电子断层扫描方法应用于研究本质上难以捕捉的动态事件，例如 HIV 1 型和感染早期的宿主细胞相互作用。
为了准备用于细胞培养辉光的网格，将 200 目 R 的碳侧放电，两个在两个量子箔上，金 EM finder 网格在 25 毫安下放电 25 秒。通过将纤维 nin 的碳面向下漂浮到 40 μL 的液滴（每毫升 50 μg 纤维 nin 溶液）上，用纤维 nin 涂覆 EM 网格。将其在紫外线下的组织培养罩中放置 2 小时，以便在玻璃底培养皿中以每毫升 10 至 4 个细胞的密度将 hela 细胞以两倍/毫升的密度放到网格上。
在含有适当补充剂的 DMEM 中，在 HIV 感染前 HIV 一号感染前，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育约 18 小时，在玻璃底培养皿中向 hela 细胞添加荧光细胞追踪器，并在 37 摄氏度下孵育培养皿 10 分钟，以吸收荧光染料， 用 PBS 洗涤细胞，并加入 50 μL 预热的新鲜培养基。将培养皿放入扫描场共聚焦扫描仪显微镜 37 摄氏度的活细胞室中。由于冷冻电镜需要样品相对较薄的区域。
选择多个视野，每个方块包含 1 到 3 个细胞，其中细胞位于两个有丝分裂期之间，此时它们最分散，并使用 NIS 元件软件将这些位置平放存储以供将来成像。接下来，用 VSVG、含有 G-F-P-V-P-R 和病毒颗粒的假型 HIV one 颗粒感染细胞到培养皿的底部孔中，注意不要干扰 EM 网格。由于已经选择了成像位置并在添加 varian 后立即存储，因此在先前选择的位置收集延时高速 3D 共聚焦图像 20 至 40 分钟。
共聚焦活细胞成像后，立即将培养皿放在冰冷的铜块上，并将其转移到冷冻电镜样品制备室。将 EM 网格加载到专用镊子上，用滤纸快速吸干残留的培养基，立即将其放入网格上，加入微升 15 纳米金珠溶液与 0.2 微米荧光微球混合。荧光微球用于帮助荧光和冷冻电镜之间的相关性。
将镊子加载到玻璃化装置上进行切入冷冻，并优化印迹参数以获得最佳结果。要开始冷冻荧光显微镜的程序，请将干燥的氮气管线连接到放置在物镜上的套筒上，以保持镜头温暖且无霜冻，将自制的冷冻荧光样品台安装到倒置荧光显微镜上。将 cryos 样品台的液氮入口连接到自加压 Doer，并将液氮溢流保护出口放入适当的容器中。
将冷冻的水合样品网格放入铜块上的 EM 样品柱中，并在顶部放置一个预冷 C 夹环以将网格固定到位。将卡盒放在冷冻台搜索的内腔中，并从活细胞成像数据中找到相同的病毒颗粒。由于 EM 网格具有索引，因此在活细胞图像和冷冻荧光图像中直接定位网格上的相同颗粒。
在冷冻条件下，使用带有长工作物镜的光学显微镜在识别位置获取冷冻 DIC 和荧光图像。在冷冻荧光成像过程中，定期检查冷冻台中的液氮水平，并根据需要重新填充自加压 Doer，以将样品台保持在零下 170 摄氏度以下，以进行冷冻电子断层扫描。在低剂量搜索模式下以 140 倍的放大倍率将样品网格加载到配备有场发射枪的电子显微镜的冷冻转移站中。
确定已获取冷冻荧光图像的区域或网格方块。记录相关区域的低放大倍率冷冻电镜图像，并在低剂量搜索模式下以 3， 500 倍的放大倍率将位置保存到舞台文件中。插入 100 微米物镜孔径搜索，并将与 GFP 信号相关的所有位置保存到第二阶段文件中。
设置用于获取倾斜序列的层析成像参数，包括倾斜角度范围、电子剂量、散焦值和倾斜方案。获取所有已保存位置的倾斜序列以开始此过程。配置主窗口，以便可以调整或同时执行 Tomo Graham 计算的几个阶段，修改必要的参数并执行每个处理步骤所需的特定程序。
在最后阶段，创建一个主残差小于 0.6 的完全对齐堆栈，并使用加权反向投影算法重建 Toms。在 Im mod 中，用于表征病毒粒子的动态行为。通过高速共聚焦活细胞显微镜对感染 HIV one 的 Hela 细胞进行成像，并通过自动 3D 颗粒跟踪分析颗粒运动。
在这个代表性图中，在 3D 共聚焦堆栈中跟踪由黄色箭头指示的单个绿色荧光病毒颗粒，帧之间的时间间隔为 3 分钟，以避免几分钟的时间间隔。这可能发生在收集最后一个共聚焦活细胞图像和骤降冷冻之间。设计和构建了冷冻荧光显微镜载物台，用于对冷冻电镜盒内的冷冻水合样品进行成像。
在光学显微镜上，面板 A 显示了一个充满液氮的自加压 Doer，用于冷却铜低温样品台。图 B 显示了 cryos 样品台的顶部内视图，内腔由白色箭头表示。将样品网格放置在 E EM 样品盒上，该样品盒位于黑色箭头指示的铜块平台的中心。
添加该平台是为了与非极性电子显微镜一起使用。装入样品网格后，将小柱转移到内腔进行哭泣荧光。显微镜面板 C 和 D 分别显示了放置铜环以将网格固定到位以便与非极性冷冻电子显微镜一起使用的样品盒。
通过直接观察荧光标记的 HIV V one 颗粒与宿主 heela 细胞相互作用，证明了该程序在高级相关生命细胞显微镜和冷冻电子断层扫描中的实用性。图 A 中所示的用冷冻光显微镜载物台记录的 DIC 图像与图 B 中所示的 GFP 标记颗粒的冷冻荧光图像叠加。红色面板 C、D 和 E 是包含荧光粒子的区域的低剂量冷冻电镜图像，分别以 140 x 3、500 x 和 27、500 x 在面板 B 和 C 中圈出
。图 E 中的插图是采集断层扫描倾斜系列面板后记录的放大视图，FG 和 H 显示了三个 4 纳米厚的断层扫描切片，在 Z 方向上相隔 21 纳米的距离。颗粒和螺状细胞膜之间的连接在插图和图 E 的投影图像和断层扫描切片中都由箭头表示。在 F 和 g 面板中。
我们提出了一套简单的协议，以提供一种先进的相关方法来使用延时共聚焦脂肪细胞荧光成像和冷冻电子断层扫描来分析动态病毒和无菌相互作用。在尝试此过程时，重要的是要记住荧光图像和电子显微镜图像之间的精确和可靠的相关性对于成功获取乌鸦电子断层扫描至关重要。该程序描述的数据将可用于细胞生物学中涉及动态细胞过程的许多应用，例如细胞信号传导表面受体内化。
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概述
这项研究提出了一种相关显微镜方法，该方法将高速3D活细胞荧光显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描相结合。通过成像与宿主HeLa细胞相互作用的动态小HIV-1粒子，展示了该方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 显微镜技术
背景
- 相关显微镜结合了不同的成像模式。
- HIV-1是研究病毒与宿主细胞相互作用的重要模型。
- HeLa细胞在生物学研究中广泛使用。
- 高速成像允许观察动态过程。
研究目的
- 展示相关显微镜在研究病毒动态方面的应用。
- 可视化HIV-1粒子与宿主细胞的相互作用。
- 增强对病毒实时行为的理解。
使用的方法
- 在电子显微镜网格上培养和生长HeLa细胞。
- 用GFP标记的HIV-1粒子感染细胞。
- 收集时间序列高速3D活细胞共聚焦图像。
- 进行冷冻电子断层扫描以进行高分辨率分析。
主要结果
- 成功成像活细胞中动态HIV-1粒子。
- 识别病毒粒子以供进一步分析。
- 使用冷冻电子断层扫描重建3D断层图。
- 可视化病毒与宿主细胞的相互作用。
结论
- 相关方法有效地可视化病毒动态。
- 该方法提供了对病毒-宿主相互作用的洞察。
- 它增强了对病毒在细胞环境中行为的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Correlative microscopy bridges the resolution gap between live-cell imaging and cryo-electron tomography, enabling direct visualization of dynamic viral-host interactions at molecular resolution. This approach supports target validation by linking functional dynamics observed in live cells with structural details from cryoET, reducing mechanistic ambiguity in early-stage antiviral discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing spatially and temporally resolved data on viral entry processes relevant to HIV-1 and other enveloped viruses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating real-time viral particle dynamics with high-resolution 3D structural data.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of HIV-1 interactions with host membranes under near-physiological conditions.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by linking functional live-cell imaging outputs with structural validation from cryoET.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by identifying precise cellular locations of viral entry events.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through correlative fiducial markers (gold beads and fluorescent microspheres) that enable precise sample relocation.
- Screening Readiness: Supports scalable platform use for studying dynamic cellular processes beyond virology, including membrane receptor trafficking and signaling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase dynamic imaging with preclinical structural validation, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic De-risking: Reduces uncertainty in viral mechanism of action by providing complementary functional and structural datasets.
- Disease-Relevant System: Uses HIV-1 in HeLa cells as a model for enveloped viral entry, applicable to broader antiviral target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, enabling iterative refinement of antiviral candidates based on dynamic and structural insights.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking live-cell particle tracking with cryoET-derived structural maps of virus-host interfaces.
- Screening: Enables assay readiness through precise correlation of fluorescent signals with electron-dense regions, improving reliability of compound effect evaluation.
- Analytics: Generates quantitative 3D tomograms and dynamic trajectory data that allow side-by-side comparison of viral behavior under different conditions.
- Translational Research: Connects functional live-cell data with structural cryoET outputs to support biomarker alignment and mechanism-of-action confirmation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable correlative imaging platform applicable to multiple dynamic cellular processes in virology and cell biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through multimodal data correlation.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via fiducial-based correlation and standardized vitrification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structurally validated, dynamic functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral leads based on direct observation of viral entry mechanisms in relevant cellular contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell fluorescence microscopy, cryo-sample preparation, and cryo-electron tomography.
- Dependent on specialized instrumentation including cryo-fluorescence light microscopes, vitrification devices, and TEM with tilt-series capability.
- Necessitates cross-team standardization between imaging, virology, and structural biology groups for consistent correlation and data interpretation.
- Involves adaptation considerations for different cell types, virus models, and environmental conditions affecting vitrification quality.
- Limited by the need for correlative fiducials and the technical challenge of maintaining sample integrity during transfer between imaging modalities.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:53
HeLa Cell Culture on Carbon-coated, Gold EM Finder Grids
3:54
HIV-1 Infection and Live-cell Imaging
5:19
Frozen-hydrated EM Sample Preparation
6:14
Cryo-fluorescence Light Microscopy
7:51
Cryo-electron Tomography
8:56
Three-dimensional Reconstruction using IMOD
9:33
Results: Observing Dynamic Behavior of Small HIV-1 Particles Interacting with Host HeLa Cells
12:45
Conclusion
