Name: 分析有针对性的病毒蛋白的纳米粒子递送HER2 +肿瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 了解使用多模态光学成像技术检测HerDox纳米粒子在HER2阳性肿瘤中的靶向递送与穿透效果的方法。该技术为肿瘤靶向治疗研究提供了可靠的定量分析手段。

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本工作由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助（项目编号：R01CA129822 和 R01CA140995），资助对象为 LKM-K。Medina-Kauwe 博士感谢 C. Rey、M. M-Kauwe 和 D. Revetto 提供的持续支持。

1. 全身递送 在体
<ol>
	<li>将足量的 HerDox 与无菌生理盐水混合，配制成每只 6–8 周龄荷瘤裸鼠（NU/NU 小鼠）每次注射 0.2 ml 的剂量，相当于 0.004 mg/kg 的 HerDox，用于皮下双侧 flank 异种移植瘤模型。</li>
	<li>用装有 29G 针头的 3/10 cc 胰岛素注射器轻柔吸取 HerDox 混悬液，避免产生气泡。</li>
	<li>通过配备废气清除系统的诱导室以短暂暴露于异氟烷的方式诱导麻醉（氧气流速：0.5–1 L/min，异氟烷浓度：3–4%（或更低））。</li>
	<li>将全部混合液注射至麻醉小鼠的尾静脉（每次注射 0.2 ml）。也可在固定但未麻醉的小鼠中进行尾静脉注射。</li>
	<li>在同一小鼠上连续六天每日重复注射一次。</li>
</ol>
2. 活体荧光成像 In vivo
使用多模态成像仪，在注射的最后一天（第7天）即可检测到Herdox荧光在肿瘤中的积累。以下步骤涉及使用定制的宏观照明与检测系统（图1）8。
<ol>
	<li>打开Multimode In vivo Optical Imager。</li>
	<li>选择适合阿霉素荧光检测的发射带通滤光片（590 nm ± 30 nm）。</li>
	<li>开启氩-氪激光器，并在激光光路中放置激发带通滤光片（488 nm ± 10 nm）。</li>
	<li>打开麻醉系统，将小鼠放入麻醉室（氧气流速：0.5–1 L/min，异氟烷浓度：3–4%（或更低）），并配备废气清除系统。</li>
	<li>当小鼠被麻醉后，将其从麻醉室转移至 Multimode In vivo Optical Imager 的成像室中。</li>
	<li>将鼻罩罩住小鼠鼻部，并打开气流以在图像采集期间持续给予麻醉（氧气流速：0.5–1 L/min，异氟烷浓度：2–3%（或更低））。</li>
	<li>使用 5–15 秒的曝光时间采集荧光图像。</li>
	<li>进行图像分析与处理，包括背景校正或对比度调整。</li>
</ol>
3. 离体荧光成像 Ex vivo
在最后一次（第7天）注射HerDox后24小时，可对安乐死小鼠的肿瘤及特定器官（包括肝脏、肾脏、脾脏、心脏和骨骼肌）中采集的组织进行HerDox荧光成像。
<ol>
	<li>开启Multimode In vivo Optical Imager。</li>
	<li>选择用于阿霉素荧光检测的发射带通滤光片（580 nm ± 20 nm）。</li>
	<li>打开氩-氪激光器，并在激光光路中放置激发带通滤光片（488 nm ± 10 nm）。</li>
	<li>将排列在培养皿中的肿瘤和特定器官放入Multimode In vivo Optical Imager的成像室中。</li>
	<li>使用5–15秒的曝光时间采集组织的荧光图像。初始荧光图像采集的示例如图2a所示。使用空的培养皿重复相同操作，作为空白背景（图2b）。</li>
	<li>进行图像分析与处理，包括背景校正或对比度调整。校正后图像的示例如图2c所示，由图2a减去图2b得到。</li>
</ol>
4. 原位 肿瘤的共聚焦成像
原位 共聚焦成像可实现对 HerDox 在肿瘤细胞水平蓄积的检测与分析。
<ol>
	<li>打开 Leica SPE 共聚焦显微镜。</li>
	<li>选择488 nm激光作为阿霉素的激发光源，并设置发射波长（560-620 nm）用于检测阿霉素荧光。</li>
	<li>选择40倍或63倍物镜，并在物镜镜头上滴加镜油。</li>
	<li>从经安乐死的小鼠中分离新鲜肿瘤组织，这些小鼠此前已接受过HerDox和模拟治疗，具体操作如实验步骤所述 2.</li>
	<li>将肿瘤置于冰上的培养皿中，以防止组织降解，随后将肿瘤转移至Delta T腔室进行共聚焦成像。</li>
	<li>以共聚焦显微镜沿z轴方向按顺序采集肿瘤在不同焦平面的图像（步长：1 μm，厚度：20 μm）。沿z轴依次采集的图像示例如下所示： 图3，左图.</li>
	<li>对图像进行最大强度Z投影。显示了Z堆栈图像的最大强度投影。 图3，右侧面板.</li>
	<li>计算平均荧光强度 最大强度Z-投影图像。 使用 ImageJ 计算整个视野内图像的平均荧光强度。</li>
</ol>
5. 比值光谱成像与分析
比率光谱成像与分析可区分阿霉素荧光与自发荧光。
<ol>
	<li>开启激光扫描荧光共聚焦显微镜。</li>
	<li>使用 Leica SPE 共聚焦显微镜，在 488 nm 激光激发下，于 510–650 nm 光谱范围内（步长为 10 nm）在指定深度获取经 HerDox 处理与未处理肿瘤的 15 幅图像。</li>
	<li>配制 100 μM 的阿霉素溶液。</li>
	<li>对 100 μM 阿霉素溶液进行光谱成像，以获得阿霉素荧光的纯光谱特征（光谱范围：510–650 nm，步长：10 nm）。光谱成像的典型图像采集结果及绘制的荧光光谱图如图 4所示。</li>
	<li>通过未处理肿瘤的光谱成像获取图像立方体数据（光谱范围：510–650 nm，步长：10 nm），从中提取自体荧光的光谱特征。光谱成像的典型图像采集结果及绘制的荧光光谱图如图 5所示。</li>
	<li>使用我们开发的程序9生成四个参考光谱特征（纯自体荧光、0.1 阿霉素 + 0.9 自体荧光、0.2 阿霉素 + 0.8 自体荧光、0.3 阿霉素 + 0.7 自体荧光）。显示四个参考光谱特征的典型曲线如图 6所示。</li>
	<li>利用我们先前开发的程序9，基于参考光谱特征通过欧几里得距离度量法对图像进行光谱分类。</li>
	<li>使用我们开发的光谱解混程序（ImageJ 插件）7, 10对这些图像进行线性光谱解混，以与比率型光谱成像及分析结果进行比较。通过线性光谱解混将 HerDox 荧光与自体荧光分离的示例如图 7所示。</li>
</ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
<li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+to+human+breast+cancer+cells+by+targeted+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3PO%2C+a+novel+non-viral+gene+delivery+system+using+engineered+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).</li>
<li>Rentsendorj, A., Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typical+and+atypical+trafficking+pathways+of+Ad5+penton+base+recombinant+protein%3A+implications+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer.</a> Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).</li>
<li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).</li>
<li>Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multimode+Optical+Imaging+System+for+Preclinical+Applications+In+Vivo%3A+Technology+Development%2C+Multiscale+Imaging%2C+and+Chemotherapy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment.</a> Mol. Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+spectral+imaging+for+fast+tumor+detection+and+chemotherapy+monitoring+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo.</a> J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).</li>
<li>Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujimoto%2C+JG+%22Biomedical+Optical+Imaging%22">Biomedical Optical Imaging</a>. , Oxford University Press. New York. (2009).</li>
<li>Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimode+optical+imaging+of+small+animals%3A+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Multimode optical imaging of small animals: development and applications.</a> Proc. of SPIE. 6411, (2007).</li>
<li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+unmixing%3A+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418(2009).</li>
<li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li>
</ol>

作者 Daniel Farkas 是 Spectral Molecular Imaging 的主席。其余作者无竞争利益。

当肿瘤位于皮下时，使用多模式成像仪可检测到阿霉素（Dox）的荧光信号。in vivo。然而，HerDox的治疗有效剂量（0.004 mg/kg）在单次给药后低于检测阈值。相比之下，连续注射7天（每天1次，共7次）后，纳米颗粒在肿瘤中的蓄积和滞留量足以实现Dox荧光的可视化。
在使用Dox或其他任何荧光染料时，这一点至关重要 在体 成像时应使用无菌技术。应避免小鼠体表出现液滴，因为成像仪会检测到皮肤表面的荧光，而无法区分多柔比星（Dox）是位于体外还是体内。同样，在操作动物过程中，若手套受到Dox污染，可能会在小鼠体表留下荧光痕迹，从而导致错误的荧光信号检测。
在多模态光学系统中，采用激光束激发 HerDox。激光束通常具有高斯光束轮廓。因此，为了实现对目标样本的均匀激发，需使用光学扩散片。然而，经扩散后的激光光仍部分保留高斯光束轮廓。因此，为了实现理想的定量分析，必须进行背景校正。校正前的图像与背景图像通常具有 16 位的深度。因此，在进行背景校正之前，应将图像深度转换为 32 位，以避...

化疗药物的肿瘤靶向递送有望以较低剂量杀灭癌细胞，相较于非靶向药物，更多的治疗药物可富集于目标部位，而非分布至非肿瘤组织。在后一种情况下，药物疗效会被稀释，因而需要更高剂量才能达到治疗效果。因此，肿瘤靶向递送相比传统的非靶向治疗具有治疗和安全性的双重优势。
通过将化疗药物包封在自组装纳米颗粒中实现靶向递送，可使药物保持化学结构不变，而与靶向分子共价连接的药物则无法做到这一点。由于共价连接可能改变药物和靶向分子的活性，而非共价组装方式则能够保留药物的原有药效。
我们先前已证明，这种新型三组分自组装复合物HerDox可靶向HER2+肿瘤 体内 并在保护正常组织（包括心脏）的同时，诱导肿瘤生长消融 1HerDox 是通过受体结合型穿膜蛋白 HerPBK10 与化疗药物阿霉素（Dox）之间经由一小段核酸连接子通过非共价相互作用形成的。HerPBK10 可结合人表皮生长因子受体（HER），并触发受体介导的内吞作用。 2-4，而内涵体膜穿透则通过整合腺病毒来源的五邻体基底衣壳蛋白实现 4-6蛋白质上的一个带正电荷的区域使其能够结合核酸 4, 5，通过该结构可实现DNA嵌插型阿霉素（Dox）的转运，用于靶向递送。亲电作用、嵌插作用及可能的蛋白质寡聚化相互作用促使自组装形成圆形、直径10–20 nm的纳米颗粒，该颗粒在血液中及不同温度下长期储存时均具有稳定性 1HER2 水平升高时，配体亲和力增强，从而促进对 HER2+ 肿瘤细胞的优先靶向。
我们之前的研究表明，与非靶向的阿霉素（Dox）相比，HerDox 的全身递送在肿瘤组织中的蓄积优于非肿瘤组织 1，以及穿透进入肿瘤细胞 体内 7我们观察到HerDox在进入肿瘤细胞后释放Dox，从而使Dox在细胞核内积累 1肿瘤蓄积量似乎与受体水平相关，HER2表达相对较低的肿瘤对HerDox的蓄积量少于HER2水平相对较高的肿瘤。 1此外，有效细胞死亡浓度与表达不同细胞表面HER2水平的肿瘤细胞系中HER2的表达量呈负相关。 1HerDox 相较于非靶向性阿霉素（Dox）具有更优的治疗效果与安全性，其在肿瘤杀伤作用中所需剂量较非靶向药物低十倍以上，且未观察到对心脏（通过超声心动图和组织学染色检测）或肝脏（通过TUNEL染色检测）组织产生可检测的不良影响，而未靶向的Dox则存在此类不良反应。 1尽管HerPBK10源自病毒衣壳蛋白，但在治疗剂量下未表现出可检测的免疫原性 2然而，针对完整腺病毒的预存抗体虽能识别HerPBK10，却无法阻止其与细胞结合 2.
随时间测量肿瘤体积是评估靶向治疗药物疗效的标准方法，已用于评估 HerDox 的治疗效果。通过以下方法对此方法进行补充： 体内 和 离体 荧光强度成像使我们能够更准确地评估靶向效率 7我们已特别整合 原位 通过多光谱分析阿霉素荧光对切除肿瘤进行共聚焦成像，以验证HerDox不仅在肿瘤部位富集 体内 但可穿透肿瘤细胞，将阿霉素递送至细胞质和细胞核 7光谱分析还使我们能够区分阿霉素荧光与自发荧光 7.
本文更详细地展示了我们在全身给药后对 HerDox 进行 in vivo 评估的方法，尤其是通过多模态成像技术和分析手段来评估靶向性的策略。

<table><tbody><tr><td>荧光激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SPE</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt;光学成像仪</td><td>光谱分子成像</td><td>多模态&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt;光学成像仪</td><td></td></tr><tr><td>盐酸阿霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>雌性裸鼠（NU/NU），6–8 周龄</td><td>查尔斯河实验室</td><td>品系编号 088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 人 HER2+ 肿瘤细胞</td><td>美国国家癌症研究所-弗雷德里克癌症治疗药物开发部肿瘤/细胞系库</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc 胰岛素注射器 U-100，配 29G × 1/2&quot; 超细 IV 固定针头</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Delta T 培养室</td><td>Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

靶向递送至her2阳性肿瘤的病毒蛋白纳米颗粒分析

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

HER2+ 肿瘤靶向纳米颗粒 HerDox 在 HER2+ 癌症动物模型中表现出对肿瘤的优先富集及肿瘤生长抑制作用。HerDox 通过肿瘤靶向性细胞穿透蛋白与化疗药物阿霉素经由一小段核酸连接子非共价自组装而成。多种相互作用，包括亲电作用、嵌插作用和寡聚化作用，共同促进其自组装形成直径为 10–20 nm 的球形颗粒。HerDox 在血液中以及在不同温度下的长期储存中均表现出良好的稳定性。在荷瘤小鼠中系统性给予 HerDox 可导致肿瘤细胞死亡，且对非肿瘤组织（包括心脏和肝脏）未见可检测的不良影响（而未靶向的阿霉素则会对这些组织造成明显损伤）。HER2 表达水平升高有助于靶向表达人表皮生长因子受体的细胞，因此，相较于 HER2 低表达的细胞，高表达 HER2 的肿瘤对 HerDox 的富集程度更高 体外 和 体内荧光强度成像结合 原位 共聚焦和光谱分析使我们能够验证 体内 系统给药后 HerDox 的肿瘤靶向性及肿瘤细胞穿透能力。本文详细描述了我们通过多模态成像评估系统给药后肿瘤靶向性的方法。

图1 显示 体内 光学成像仪原型，该原型机旨在实现多种成像模式下的图像采集，包括荧光强度、光谱、寿命、双光子、活体共聚焦及生物发光成像。此外，该系统集成了制冷型高灵敏度相机和高功率激光光源，相较于商用光学成像系统，可获得对比度更高的荧光图像 11，特别是对于 体内 检测阿霉素荧光。因此，该系统在本研究中至关重要，可用于获取多个互补数据点，以评估 HerDox 体内.
在全身给予 HerDox 后，图 2 中显示的高肿瘤荧光是典型的，表明其具有肿瘤偏好性靶向作用。在骨骼肌中检测到的荧光则不典型，可能是由于注射操作异常所致（例如 注射位置过于靠近身体）。从定性角度看，图 2a 所示图像的背景信号较低。然而，为了对相对组织荧光强度进行定量分析，有必要使用空白培养皿进行背景校正，如 图 2b 所示。这可能导致生成一张“背景校正后”的图像，如 图 2...

本文详细介绍了肿瘤靶向纳米颗粒HerDox的光学成像分析步骤。特别是，本文描述了如何使用多功能成像设备检测肿瘤靶向性以及评估肿瘤穿透能力的具体方法。

靶向递送至HER2阳性肿瘤的病毒蛋白纳米颗粒分析

靶向HER2+肿瘤的纳米颗粒HerDox在HER2+癌症动物模型中表现出对肿瘤的优先富集以及对肿瘤生长的抑制作用。

本实验的总体目标是利用多模式光学成像技术检测和分析靶向肿瘤的纳米颗粒HeroX在体内的系统性递送情况。首先，将纳米颗粒注射到荷瘤小鼠的尾静脉中，并使用多模式光学成像系统采集荧光图像。安乐死后，取出肿瘤组织和器官并再次成像，以检测肿瘤细胞内的荧光颗粒。随后进行原位共聚焦成像。对所得图像的分析表明，经全身给药后，其药物能够定量地靶向并穿透肿瘤。与现有单一成像模式等技术相比，多模态成像技术的优势在于可提供多种且互补的信息，从而增强对肿瘤递送效果的分析与定量评估。该方法有助于解答药物递送领域中的关键问题，例如靶向药物是否不仅能够递送至肿瘤，还能真正穿透进入肿瘤细胞。本方案由本实验室前博士后研究员 Dr.J Yun Wang 博士和现研究生 Janet Markman 演示。本实验所用小鼠为 6 至 8 周龄。使用新建立的双侧皮下 flank 异种移植瘤小鼠模型。为进行全身给药，将足量 HeroX 与无菌生理盐水混合，配制成每注射剂量为 0.2 毫升、含 HeroX 0.004 毫克/千克的溶液。用一支装有 29 号针头的 0.3 毫升胰岛素注射器，轻柔吸取 0.2 毫升 HeroX 混合液。麻醉后需注意确保无气泡残留。注射后，将全部混合物注入尾静脉。轻轻捏住尾部，以防止注射部位出血。出血停止后，用无菌棉签清洁注射部位，并将小鼠放回笼中。在同一只小鼠上连续六天重复注射。每天一次，至最后一次注射当天可检测到HeroX荧光在肿瘤中的累积。第七天，使用多功能成像仪。本实验步骤采用具备荧光强度、光谱荧光、荧光寿命以及活体共聚焦成像功能的光学成像系统。图中所示为活体光学成像仪的原型设备。该系统采用的冷却式高灵敏度相机和高功率激光线，相较于商用光学成像系统，可获得对比度更高的荧光图像，尤其适用于阿霉素荧光的活体检测。在软件中启动多模态活体光学成像仪。选择适合阿霉素荧光检测的发射带通滤光片。打开激光器，并在激光光路中放置激发带通滤光片。使用异氟烷在麻醉室中对小鼠进行麻醉后，将其转移至多模态活体光学成像系统的成像室中。将鼻罩罩住小鼠的鼻子，并打开气流以维持持续麻醉。进行图像采集时，使用5至15秒的曝光时间采集荧光图像。在最后一次注射后24小时，处死小鼠并采集其肿瘤及特定器官（包括肝脏、肾脏、脾脏、心脏和骨骼肌），可在这些组织中观察到Her doc的荧光信号。打开多功能活体光学成像仪。同前，将肿瘤和特定器官排列在培养皿中。在多功能活体光学成像仪的成像室内，使用5至15秒的曝光时间获取组织的荧光图像。随后，使用空的培养皿重复相同的成像过程，该图像将作为后续采集的背景。进行图像分析与处理，包括背景校正或对比度调整。原位共聚焦成像可实现对群体中肿瘤在细胞水平上的聚集情况进行检测与分析。使用共聚焦显微镜。选择488纳米激光作为阿霉素的激发光源，并选择560至620纳米的发射波长。检测阿霉素荧光时，选用40倍或63倍物镜，并在其上滴加一滴浸油。将安乐死小鼠的肿瘤组织置于培养皿中，以避免组织降解。然后将肿瘤转移至ΔT培养皿中进行共聚焦成像。使用1微米的步长和20微米的厚度，对肿瘤进行连续焦平面深度的共聚焦图像采集。此处展示了沿Z轴依次采集图像的示例。对图像生成最大强度Z投影。然后使用ImageJ或类似程序，计算最大强度Z投影图像在整个视野范围内的平均荧光强度比值。多光谱成像与分析可区分阿霉素荧光与自发荧光。使用激光扫描荧光共聚焦显微镜，在510至650纳米的光谱范围内，以10纳米为步长，激发光为488纳米，利用Leica SPE共聚焦显微镜获取经HeroX处理和未处理的肿瘤在特定深度下的15幅图像。接下来，用生理盐水配制100微摩尔的阿霉素溶液。对100微摩尔的阿霉素溶液进行光谱成像。为了获得阿霉素荧光的纯光谱特征，需通过成像未经处理的肿瘤获取图像立方体中的自发荧光光谱特征。在收集全部数据后，生成参考光谱特征，对图像进行光谱分类，并对这些图像执行线性光谱解混，以定量评估阿霉素在肿瘤中的蓄积情况。在不同焦平面原位获取共聚焦荧光图像，随后对图像进行最大强度Z轴投影，并测定投影图像的平均荧光强度。本图像中显示的高强度肿瘤荧光在系统给予her docs后具有典型性，表明其对肿瘤的靶向偏好性。在骨骼肌中检测到的荧光则属非典型现象，可能源于注射操作过程中的异常情况。从定性角度来看，该图像背景较低。对于定量分析，使用一个空培养皿进行背景校正，如图所示。校正后的图像在边缘处的背景信号高于原始图像，因为背景图像在边缘处的强度较低。左侧所示的堆叠图像代表了在连续一微米深度处获得的肿瘤组织共聚焦扫描结果。右侧图像展示了左侧堆叠图像的整合结果。该整合图像包含了在指定Z深度范围内每个像素点的HeroX累积信息，因此荧光强度的平均值定量反映了herd doc在不同深度肿瘤组织中的总体累积情况。为了区分阿霉素在肿瘤中的荧光与自发荧光，并利用高特异性比值指标对其进行定量鉴别，需进行光谱成像与分析。该图像显示了阿霉素的纯光谱特征。在指定的发射波长下，所划定的虚线区域的荧光强度生成了一张直方图，显示了阿霉素在510至650纳米波长范围内的光谱分布。此处展示了自体荧光的纯光谱特征。未经处理的肿瘤在指定发射波长下发出的荧光产生一条斜线，代表自体荧光的发射谱型。参考文献。通过混合不同比例的纯光谱特征，也生成了相应的光谱特征。利用该程序，我们建立了每一条参考光谱。此处的光谱特征表示肿瘤中积累的her docks相对于自发荧光的相对荧光强度。在获得泊物和自发荧光的光谱特征后，通过线性光谱解混分离泊物信号。该图显示了光谱解混前的自发荧光与靶向泊物混合图像，以及光谱解混后的靶向泊物分离图像。观看本视频后，您应能够充分理解如何结合荧光强度、共聚焦显微成像和光谱成像模式，以增强对肿瘤递送过程的分析与定量能力。请注意，使用阿霉素可能存在危险，因此在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴双层手套并频繁更换手套。

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科研

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生物工程

分析有针对性的病毒蛋白的纳米粒子递送HER2 +肿瘤

我们提出一种新方法，利用禽类胚胎模型中的动态实时活体成像，定量分析纳米颗粒在人源异种移植肿瘤血管系统中的定位。...

利用活体成像实时评估肿瘤中纳米颗粒的摄取

植物病毒纳米颗粒（VNPs）是生物医学应用中有前景的平台。本文介绍了植物VNPs的增殖、纯化、表征及生物偶联的操作步骤。最后，我们展示了利用小鼠异种移植模型和荧光成像技术，将VNPs应用于肿瘤靶向与成像的研究。...

病毒纳米颗粒用于 在体 肿瘤成像

本文描述了一种用于评估聚合物基因递送纳米颗粒的纳米颗粒追踪分析（NTA）和高通量流式细胞术的实验方案。NTA...

通过纳米颗粒追踪分析与高通量流式细胞术评估聚合物基因递送纳米颗粒

本文介绍了一种基于聚马来酸的纳米药物，旨在为适用于癌症的个体化药物合理设计提供范例。文中描述了用于治疗裸鼠体内Her2阳性人乳腺癌的纳米药物的合成方法。...

基于聚马来酸的纳米生物聚合物用于多重肿瘤标志物靶向：个性化医疗的新机遇？

本文介绍一种合成具有强磁矩和强近红外（NIR）吸收能力的磁等离子体纳米颗粒的实验方案。该方案还包括通过抗体的Fc片段将抗体偶联到纳米颗粒上，适用于需要分子特异性靶向的各种生物医学应用。...

免疫靶向磁-等离子体纳米簇的合成

病毒来源的肽段与抗体偶联物（ACs）相结合是一种日益受到关注的方法，因其具有增强分子载荷在肿瘤细胞内蓄积的潜力。本实验方案利用常规方法评估肽段偶联效率、抗体偶联物及其载荷在细胞内的积累情况以及肿瘤靶向性，可为研究人员在关键的早期研发阶段提供支持。...

利用病毒衍生肽修饰抗体偶联物的初步评估：提高细胞摄取与增强肿瘤靶向性

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。...

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

本文介绍了一种在小鼠肿瘤异种移植模型中研究抗体体内定位的实验方案。...

分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤及组织中的分布

本文旨在提供一种从三阴性乳腺癌同源小鼠模型中分离和培养原代癌症相关成纤维细胞的实验方案，并介绍其在针对肿瘤微环境的新型纳米颗粒临床前研究中的应用。...

从小鼠同源性乳腺癌模型中分离原代癌症相关成纤维细胞用于靶向纳米颗粒研究

本文描述了在动物模型中将携带RNA寡核苷酸的磁性氧化铁纳米颗粒递送至转移性乳腺癌的体内给药方案，为癌性核酸的治疗性沉默提供了一种具有临床可行性的方法。...

监测纳米药物在小鼠乳腺癌转移灶中的蓄积

血脑屏障是胶质母细胞瘤治疗药物递送的重大障碍，而该疾病目前尚无治愈手段。本文报道了一种体内成像引导的氧化铁治疗性纳米平台，该平台凭借其尺寸可绕过这一生理屏障，并在肿瘤部位富集。...

纳米颗粒递送寡核苷酸载荷在多形性胶质母细胞瘤动物模型中的应用

了解使用多模态光学成像技术检测HerDox纳米粒子在HER2阳性肿瘤中的靶向递送与穿透效果的方法。该技术为肿瘤靶向治疗研究提供了可靠的定量分析手段。

靶向递送至HER2阳性肿瘤的病毒蛋白纳米颗粒分析

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