在小鼠视网膜神经细胞，实现动态夹具与突触和人工电导

以下实验的总体目标是研究兴奋性和抑制性突触输入的比率和相对时间的变化对使用视网膜神经节细胞作为模型神经元的脉冲活性的影响。这是通过在整个安装视网膜中修补神经节细胞的细胞体来实现的，使用装满类似于生理离子组成的细胞内溶液的玻璃移液器和荧光黄来形态学识别细胞类型作为第二步使用动态夹，一组兴奋性和抑制性电导波形被注入细胞体， 从而产生膜电位的变化作为响应。接下来，将控制条件下或在药物存在下从生理实验中获得的各种电导波形注射到细胞体内，以获得相应的神经元反应。

结果表明，通过动态钳位记录注入由兴奋性和抑制性电导组成的电流，激发和抑制比的变化对视网膜神经节细胞尖峰活性的影响。与电流钳或电压钳等现有方法相比，该技术的主要优点是它提供了一种交互式工具，通过该工具可以将兴奋性和抑制性突触电导的比率和相对时间注射到神经元中，以研究对细胞反应的影响。这种方法可以深入了解视网膜回路以及中枢神经系统中任何其他神经元网络的功能。

通过在电生理设置中使用 250 毫升羧基含氧目标培养基设置再灌注系统来开始此过程。接下来，将一层薄薄的真空润滑脂均匀地涂抹在灌注室的底部。用盖玻片密封并确保其密封。

然后在腔室的顶端和底端涂上少量油脂。油脂会将网格固定到位并防止其对视网膜施加太重的压力。现在将腔室固定在平台上，然后对齐两个开口。

用 isof fluorine 麻醉后通过颈椎脱位处死动物。用一把小弯剪刀快速去除它的眼睛。在一个小烧杯中用汽车含氧细胞外液彻底清洗它们，然后将它们放入装满汽车含氧细胞外液的培养皿中。

在解剖显微镜下，使用 19 号针头在距双眼边缘约 2 毫米的角膜上打一个插入孔。这个重要的步骤应该很快允许两个 rein a 的氧合。之后，用一把小虹膜剪刀平行于其边缘切割，去除一个角膜。

接下来，用一对细镊子取出虹膜和晶状体，然后对另一只眼睛重复这些程序。将一个眼罩转移到装有 carbox 含氧细胞外溶液的烧杯中。用手术刀刀片将一个眼罩切成两半，使用钝器解剖探针或轻轻将其拉下，轻轻地将视网膜与色素上皮分离。

然后用一对细镊子将分离的视网膜组织的边缘靠近 Serta 光环，并用另一对细镊子抓住 Serta 光环。将其拉向视网膜中心。这是一个微妙的过程，可能需要几次尝试。

如果先兆成功，Serta 睫状体和玻璃体将被去除，视网膜的曲率将降低。接下来，修剪边缘，然后将视网膜转移到灌注室，神经节细胞朝上。将网格放在油脂球上，将纸巾固定到位。

将剩余的组织与另一个眼罩一起保存在 carbox 含氧细胞外溶液中，以备后用，将记录室安装在正置显微镜下。立即用 carbox 含氧细胞外溶液调整视网膜的持续灌注 在 35.5 摄氏度下以每分钟 3 到 5 毫升的速度，确保接地电极就位。现在打开显微镜的光源，通过 40 倍物镜将其焦点放在神经节细胞的细胞体上。

找到用于录制的孔架的中心。在此步骤中，将 5 到 8 兆欧姆的玻璃移液器固定在其支架中，并在 40 x 物镜下使用微米纵器将其移动到显微镜下。慢慢降低移液管，直到它在内限制膜的表面形成一个小酒窝。

小心地将移液器向前推进，直到它捕获少量组织，然后将其向上和/或侧向移动以撕开一个小孔，露出神经节细胞的细胞体。现在用 8 到 10 μL 的干净移液器填充，这是一种含荧光素黄的钾基细胞内溶液。将其插入连接到放大器头部载物台的支架中，并确保氯化氯化银电极浸没在水中。

选择具有较大单元体的单元。用正压缓慢降低移液器吸头，在膜表面形成一个小酒窝。然后停止并释放压力以获得千兆密封。

一旦实现千兆密封，轻轻施加负压以破坏膜，以实现全细胞膜片钳配置。这个过程是一个微妙的步骤。如果施加过多的负压，连接会泄漏。

如果太少，膜将保持完整。随着时间的推移，荧光素黄将充满细胞，如果稳定，则可以观察细胞的形态。此设置应持续 30 分钟或更长时间。

现在使用 Patch Master 进行从负 75 毫伏到每 10 毫伏正 35 毫伏的电流电压测试，然后继续进行后续测试。仅当存在大于 1 纳安培的钠电流时。接下来，打开实验室视图并执行自定义编写的 neuro acuma 程序。

将重复编号设置为 8。然后将兴奋性和抑制性电导的反转电位分别设置为零和负 75 毫伏。选择一对匹配的兴奋性和抑制性电导进行测试，绿色的兴奋性电导轨迹和红色的抑制性电导轨迹将出现在下图中。

之后，返回 patch master 并选择 current clamp 模式。在 neuro acuma 中，立即将放大器切换到电流钳模式。按下录制按钮。

动作电位失语爆发的细胞反应将出现在上面板上。然后将电流注入低电导的电池中。首先，如果观察到很少或没有响应，则以小增量增加电流，直到产生强响应。

过大的电流注入会杀死细胞。测试完成后。选择一对新的电导波形，并对所有生理电导和人工电导对重复这些过程。

记录后，小心地缩回移液器，使细胞体保持完整。之后，立即将组织和 4% 多联甲醛固定 30 分钟，然后用 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟，冷藏并在第二天或准备好后一周内进行抗体染色。在室温下用稀释度为 1 至 10， 000 的初级抗荧光素黄兔 IgG 对充满荧光素黄的神经节细胞染色 5 天。

然后在第 6 天，与次级山羊抗兔 IgG 一起过夜，加入 1 至 500 的稀释液，最后将视网膜湿涂在荧光保存培养基中。放置盖玻片并用指甲油密封。使用 Leica SPECT 双共聚焦显微镜拍摄细胞形态的共聚焦图像。

以下是神经节细胞对注射兴奋性和抑制性电导波形式的反应，这些波形式分别以绿色和红色表示。以下是河豚毒素浴后记录的对电导波形注射的反应。以下是另一个神经节细胞对各种电导波形臂的响应。

兴奋性电导和抑制电导之间的比率从 1 到 0 变为 1 到 2。随着抑制程度的增加，细胞的反应降低，以下是神经节细胞对抑制开始变化的相同兴奋水平的反应。Delta T 表示抑制性电导和兴奋性电导发作之间的时间差。

随着抑制延迟的减少，细胞的反应变得更弱。该程序是一种强大的技术，有助于揭示 exci 3 和产生神经元输出的抑制性突触输入之间的相互作用。