Name: 通过胎盘的外来物质和纳米材料的运输率测定体外人胎盘灌注型号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 了解离体人胎盘灌注模型如何用于研究纳米颗粒和异生物质跨胎盘转运。该方法利用双循环灌注系统直接在人胎盘组织中评估物质转运率，为发育毒理学提供可靠的临床相关数据。

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本工作由瑞士国家基金会（NRP 64 项目，资助号 4064-131232）提供资金支持。

1. 准备灌流系统
<ol>
	<li>设置灌注系统，包括水浴箱、灌注腔室、两个氧合柱、两个蠕动泵、两个气泡捕获器、两个流体加热器和一个压力传感器（图1）。根据图2所示示意图，使用硅胶和聚氯乙烯材质的管路将这些组件连接起来。最终形成分别代表胎儿和母体循环的两个回路。</li>
	<li>开启水浴箱、流体加热器以及灌注腔室的加热功能，温度应维持在37 °C。</li>
	<li>在水浴箱中预热灌注液（NCTC-135组织培养基用Earle's缓冲液按1:2稀释，Earle's缓冲液成分为：6.8 g/L氯化钠、0.4 g/L氯化钾、0.14 g/L磷酸二氢钠、0.2 g/L硫酸镁、0.2 g/L氯化钙、2 g/L葡萄糖），并补充以下成分：葡萄糖（1 g/L）、右旋糖酐40（10 g/L）、牛血清白蛋白（10 g/L）、肝素钠（2,500 IU/L）、阿莫西林（250 mg/L）和碳酸氢钠（2.2 g/L）；pH值为7.4。</li>
	<li>依次用以下溶液冲洗胎儿和母体回路的动脉系统：a) 200 ml蒸馏水，b) 50 ml 1%氢氧化钠溶液，c) 1%磷酸溶液，d) 再次使用200 ml蒸馏水（流速：15 - 20 ml/min）。</li>
	<li>将胎儿端套管（Ø 1.2 mm；钝针应连接至改良的带翼针头输液装置）与胎儿动脉管路连接。</li>
	<li>用灌注液冲洗胎儿和母体回路的动脉系统，直至所有管路中均充满灌注液（流速：15–20 ml/min）。在此过程中填充气泡捕获器，并清除捕获器下游的所有气泡，然后停止蠕动泵。必须确保动脉输入管路中始终无气泡；否则在插管后，尤其是细小的胎儿血管可能发生破裂。</li>
	<li>开启气体流量。母体回路使用含5%二氧化碳和95%合成空气的混合气体进行氧合，胎儿回路则使用含5%二氧化碳和95%氮气的混合气体进行氧合。</li>
	<li>启动压力传感器的数据记录。</li>
</ol>
2. 胎盘插管
<ol>
	<li>从无并发症的足月妊娠剖宫产术后获取完整的胎盘。产妇在分娩前须签署书面知情同意书（本研究已获得同意），且研究须经当地伦理委员会批准（本研究已获批准）。应由助产士首先进行肉眼检查，以确认胎盘健康且结构完整。</li>
	<li>胎盘插管是关键步骤！灌注过程中，任何微小的组织损伤都可能导致母体与胎儿循环之间的渗漏。胎盘必须在分娩后30分钟内获取。</li>
	<li>在胎盘边缘区域选择一个母体面无可见损伤的完整小叶。在绒毛膜板处，使用外科缝合线将与该小叶相关的脐动脉和脐静脉分支在靠近后续插管侧的上游方向（朝向脐带）结扎。每次结扎均需打两个结。</li>
	<li>首先对胎儿动脉进行插管。胎儿胎盘动脉通常比静脉更细、更薄。</li>
	<li>在胎儿动脉周围缝合一圈，但暂不打结。用镊子夹住血管，小心剪开血管，将细小插管（Ø 1.2 mm）插入动脉，然后打结固定（两个结）。</li>
	<li>以相同方式处理胎儿静脉，但使用较粗的插管（Ø 1.5–1.8 mm；钝针应连接至改良的带翼针输液装置）。</li>
	<li>启动胎儿循环泵（2 ml/min）。若无可见渗漏且血液从胎儿静脉插管端流出，可缓慢将流速增加至4 ml/min。监测胎儿动脉压力，不应超过70 mmHg。若在胎儿或母体插管处出现液体渗漏，应用额外缝线进行加固。</li>
	<li>将胎盘置于组织固定架上，胎儿面朝上，将胎盘膜和组织拉过固定架上的尖刺。最终，被灌注的小叶应位于组织固定架中央的孔洞中央。</li>
	<li>使用硅胶膜（Ø 1 mm）或两片Parafilm膜固定仅由膜组织支撑胎盘的部位。</li>
	<li>组装完整的组织固定架，拧紧螺丝，并剪除多余的组织。请注意，胎儿动静脉插管不应受压，而应置于组织固定架的小通道内。</li>
	<li>将组织固定架翻转，放入灌注腔室并盖上盖子。此时母体面应朝上。始终检查胎儿循环是否完整，灌注液是否从胎儿静脉管路正常流出。</li>
	<li>启动母体循环泵（12 ml/min）。通过穿透蜕膜板，将母体动脉管末端的三根钝头插管（Ø 0.8 mm）插入绒毛间隙。为将灌流液回输至母体循环，将一根导管作为静脉引流管，连接至母体泵，并置于灌注腔室上部的最低位置。</li>
	<li>将胎儿静脉插管连接至胎儿静脉管路。</li>
</ol>
3. 执行灌注的预实验阶段和实验阶段
<ol>
	<li>为使胎盘组织在分娩后从缺血状态中恢复，并清除绒毛间隙中的血液，需进行20分钟的开放预灌注阶段。在此期间，母体和胎儿静脉不回流至含有灌注液的动脉储液器中。将胎儿和母体静脉流出液收集于瓶中，并在预灌注阶段结束后弃去。</li>
	<li>为评估灌注系统的完整性，进行另一段20分钟的闭合回路预灌注。在胎儿和母体回路中分别使用两个独立的灌注液储液器，并将胎儿静脉流出液回流至胎儿储液器，母体静脉流出液回流至母体储液器，形成闭合回路。</li>
	<li>在正式灌注实验前，准备两个各含120 ml灌注液的烧瓶（分别用于母体和胎儿回路）。向母体储液器中加入放射性标记的14C-安替比林（4 nCi/ml；作为阳性对照；注意：放射性物质）以及待分析的荧光标记外源性物质或纳米颗粒。充分混匀母体灌注液。</li>
	<li>通过将纯灌注液替换为上述准备好的两个烧瓶中的液体（胎儿和母体储液器），开始实验。将胎儿静脉流出液回流至胎儿储液器，母体静脉流出液回流至母体储液器，关闭回路。</li>
	<li>继续灌注6小时，并定期采集样本。每次取样前均需充分混悬胎儿和母体储液器中的灌注液。</li>
	<li>在灌注过程中监测胎儿动脉压力（不应超过70 mmHg）、两个回路的pH值（应维持在生理范围7.2–7.4）以及两个储液器的体积（胎儿侧体积损失不应超过4 ml/hr）。必要时使用盐酸或氢氧化钠调节pH值。</li>
	<li>若胎儿储液器的体积损失超过4 ml/hr，则提示组织存在渗漏，需终止灌注。6小时无渗漏灌注的成功率约为15–20%。</li>
	<li>6小时后停止灌注。关闭泵、水浴、流路加热器和气体流量。</li>
	<li>从组织固定器中取出胎盘，切下已灌注的胎叶（颜色较未灌注组织更亮），并称重。</li>
	<li>从未灌注组织（初始切除的部分；可在预灌注阶段采集）和灌注组织中各取样约1 g，置于-20 °C保存直至匀浆，或存于液氮中以备后续分析。另取一份组织样本用4%甲醛固定，用于组织病理学评估。取样应包含胎盘的所有层次。</li>
	<li>灌注结束后依次用以下液体冲洗胎儿和母体动脉系统以清洁管路：a) 200 ml蒸馏水，b) 50 ml 1%氢氧化钠，c) 50 ml 1%磷酸，d) 再次用200 ml蒸馏水冲洗（流速：15–20 ml/min）。</li>
</ol>
胎盘灌注实验的整个操作流程如图3所示。
4. 样品分析
<ol>
	<li>分析前将灌注液样本在800 × g条件下离心10分钟，以去除残留的红细胞。取上清液用于进一步分析。样本可在4 °C下保存过夜。如需分析瘦素（leptin）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）的生成，样本可于-20 °C保存。</li>
	<li>为评估胎盘通透性，采用液体闪烁法分析14C-安替比林。将300 μl的胎儿和母体样本与3 ml闪烁液混合，在β计数器中测量5分钟。</li>
	<li>为评估荧光纳米颗粒或目标外源性物质的转运，使用酶标仪在485 nm激发波长和528 nm发射波长下读取荧光信号（所指示的波长适用于我们所用纳米颗粒的黄绿色标记物分析）。</li>
	<li>为确定灌注期间胎盘组织的活性，使用全自动血气分析系统检测胎儿和母体循环中的葡萄糖消耗量和乳酸生成量。此外，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测匀浆组织样本及灌注液中胎盘激素人绒毛膜促性腺激素（hCG）和瘦素（leptin）的生成水平。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

在本文展示的双循环灌注方法之外，还可根据具体研究问题采用其他多种实验设计。特别是开放式胎盘灌注，常用于评估药物在稳态浓度下的清除率3。循环灌注系统也可用于验证内源性或外源性物质是否存在主动转运。在此方法中，需将相同浓度的外源性物质同时加入母体和胎儿循环系统。若存在逆浓度梯度的主动转运，则可能观察到待测物质在其中一个循环系统中的积累现象24。值得注意的是，仅向胎儿循环系统添加待测物质也是可行的，该方法有助于揭示该特定物质穿越胎盘屏障的转运机制25。
该方案随着时间的推移不断发展，不同研究团队之间在灌注流速、灌注液组成、氧合方式和加热条件等方面可能存在差异26,27。尤其是流速可能影响物质经胎盘转运发生的时间点。为控制这一变量，加入一种被动转运的参考化合物（如安替比林）至关重要。待测外源性物质的转运速率可始终与安替比林的转运速率进行比较（F/M比值应高于0.75）26。由于安替比林的转运主要受限于灌注流速和交换表面积，因此该比较可校正实验间灌注流速及灌注叶大小的差异。此外，可在...

胎盘是一种复杂的器官，负责氧气、二氧化碳、营养物质和代谢废物的交换，同时能够使母体和胎儿的两个血液循环系统相互分离。此外，胎盘还能防止母体免疫系统对胎儿的排斥反应，并分泌激素以维持妊娠。细胞屏障由细胞滋养层细胞构成，这些细胞融合后形成真正的合胞体，其特点是不存在侧向细胞膜4,5。整个胎盘由多个胎盘小叶组成，每个小叶包含一棵胎儿绒毛树，代表胎盘的一个功能单位。
20世纪60年代发现沙利度胺可导致胎儿畸形后，对胎盘屏障功能的研究进一步加强。由于显而易见的原因，无法对孕妇开展物质转运研究。因此，人们已开发出多种替代模型6,7。其中最有前景且可能最具临床相关性的模型是Panigel及其同事建立的ex vivo人胎盘灌注模型2,3。
许多女性在怀孕期间会接触到各种外源性物质，例如药物或环境污染物8。对于某些在孕期已常规使用的药物，可通过比较母体血液与脐带血中的药物浓度来进行体内研究。然而，目前关于这些物质在胎儿体内的药代动力学和药效学特性及其致畸性的信息通常十分有限。
例如，像海洛因这样的阿片类药物容易穿过胎盘屏障，可能导致胎儿宫内发育受限、早产或自然流产 9,10因此，若在妊娠期间未能做到禁欲，则建议采用美沙酮替代治疗。 离体 人胎盘灌注模型显示，美沙酮向胎儿血液循环的转移可忽略不计 11，这与分娩后计算的脐带血与母体血浓度比值高度相关 12.
纳米技术是一个不断发展的领域，尤其在医学方面。除了森林火灾、火山喷发和沙漠尘埃中自然产生的细颗粒物（直径&lt; 2.5 μm）和超细颗粒物（直径&lt; 0.1 μm）外，人类接触工程纳米材料（至少一个维度&lt; 0.1 μm13）的情况也在增加。这引发了关于工程纳米材料毒理学潜力的疑问。尽管目前尚未证实其对人类健康存在明确危害，但已有基础实验研究表明，工程纳米颗粒可引发不良的生物学反应，导致毒理学后果14。最近一些研究指出，产前暴露于空气污染与新生儿及儿童呼吸需求增加和气道炎症之间存在关联15,16。此外，小型纳米颗粒可能被用作药物载体，以特异性治疗胎儿或母体。因此，显然有必要对不同的外源性物质或纳米材料及其穿越胎盘屏障的能力开展广泛研究。关于当前工程纳米材料胎盘通透性研究的最新综述可参见 Menezes et al. 201117 和 Buerki-Thurnherr et al. 20127。
的 离体 双循环人胎盘灌注模型为研究胎盘对各种内源性和外源性物质的转运提供了可控且可靠的系统 3,11,12,18,19 以及胎盘的多种其他功能，例如导致子痫前期等病理状态发生的机制 20-22本方案主要关注用于研究多种外源性物质或纳米颗粒的积累、效应及转运速率的实验设置、操作方法与技术流程。

<table><tbody><tr><td>NCTC-135 培养基</td><td>ICN Biomedicals, Inc.</td><td>10-911-22C</td><td>可用 Sigma 的 Medium 199（M3769）替代</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich, Fluka</td><td>71381</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>医院药房</td><td></td><td>也可使用 Sigma（P9541）</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;#183; H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;#183; H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich, Fluka</td><td>63139</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl，无水）</td><td>Merck</td><td>102388</td><td></td></tr><tr><td>D(+)葡萄糖（无水）</td><td>Sigma-Aldrich, Fluka</td><td>49138</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>右旋糖酐（来自 Leuconostoc spp.）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>阿莫西林（Clamoxyl）</td><td>GlaxoSmithKline AG</td><td>2021101A</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>3511014</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）颗粒</td><td>Merck</td><td>106498</td><td>注意：具有腐蚀性</td></tr><tr><td>85% 正磷酸（H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td>100573</td><td>注意：具有腐蚀性</td></tr><tr><td>母体气体混合物：95% 合成空气，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>PanGas AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎儿气体混合物：95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>PanGas AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>安替比林（N-甲基-&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C）</td><td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td><td>ARC 0108-50 &amp;#956;Ci</td><td>注意：放射性物质（比活度：55 mCi/mmol）</td></tr><tr><td>闪烁液（IrgaSafe Plus）</td><td>Zinsser Analytic GmbH</td><td>1003100</td><td></td></tr><tr><td>80 nm 聚苯乙烯微粒</td><td>Polyscience, Inc.</td><td>17150</td><td></td></tr><tr><td>500 nm 聚苯乙烯微粒</td><td>Polyscience, Inc.</td><td>17152</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td>462-7001</td><td></td></tr><tr><td>恒温器</td><td>IKA-Werke GmbH & Co. KG</td><td>3164000</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Ismatec</td><td>ISM 833</td><td></td></tr><tr><td>气泡捕集器（玻璃）</td><td>UNI-GLAS Laborbedarf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流体加热器</td><td>UNI-GLAS Laborbedarf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>压力传感器 + 分析软件</td><td>MSR Electronics GmbH</td><td>145B5</td><td></td></tr><tr><td>笔记本电脑</td><td>Hewlett Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型气体交换氧合器</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>LSI-OXR</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管（内径：1.6 mm；外径：4.8 mm）</td><td>Ismatec</td><td>MF0028</td><td></td></tr><tr><td>泵用管（PharMed BPT；内径：1.52 mm）</td><td>Ismatec</td><td>SC0744</td><td></td></tr><tr><td>钝头套管（0.8 mm）</td><td>Polymed Medical Center</td><td>03.592.81</td><td></td></tr><tr><td>钝头套管（1.2 mm）</td><td>Polymed Medical Center</td><td>03.592.90</td><td></td></tr><tr><td>钝头套管（1.5 mm）</td><td>Polymed Medical Center</td><td>03.592.94</td><td></td></tr><tr><td>钝头套管（1.8 mm）</td><td>Polymed Medical Center</td><td>03.952.82</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>VWR</td><td>291-1212</td><td></td></tr><tr><td>带组织固定装置的灌流室（有机玻璃）</td><td>内部技术部门</td><td></td><td>类似设备可从英国 Hemotek Limited 获得</td></tr><tr><td>外科缝合材料（PremiCron）</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>C0026005</td><td></td></tr><tr><td>带翼针输液套件（21G 蝴蝶针）</td><td>Hospira, Inc.</td><td>ASN 2102</td><td></td></tr><tr><td>多向停流阀（Discofix C-3）</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>外科剪刀</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>BC304R</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>BC162R</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>BM200R</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>BD215R</td><td></td></tr><tr><td>全自动血气分析系统</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td>ABL800 FLEX</td><td></td></tr><tr><td>多功能微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁分析仪</td><td>GMI, Inc.</td><td>Packard Tri-Carb 2200</td><td></td></tr><tr><td>5.5 ml 闪烁管</td><td>Zinsser Analytic GmbH</td><td>3020001</td><td></td></tr><tr><td>组织匀浆器</td><td>OMNI, Inc.</td><td>TH-220</td><td></td></tr><tr><td>pH 计 + 电极</td><td>VWR</td><td>662-2779</td><td></td></tr></tbody></table>

利用胎盘评估外源性物质和纳米材料转运速率的方法 离体 人胎盘灌注模型

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

几十年前，人类胎盘曾被认为是在母亲与胎儿之间不可逾越的屏障。然而，沙利度胺导致出生缺陷的发现以及随后的大量研究证实了相反的结果。如今，已有多种有害外源性物质被证实能够穿越这一屏障，包括尼古丁、海洛因、美沙酮等药物以及环境污染物。随着纳米技术的广泛应用，胎盘可能因意外暴露或潜在的纳米医学应用而与新型纳米颗粒发生接触。由于胎盘是哺乳动物中物种特异性最强的器官，来自动物实验的数据无法外推至人类。 1因此， 离体 双循环人胎盘灌注，由 Panigel 建立 等 1967年 2 并由施耐德持续改进 等 1972年 3可作为研究异源物质或颗粒转移的优良模型。
本文重点介绍ex vivo人胎盘双循环灌注实验方案及其进一步优化，以获得可重复的实验结果。
胎盘样本取自签署知情同意书的健康足月妊娠产妇，这些产妇接受了剖宫产手术。对完整小叶的胎儿和母体血管进行插管，并至少持续灌注五小时。作为模型颗粒，将直径为80 nm和500 nm的荧光标记聚苯乙烯颗粒加入母体循环系统。80 nm的颗粒能够穿过胎盘屏障，是可经胎盘转运至胎儿体内物质的典型范例；而500 nm的颗粒则被滞留在胎盘组织或母体循环中。ex vivo 人胎盘灌注模型是少数能够提供有关异源物质在重要组织屏障——胎盘——中转运行为可靠信息的模型之一，可获得具有预测性和临床相关性的数据。

图4A展示了小粒径聚苯乙烯颗粒（80 nm）的灌注曲线，这些颗粒可穿过胎盘，而较大粒径的聚苯乙烯颗粒（500 nm）则未被转运至胎儿腔室。每个数据点代表至少3次独立实验中在指定时间点的平均颗粒浓度。聚苯乙烯纳米颗粒的胎盘转运具有尺寸依赖性19。在胎盘灌注3小时后，已有20–30%初始加入的80 nm聚苯乙烯颗粒从母体循环转移至胎儿循环，而500 nm的聚苯乙烯颗粒即使在灌注6小时后仍未出现在胎儿循环中。然而，母体侧500 nm颗粒的浓度有所下降。灌注后组织切片的荧光成像显示，这些颗粒在胎盘绒毛中积聚（数据未显示）。图4B展示了放射性标记的14C-安替比林的典型灌注曲线。安替比林作为一种小分子脂溶性物质，可通过被动扩散穿过胎盘屏障，常被用作评估循环系统完整性的对照。在灌注4–6小时后，胎儿与母体之间的安替比林浓度应达到平衡23。为了评估和比较外源性物质的胎盘转运速率，通常以胎儿与母体药物浓度比值（F/M比值）来表示（图5）。
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该 离体 双循环人胎盘灌注模型可用于研究异源物质和纳米颗粒在人胎盘中的转运。在本视频方案中，我们描述了成功实施胎盘灌注所需的设备与技术。

几十年前，人类胎盘被认为是在母亲与胎儿之间不可穿透的屏障。然而，沙利度胺致畸事件的发现……

本实验的总体目标是利用离体人胎盘灌注模型，研究纳米颗粒或外源性物质通过胎盘的转运过程。该目标通过以下步骤实现：首先在胎盘娩出后立即插管其一条胎儿动脉和一条胎儿静脉；第二步，将胎盘固定于灌注腔室中。随后将钝性套管插入母体侧的绒毛间隙，并安装一根单管以回输静脉流出液。接下来，整个系统用灌注液进行开放式循环冲洗，以清除残留血液，并使组织从分娩后的缺血阶段恢复。最后，将两个循环回路封闭，并将荧光标记的纳米颗粒或感兴趣的外源性物质加入母体循环中。最终，可通过检测荧光强度，分析灌注六小时内获取的胎儿和母体循环样本中目标纳米颗粒或外源性物质的浓度。该技术相较于动物实验或细胞培养模型等现有方法的主要优势在于，胎盘转运研究可在完整器官上直接利用人体组织进行，这一点尤为重要，因为不同物种间胎盘组织的解剖结构差异显著。在建立灌注系统后，该系统包括水浴箱、灌注腔室、两个氧合柱、两个蠕动泵、两个气泡捕获器、两个流体加热器和一个压力传感器。按照此方案，使用聚氯乙烯管段连接这些组件。然后打开水浴箱、流路加热器以及灌注室的加热装置。当灌注液依次在水浴中预热后，以每分钟15至20毫升的流速冲洗胎儿和母体循环的动脉系统。然后将胎儿套管连接至胎儿动脉管路，并用预热的灌注液冲洗胎儿和母体回路的动脉系统，直至所有管路充满灌注液。在管路充液过程中，填充气泡捕集器，清除捕集器下游的所有气泡，随后停止泵的运行。现在打开气体流量，开始记录压力传感器数据。胎盘插管是灌注过程中的关键步骤。组织中任何微小的损伤都可能导致母体与胎儿循环之间发生渗漏。因此，在获取无并发症足月妊娠的完整胎盘后，需谨慎操作。在初次剖宫产后，于胎盘母体面边缘区域选择一个无明显破裂的完整绒毛膜小叶。在胎儿面找到同一绒毛膜小叶。在绒毛膜板处，结扎供应该绒毛膜小叶的脐动脉和脐静脉的两个分支，结扎位置应位于后续插管部位的上游。首先在胎盘绒毛膜板处的胎儿动脉周围放置缝线，然后用镊子夹住血管，小心剪开动脉，并将细小的导管插入动脉中。使用较大的套管针将缝线打两个结。以相同方式处理脐静脉。然后启动胎儿泵，并缓慢将流速增加至每分钟4毫升。血液应从胎儿静脉插管中流出，且胎儿动脉内的压力不应超过70毫米汞柱。接下来，将胎盘置于组织固定架上，胎儿面朝上，并将胎盘膜和组织拉过固定架上的尖刺。灌注的脐带结缔组织应位于组织固定架孔洞的中央。然后使用硅胶膜固定组织，使只有膜支撑胎盘。现在组装完整的组织固定装置。务必确保静脉和动脉插管未被夹住，而是平放在组织固定装置的小通道内。然后拧紧螺丝，并修剪任何突出的组织。胎盘组织固定器现在已完全组装完毕。接着将组织固定器倒置。将其放入灌注室中，并盖上室盖。确认胎儿循环仍然完整，且培养基正从胎儿静脉管路中流出。现在启动母体泵。然后将母体动脉管末端的三根钝头套管穿过蜕膜层，插入绒毛间隙。为使灌注液八返回母体循环，将连接母体泵的管子置于

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利用胎盘评估外源性物质和纳米材料转运速率的方法离体人胎盘灌注模型

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