Name: 从脐带血分离的前体B细胞亚群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: 学习从脐带血分离前体B细胞亚群的方法，使用密度梯度离心、磁珠分选和流式细胞术。该技术可高效获取高质量核酸，用于下游DNA和RNA分析，为免疫发育研究提供可靠工具。

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本研究由美国国立卫生研究院（NCI R00 CA132784）资助，授予 K.T.。

1. 从脐带血中分离单个核细胞
<ol>
 <li>配制 EDTA-PBS 缓冲液——将 5 ml 牛血清白蛋白（BSA）储备液加入 95 ml 洗涤缓冲液中（1:20 稀释）。对缓冲液进行脱气处理，并置于冰上保存。重要提示： 若未对缓冲液进行脱气，可能导致 CD19+ B 细胞分离效果不理想，因为气泡可能堵塞分离柱。</li>
 <li>准备用于密度梯度离心的 50 ml 圆锥形离心管。根据需处理的脐带血量确定所需离心管数量（每管可处理 8 ml 血液），并向每根管中加入 15 ml Ficoll-Paque PLUS。</li>
 <li>用 24 ml DPBS（1X）稀释 8 ml 脐带血，并小心地将稀释后的脐带血混合物缓慢铺加到每根 50 ml 圆锥形离心管中的 Ficoll-Paque PLUS 液面上方。切勿混匀血液与 Ficoll-Paque PLUS。重要提示： 为避免脐带血与 Ficoll-Paque PLUS 混合，应将离心管倾斜约 45 度角，并缓慢铺加血液混合物。</li>
 <li>在 20 °C 条件下以 400 × g 离心 40 分钟。单个核细胞（MNC）将保留在血浆与 Ficoll-Paque PLUS 的界面处，而粒细胞和红细胞因密度较高，在 Ficoll-Paque PLUS 的渗透压作用下发生沉降。准备七支 5 ml 圆底离心管，用于第三部分实验，并标记样本编号、日期及以下信息：</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>试管</td>
 <td>标签</td>
 <td>用途</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>未染色</td>
 <td>用于流式细胞术中归一化处理的未染色细胞</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>7AAD</td>
 <td>用于流式细胞术中确定细胞活力</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>+++</td>
 <td>包含将被分选的细胞</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>34+ </td>
 <td>用于收集 CD34+/CD19+（晚期原B-早期前B I）细胞</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>45low</td>
 <td>用于收集 CD34-/CD19+/CD45low（前B I）细胞</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>45med </td>
 <td>用于收集 CD34-/CD19+/CD45med（前B II）细胞</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>45high</td>
 <td>用于收集 CD34-/CD19+/ CD45high（未成熟B）细胞</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
用2% FBS包被4、5、6和7号管，并将所有管置于冰上。
<ol start="5">
 <li>小心吸走上层血浆层，避免接触单个核细胞层。使用10 ml玻璃移液管，将单个核细胞层小心转移至新的50 ml锥形管中。将三个管中的单个核细胞合并至同一个50 ml管中。</li>
 <li>用PBS填充管子，轻轻混匀，于20 °C下以300 × g离心10分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。重复一次。第一次洗涤后，重悬沉淀，并转移至一个50 ml锥形管中。</li>
 <li>用200 μl PBS轻轻重悬细胞沉淀。取1 μl细胞悬液加入含有1 ml PBS的1.5 ml微量离心管中，留作计数用（在将50 ml细胞悬液放入离心机后进行细胞计数）。用PBS充满管子，于200 × g离心15分钟以去除血小板。完全移除上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
</ol>
2. 使用磁珠分选法从单个核细胞中改良分离B细胞
<ol>
 <li>用160 μl冷（4 °C）EDTA-PBS缓冲液重悬第1.7步所得沉淀。</li>
 <li>加入40 μl B-CLL生物素化抗体混合液，用移液器充分混匀，于4 °C孵育10分钟。</li>
 <li>洗涤细胞——每1000万个细胞（细胞数量由第1.7步确定）加入1 ml冷（4 °C）EDTA-PBS缓冲液，300 × g离心10分钟。彻底吸除上清液，然后将细胞沉淀重悬于320 μl冷（4 °C）EDTA-PBS缓冲液中。</li>
 <li>加入80 μl抗生物素MicroBeads，充分混匀，于4 °C孵育15分钟。</li>
 <li>洗涤细胞——每1000万个细胞加入1 ml冷（4 °C）EDTA-PBS缓冲液，300 × g离心10分钟。将最多1亿个细胞重悬于500 μl冷（4 °C）EDTA-PBS缓冲液中。根据细胞数量按比例调整缓冲液体积。</li>
 <li>在离心过程中（第2.5步）准备MACS柱和MACS分选器。将LS柱置于MACS分选器的磁场中，向柱上加入3 ml冷（4 °C）EDTA-PBS缓冲液，使缓冲液自然流过柱体。使用容器收集流出液，并弃去。</li>
 <li>在柱下方放置一个50 ml锥形管，将细胞悬液用移液器加至柱上。让未标记的细胞流过柱体并进入50 ml锥形管中。重要提示：这些细胞将用于后续抗体标记和细胞分选，请勿丢弃流出液。为回收第2.5步中的全部细胞，向锥形管壁加入额外1 ml冷（4 °C）EDTA-PBS缓冲液，轻轻混匀后将剩余细胞悬液再次加至柱上。重复此步骤一次。后续操作使用流经柱体后收集于锥形管中的未标记细胞进行第2.8步。</li>
 <li>用PBS填充含有未标记细胞的锥形管，300 × g离心10分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。加入200 μl EDTA-PBS缓冲液，轻轻重悬细胞。</li>
</ol>
3. 抗体标记及细胞分选前准备
<ol>
 <li>吸取1 μl细胞悬液，加入标记为“未染色”的离心管中（步骤1.4）。加入500 μl EDTA-PBS缓冲液，将试管置于冰上保存。</li>
 <li>每百万个细胞加入20 μl各抗体（CD19、CD34和CD45）至剩余的细胞悬液中。充分混匀后，将试管置于避光条件下，室温孵育30分钟。CD抗体对光敏感，完成步骤2-4时需关闭光源。</li>
 <li>抗体孵育30分钟后，吸取40 μl细胞悬液转移至标记为“7AAD”的试管中。向该管加入1 ml PBS，以500 × g离心2分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 μl结合缓冲液中。加入7 μl 7AAD（7-氨基放线菌素D），避光孵育10分钟，室温条件下进行。在10分钟孵育期间完成步骤3.4。</li>
 <li>向标记有CD抗体的剩余细胞所在的试管中加入PBS至满。以500 × g离心3分钟。弃去上清液，加入500 μl EDTA-PBS缓冲液并重悬细胞沉淀。将细胞悬液全部转移至标记为“+++”的试管中。为回收全部细胞悬液，向原50 ml锥形管中再加入1 ml EDTA-PBS缓冲液，并转移至标记为“+++”的试管中。</li>
 <li>孵育结束后（步骤3.3），向7AAD试管中加入300 μl结合缓冲液。“未染色”、“7AAD”和“+++”样品，以及标记为“34+”、“45low”、“45med”和“45high”的试管，均可用于流式细胞术检测。</li>
</ol>
4. 使用 MoFlo XDP 流式细胞仪进行细胞分选
<ol>
 <li>设置 MoFlo 进行分选：校准激光器；稳定液滴流；确定液滴延迟时间。</li>
 <li>根据制造商说明书，使用 Invitrogen AbC Mouse bead 试剂盒（或类似产品）制备单色补偿对照样本。运行单色对照样本，调整各荧光通道电压，以实现阳性和阴性细胞群的最佳分离。设定补偿系数，并将补偿后的参数应用于采集方案。每次获得新批次抗体时，均需重新建立补偿系数。</li>
 <li>创建包含如图2所示图谱的实验方案。</li>
 <li>运行未染色样本，设定前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）的电压与增益，并识别阴性荧光群体。由于分选目标为DNA回收，阈值应设得较低（≤1%），以避免含DNA的碎片污染回收样本。*在 MoFlo 上处理活体人源细胞期间，必须始终开启气溶胶抽吸系统。</li>
 <li>运行少量 +++ 样本（约 50,000 个事件），以确定设门策略（图2）。由于B细胞前体与成熟B细胞的散射特性不同，需将未设门的 CD19+/CD34+ 群体反向设门至 SSC 与 FSC 图谱上，以确保淋巴细胞门包含潜在的前B细胞（Pro-B细胞）。同时，利用该样本设定 7AAD 的阴性荧光群体。</li>
 <li>运行 7AAD 染色样本以评估细胞活力。仅对初始活力高（≥95%）的样本进行分选，因为死细胞会非特异性染色，可能污染分选所得细胞群。</li>
 <li>设定分选决策，以收集四个细胞群：CD19+/CD34+；CD19+/CD34-/CD45low；CD19+/CD34-/CD45med；以及 CD19+/CD34-/CD45high。所有细胞群的分选决策中均需包含淋巴细胞门及双联体排除门。</li>
 <li>为防止分选喷嘴堵塞，在分选前立即通过 40 μm 细胞滤网过滤 +++ 样本；若分选过程中样本出现聚集，需重新过滤。</li>
 <li>将细胞分选至已用含 2% FBS 的 PBS 预包被的收集管（步骤 1.4）中，并置于冷却或加冰的管架内。</li>
 <li>分选完成后立即提取 DNA。</li>
</ol>

<ol><li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+%28TDMs%29+with+differential+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li>
<li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li>
<li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li>
<li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li>
<li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li>
<li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li>
<li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Are cord blood B cells functionally mature?</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li>
<li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li>
<li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li>
<li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li>
<li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li>
<li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).</li>
<li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+human+B-cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li>
<li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li>
<li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+immature%2Ftransitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease%3A+correlation+with+increased+IL-7%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

影响本方案成功与否的最关键因素是是否存在污染性杂质。若从脐带血库申请血液样本，应确保血液在采集后尽快运输。此外，被归类为淋巴细胞增多的样本含有较多的淋巴细胞；然而，这些样本中前体B细胞的数量不足，不应使用。为提高获得足够数量各前体亚群细胞的概率，我们建议起始脐带血量至少为85 ml。
需要注意的是，与成人外周血分离不同，在分离脐带血时，单个核细胞层常常被红细胞污染12。本方案包含一个额外的洗涤步骤，以去除污染的血小板。现有描述从脐带血中分离单个核细胞的方案常建议加入红细胞裂解步骤以去除不需要的红细胞。但我们不推荐此步骤，因为它会产生细胞碎片污染，并对细胞分选的成功率产生不利影响。
为了减少流式细胞术中需要区分的细胞数量，在细胞分选前必须进行B细胞富集。Miltenyi Biotec公司提供的B细胞分离试剂盒（B-CLL）配套方案已针对外周血优化，推荐每1000万个细胞使用10 μl B-CLL生物素标记抗体混合物。该步骤使用针对CD2（T细胞；NK细胞）、CD4（T细胞）、CD11b（粒细胞；单核细胞；巨噬细胞）、CD16（NK细胞；巨噬细胞；肥大细胞）、CD36（血小板）和CD235a（红系细胞）的抗体，以去除脐带血中的非B细胞。必须使用所述试剂盒，而非B细胞分离试剂盒II，因为前者含有针对原B细胞表面表达的CD43的抗体。在本方案优化过程中，我们发现总共使用40 μl B-CLL生物素标记抗体混合物足以获得良好的阳性细胞分选结果。此外，我们发现若B-CLL生物素标记抗体混合物用量仅增加5 μl，即会对细胞分选产生不利影响。因此，我们强烈推荐在单个核细胞总数为1.75亿至2.5亿时使用40 μl B-CLL生物素标记抗体混合物。若起始细胞数量较低或较高，可能需要相应调整试剂用量。
关于可用于区分B细胞亚群的标志物，目前存在大量相互矛盾的文献报道。这些差异大多可归因于一个事实：B细胞分化是一个持续进行的过程，细胞表面标志物的出现或消失是以渐进方式发生的，而非全或无的方式。在本实验方案中，采用CD34-/CD19+以及CD45+表达强度（低、中、高）来区分pre-BI、pre-BII和未成熟B细胞，其中CD45表达水平的升高对应于分化进程的推进6。某些研究将原B细胞（pro-B细胞）定义为CD19+/CD34+ 13，而另一些研究则表明原B细胞为CD19-/CD34+，而pre-BI细胞为CD19+/CD34+ 9,10。鉴于这些不一致，我们将CD19+/CD34+细胞定义为晚期原B细胞/早期pre-BI细胞。需要强调的是，该分选策略的建立旨在分离与急性淋巴细胞白血病相关病变细胞相对应的前体B细胞亚群。然而，具体采用何种分选策略，仍可根据研究关注的细胞亚型而灵活调整。
应根据可用分选细胞仪的性能来选择抗体-荧光染料组合。一般原则是：在您的检测组合中，最明亮的荧光染料应标记表达抗原最少的细胞群体，反之亦然。在检测双染色群体时，尤其是此类稀有事件，双联体区分（图2B）是设门策略中至关重要的环节。这可确保双阳性事件确实是单个细胞同时被两种抗体染色，而非两个单独染色的细胞相互黏附所致。
高速四路细胞分选必然会产生受控的气溶胶环境，因此活的人类细胞分选必须谨慎进行。已有发表的安全性和去污染指南可供参考，应在分选前查阅并实施14。分选前可能需要获得机构生物安全委员会或其等效机构的批准。分选完成后，应在废液容器中加入漂白剂，使其终浓度达到10%。同样，所有样品管路以及分选区域内的所有表面均应使用新鲜配制的10%漂白剂溶液彻底去污染。
总之，本方案提供了一种获取前体B细胞稀有群体的策略，也可经修改用于分离脐带血中其他稀有细胞群体，包括造血干细胞和未成熟T细胞。最近，已在晚期HIV感染个体的外周血中发现未成熟B细胞15。因此，该方法的应用范围不仅限于血液系统肿瘤的研究。最后，我们尚未对流式分选的细胞进行RNA提取；然而，该方法应可适用于RNA分析，但需注意在细胞分选过程中，应将细胞直接分选至Trizol或Qiagen公司RNeasy试剂盒中的RLT等适用于RNA保存的溶液中。

为了识别疾病中存在的异常，使用与疾病所影响的组织或细胞类型相对应的健康组织或细胞至关重要。原因之一在于，不同组织类型之间的表观遗传变异负责调控基因表达，并在正常人类发育过程中的细胞分化中起关键作用1,2。第二个原因是，异常的组织特异性基因调控可能对正常发育产生严重后果，并已被证实与多种疾病状态（包括癌症）的发生有关。因此，要更深入地理解涉及造血细胞的疾病，必须掌握健康造血细胞的相关知识。
骨髓中造血细胞的发育经历一系列系统性的事件，其特征是细胞表面标志物表达的变化3。针对成年受试者的研究表明，骨髓中通常仅含有少量前体B细胞4,5；而针对儿童受试者的研究显示，在5岁以下个体中，前体B细胞所占比例相对较高6。脐带血作为治疗血液系统疾病和恶性肿瘤的造血干细胞来源，可通过脐带血库便捷获取，且富含不成熟的B细胞和T细胞7，这些细胞正是包括白血病和淋巴瘤在内的多种疾病的靶细胞。
骨髓中的前体B细胞已被广泛进行表型分析8,9，可通过特定的细胞表面标志物进行定义，并利用这些标志物将细胞分选为不同的亚群。正常的B细胞分化过程在骨髓中经历一系列阶段，从最早的原B细胞开始，最终形成未成熟或初始B细胞。根据van Zelm等人的研究10，原B细胞的特征是表达CD34，而在向第2阶段（前B-I期）过渡时获得CD19的表达。第3阶段（前B-II期）细胞不再表达CD34，并开始表达胞质IgM。最后，第4阶段（未成熟B细胞）的一个标志性特征是表达表面IgM。本方案中描述的分选策略最初由Caldwell等人提出6，仅使用3种细胞表面标志物，显著降低了细胞分选实验的复杂性和成本。在他们的研究中，建立了CD45表达水平与B细胞分化阶段之间的关系。他们观察到骨髓中的B细胞对CD45的表达水平存在差异：高表达CD45的细胞对应于表达表面IgM的细胞（未成熟B细胞）；中等水平表达CD45的细胞对应于表达胞质IgM的细胞（前B-II期细胞）；低水平表达CD45的细胞则对应于不表达胞质IgM的细胞（前B-I期细胞）。本方案采用Caldwell等人开发的策略6，从脐带血中分离前体B细胞的不同亚群（图1），所获得的细胞可用于需要高质量核酸的下游实验，例如甲基化CpG岛回收分析（MIRA）11和定量实时PCR检测。该方法首先使用磁珠进行初步分离，去除脐带血中所有非B细胞，仅需使用3种抗体（CD34、CD19和CD45）进行染色。最终获得的细胞代表了B细胞分化的4个阶段：1）CD34+；CD19+（晚期原B细胞和早期前B-I期细胞）；2）CD34-；CD19+；CD45low（晚期前B-I期细胞）；3）CD34-；CD19+；CD45med（前B-II期细胞）；4）CD34-；CD19+；CD45high（未成熟B细胞）。

<table><tbody><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多功能支架</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 分离器</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>B 细胞分离试剂盒（B CLL）</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-660</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 ml）</td><td>MIDSCI</td><td>SS1500</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 7-AAD（7-氨基放线菌素 D）</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen APC 小鼠抗人 CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE 小鼠抗人 CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>560941</td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 冲洗液</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA 储存液</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底管</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml 管</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>PuraFlow 鞘液，8X</td><td>Beckman Coulter</td><td>CY30230</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck 校准微珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow 校准微珠</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ViroSafe 气溶胶抽滤滤器</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML01330</td><td></td></tr><tr><td>ABC 小鼠磁珠试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific 血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Model 3R 台式离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-516</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶抽滤装置</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从脐带血中分离前体b细胞亚群

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

脐带血中含有大量处于不同谱系分化阶段的造血祖细胞。我们已建立了一种分离前体B细胞的方法，可分离出分化过程中的四个不同阶段的前体B细胞。由于基因表达和表观遗传修饰具有组织特异性，因此区分不同组织和细胞类型对于识别可能导致疾病发生的基因组和表观基因组改变至关重要。该方法可适用于脐带血中任何分化阶段的各类细胞。	
该方法包括四个主要步骤。首先，通过密度梯度离心法分离单个核细胞。其次，使用生物素偶联的抗体富集B细胞，这些抗体可识别并去除单个核细胞中的非B细胞。第三，用针对B细胞发育各个阶段特异性细胞表面蛋白的荧光标记抗体对B细胞进行荧光标记。最后，对荧光标记的细胞进行分选，并回收各个细胞亚群。所获得的细胞在数量和质量上均足以用于后续的核酸分析实验。

样本间的差异会影响细胞分选的成功率（表1）。成功率较高的样本中污染性碎片含量较低（图3A），而成功率较低的样本中污染性碎片含量较高（图3B）。若脐带血样本在采集后24小时内运送（优先选择隔夜送达），可在一定程度上控制样本间的差异。
通过流式分选获得的各个前体B细胞亚群的细胞数量充足且质量较高，可用于核酸提取。所提取的DNA质量高，可应用于后续分析。我们常规将此DNA用于MIRA11实验中以富集甲基化DNA（图4）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>脐带血库数据</td>
 <td>分选效果差</td>
 <td>分选效果好</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>含抗凝剂的工作血液体积（ml）</td>
 <td>110</td>
 <td>104</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>白细胞 [103/μl]</td>
 <td>8.68</td>
 <td>11.19</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>淋巴细胞 [103/μl]</td>
 <td>3.88</td>
 <td>3.76</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>淋巴细胞百分比（%）</td>
 <td>44.70</td>
 <td>33.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>红细胞 [106/μl]</td>
 <td>3.65</td>
 <td>3.05</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">实验室内部数据</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque 分离后细胞数量</td>
 <td>206 M</td>
 <td>309 M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MACS 分离后细胞数量</td>
 <td>22 M</td>
 <td>16.5 M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总事件计数（MoFlo XDP）</td>
 <td>30.57 M</td>
 <td>19.97 M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>细胞活力（%）</td>
 <td>98.00</td>
 <td>98.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>位于淋巴细胞门内的细胞比例（%）</td>
 <td>17.00</td>
 <td>50.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">CD19+/CD34+</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总细胞数</td>
 <td>10959</td>
 <td>48316</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>占总事件比例（%）</td>
 <td>0.04</td>
 <td>0.24</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>分选效率</td>
 <td>88%</td>
 <td>88%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">CD19+/CD34-/CD45low</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总细胞数</td>
 <td>16619</td>
 <td>26941</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>占总事件比例（%）</td>
 <td>0.05</td>
 <td>0.13</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>分选效率</td>
 <td>89%</td>
 <td>87%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">CD19+/CD34-/CD45med</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总细胞数</td>
 <td>469745</td>
 <td>507540</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>占总事件比例（%）</td>
 <td>1.54</td>
 <td>2.54</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>分选效率</td>
 <td>89%</td>
 <td>89%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">CD19+/CD34-/CD45high</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总细胞数</td>
 <td>1896062</td>
 <td>2047142</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>占总事件比例（%）</td>
 <td>6.2</td>
 <td>10.25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>分选效率</td>
 <td>91%</td>
 <td>90%</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 代表性细胞分选统计结果。 第1-5行为脐血库提供的计数数据。其余行为本实验室收集的数据。差的分选样本中含有高水平的碎片以及淋巴细胞门内细胞比例较低。
<img alt="B细胞亚群分离流程；流式细胞术，抗体；实验工作流程示意图。" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 图1. 实验流程图。 处理脐带血并使用Ficoll-Paque Plus分离单个核细胞。额外增加一步洗涤以去除污染的血小板。使用MACS人B细胞分离试剂盒（B-CLL）从单个核细胞中分离B细胞。该步骤利用生物素标记的单克隆抗体（CD2、CD4、CD11b、CD36、抗IgE和CD235a）去除所有非B细胞。回收的B细胞用CD19-APC、CD34-PE和CD45-FITC抗体标记，然后使用MoFlo XDP流式细胞仪分选，以获得前体B细胞亚群：CD19+/CD34+；CD19+/CD34-/CD45low；CD19+/CD34-/CD45med；以及CD19+/CD34-/CD45high。
<img alt="显示细胞群体、FSC、CD34、CD19、CD45散点图的流式细胞术分析示意图。" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 鉴定与分选细胞群体的设门策略。 红色箭头指示应用于后续图的设门。R4、R5、R6 和 R7 门表示被分选的细胞群体。a) 前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）散点图，显示富集的淋巴细胞群体。R1：淋巴细胞门。b) 前向散射高度与宽度图，用于区分单细胞与双联体细胞。R2：单细胞门。c) CD19-APC阳性细胞分为CD34-PE阴性和阳性群体。R3：CD19+/CD34-门；R4：CD19+/CD34+门，表示目标分选群体。d) CD19+/CD34-细胞分为三个相对不同的CD45-FITC表达水平群体。R5 和 R6 分别代表 CD19+/CD34-/CD45low 和 CD19+/CD34-/CD45med 群体。R7：由于 CD19+/CD34-/CD45high 群体细胞数量较多，该分选门仅包含该群体的一部分。下游分析无需收集该群体的全部细胞。
<img alt="流式细胞术散点图；FSC 与 SSC 图显示用于分析的细胞群设门。" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. a) 柱层析富集后杂质碎片水平较低。R1，淋巴细胞门。 b) 柱层析富集后杂质碎片水平较高。
<img alt="Gel electrophoresis results; DNA separation; band clarity analysis; SLC25A37, APC1 gene bands." src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
 图4. 从B细胞前体亚群中富集甲基化DNA。 a) 超声处理后从前体B细胞亚群中分离的DNA质量较高。文库构建时，DNA经超声处理至平均片段长度为200–600 bp。泳道1：Promega 100 bp DNA Marker（目录号#G2101）；泳道2：从CD19+/CD34+细胞中提取的总DNA；泳道3：从CD19+细胞中提取的总DNA+/CD34-/CD45低 细胞；第4泳道：从CD19分离的100 ng DNA+/CD34-/CD45医学 细胞；第5泳道：从CD19分离的100 ng DNA+/CD34-/CD45高 细胞。使用Diagenode Bioruptor在高功率条件下对DNA进行超声处理，总时长为9分钟（开启30秒，关闭30秒）。DNA经柱纯化后，用含SYBR Green核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳检测。 b) 使用ActivMotif MethylCollector Ultra试剂盒进行MIRA后，通过SLC25A37（1-6）和APC1（7-12）的PCR检测以确认甲基化DNA的富集。&amp;7：超声处理的基因组DNA（无MIRA）；2&amp;8: MIRA-CD19+/CD34+ DNA；3&amp;9: MIRA-CD19+/CD34-/CD45低 DNA；4&amp;10: MIRA-CD19+/CD34-/CD45医学 DNA；5&amp;11: MIRA-CD19+/CD34-/CD45高 DNA；6&amp;12：水对照。SLC25A37 的扩增倍数更高，证实前体B细胞亚群中甲基化DNA富集。

本文介绍了一种从脐带血中分离前体B细胞亚群的实验方案。可从这些细胞中提取足量且高质量的核酸，并用于后续基于DNA或RNA的检测分析。

从脐带血中分离前体B细胞亚群

脐带血富含处于不同谱系分化阶段的造血祖细胞。我们已开发出一种方案，用于……

本实验的总体目标是从脐带血中分离出前体B细胞的不同亚群。首先通过密度梯度离心法从脐带血中分离单个核细胞，实现这一目标。在第二步中，使用与生物素偶联的抗体标记细胞表面抗原，从而通过磁性分选去除残留的非B细胞。接下来，将分离的B细胞用针对CD19、CD34和CD45细胞表面抗原的荧光标记抗体进行标记。最后一步中，通过流式细胞术对细胞进行分选，以获得前体B细胞亚群。最终可获得数量充足且质量合格的细胞，用于需要高质量DNA和RNA的下游实验。与替代方法相比，细胞分选策略的一个优势在于，该策略在流式细胞仪上的操作时间更短，且仅需三种荧光标记抗体，从而显著降低实验成本。通常，初次使用该方法的研究人员可能在脐带血细胞用于流式细胞术的多种制备方法以及流式细胞仪的复杂准备步骤方面遇到困难。尽管该方法可用于研究健康的前体B细胞，也可拓展应用于脐带血中存在的其他细胞类型，如T细胞，或用于涉及任何造血细胞的疾病研究，例如白血病或淋巴瘤。该方法的可视化演示至关重要，因为难以通过文字准确描述处理脐带血及细胞的正确技术，而这些技术对于最大限度地提高细胞活力并减少污染性碎片的存在尤为关键。为从脐带血中分离单个核细胞，首先将8毫升脐带血等分试样与24毫升DPBS混合稀释。然后，将每份稀释后的血液混合物缓慢地加至含有15毫升ALI watts fipa plus的50毫升锥形管上层，注意保持各层分离。接下来，将血液在20摄氏度条件下以400 × g离心40分钟，同时通过密度梯度法分离细胞。取75 mL圆底管，根据表格中所述内容，用样本编号、日期及其他适当信息进行标记。分离完成后，单个核细胞将保留在血浆与不透明界面层，而粒细胞和红细胞则会沉淀。此时吸除上层血浆层，注意避免接触单个核细胞层。然后使用10 mL玻璃移液管，从三个50 mL管中小心收集单个核细胞层，并转移至一个新的50 mL管中。用 PBS 填满这支新离心管，轻轻混匀细胞悬液，然后在 300 × g、20 °C 条件下离心洗涤细胞两次，每次 10 分钟。第一次洗涤后，重悬细胞沉淀，并转移至一个 50 毫升的锥形离心管中。第二次洗涤后，用 200 微升 PBS 轻轻重悬细胞沉淀，取 1 微升细胞悬液加入含有 1 毫升 PBS 的 1.5 毫升微量离心管中，用于细胞计数。然后用更多 PBS 清洗 50 毫升离心管中的细胞，彻底去除上清液，注意不要扰动沉淀。为了从单个核细胞中分离 B 细胞，首先将刚刚洗涤后的沉淀重悬于 160 微升、4 摄氏度的预冷新鲜配制的 DGA-EDTA-PBS 缓冲液中。然后将40微升B细胞分离试剂盒中的生物素化ITIN抗体混合物加入细胞悬液中。在4摄氏度孵育细胞10分钟后，每1000万个细胞加入1毫升4摄氏度的EDTA-PBS缓冲液洗涤，以去除游离抗体。随后将细胞沉淀重悬于320微升4摄氏度的EDTA-PBS缓冲液中。在4°C孵育15分钟后，将80微升抗生物素微珠与细胞悬液混合。在细胞离心过程中再次洗涤细胞。将LS柱置于Max分离器的磁场中，并将3毫升4°C的EDTA-PBS缓冲液滴加通过该柱。随后，将最多1亿个洗涤后的细胞重悬于500微升、4摄氏度的EDTA-PBS缓冲液中。然后将细胞悬液转移至层析柱上，收集流穿柱子的未标记细胞，收集于50毫升锥形管中。向原先的锥形管壁加入额外的2毫升4摄氏度EDTA-PBS缓冲液，每次1毫升，轻轻混匀后，将残留的细胞悬液全部转移至柱子上，确保回收所有细胞。最后用 PBS 填充含有未标记细胞的锥形管。离心后，小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀。然后在 200 µL 的 EDTA-PBS 缓冲液中轻柔地重悬细胞。开始抗体标记。首先将1 µL细胞悬液转移至先前标记好的未染色管中，然后向管中加入500 µL EDTA-PBS缓冲液，并将管置于冰上保存。关闭所有光源，然后向剩余的细胞悬液中每100万个细胞加入20微升CD19、CD34和CD45抗体。充分混匀，将试管置于室温避光处孵育30分钟。接着，将40微升标记了抗体的细胞悬液转移至标有A至D的七支试管中。用一毫升 PBS 洗涤细胞，然后将沉淀重悬于 100 微升结合缓冲液中。向这些细胞中加入 7 微升 7-AAD，然后在室温下避光孵育 10 分钟。在细胞标记 7-AAD 的同时，用 PBS 补充抗体标记细胞的管子，洗涤抗体标记的细胞，然后将沉淀重悬于 500 微升 EDTA-PBS 缓冲液中。现在将抗体标记的细胞悬液的全部体积转移至 CD19 阳性、CD34 阳性、CD45 阳性标记管中。用额外的1毫升EDTA-PBS缓冲液冲洗试管，将残留的细胞悬液转移至CD19阳性CD34阳性CD45阳性标记的试管中。最后，向7AAD试管中加入300微升结合缓冲液，使用MO Flow XDP流式细胞仪进行细胞分选。首先设置MO Flow用于分选，运行适当的补偿对照，然后创建一个包含图示的方案，如本图所示。确保气溶胶排空系统始终处于运行状态，然后使用未染色样品设置前向散射和侧向散射图的电压和增益，以识别无荧光信号的细胞群体。将阈值设为小于或等于1%，以避免含DNA的碎片污染回收的样品。对 CD19 阳性、CD34 阳性、CD45 阳性样本运行约 50,000 个事件。采用如前所示的设门策略，将未设门的 CD19 阳性、CD34 阳性细胞群反向设门至侧向散射光 versus 前向散射光图，以确保淋巴细胞门包含潜在的前体 B 细胞。使用该样本同时设定七AAD染色的阴性荧光群体。接下来，运行七AAD样本以确定样本活力，仅对初始活力大于或等于95%的样本进行分选，因为死细胞会非特异性染色，可能污染分选群体。现在设置分选决策，以收集以下群体：CD19阳性、CD34阳性；CD19阳性、CD34阴性、CD45低表达；CD19阳性、CD34阴性、CD45中等表达；以及CD19阳性、CD34阴性、CD45高表达。在分选所有细胞群时，需包含淋巴细胞和双峰细胞的鉴别门控，以防止堵塞。分选前，立即将 CD19 阳性、CD34 阳性、CD45 阳性的样本通过 40 微米细胞滤网过滤。随后，将预先加入含 2% FBS 的 PBS 包被的收集管置于装有冰块的试管架中，并在分选完成后立即把细胞分选至相应的收集管中。在细胞成功与否方面，样本间的差异起着重要作用，需对细胞进行良好的分选。淋巴细胞群中细胞比例较高。成功率达到较高水平的样本含有较低水平的污染碎片，这由位于门控淋巴细胞群左下方的事件数量较少得以证实。成功率较低的样本中含有较高水平的污染碎片。质量较差的样本中，此类事件显著增多。经流式分选的细胞及其后续从各前体B细胞亚群中分离得到的DNA，在数量和质量上均足以进行下游分析。我们常规使用该DNA在Myra中对甲基化DNA进行富集。此处的DNA分别来自CD19阳性CD34阳性细胞、CD19阳性CD34阴性CD45低表达细胞、CD19阳性CD34阴性CD45中等表达细胞以及CD19阳性CD34阴性CD45高表达细胞。这些DNA样本经高强度超声处理，总时长为9分钟，随后进行柱纯化，并在含Cyber Green核酸染料的1%琼脂糖凝胶中进行电泳可视化分析（如本泳道所示）。同时使用100 bp DNA标记物作为对照。在Myra平台上，采用Active Motif公司的MeDIP富集超纯试剂盒（MeDIP Enrichment Ultra Kit），通过PCR扩增对照甲基化的SLC25A37基因和对照非甲基化的APC1基因，以确认甲基化DNA的有效富集。SLC25A37 的高倍扩增证实了前体B细胞亚群中甲基化DNA的富集。一旦掌握，若操作得当，该技术可在10小时内完成。在进行该实验时，需注意轻柔处理细胞，并使用优化量的抗体，以尽量减少后续步骤中污染性碎片的产生。还可以采用其他方法，如新一代测序，以回答更多问题，例如哪些基因发生了甲基化以及前体B细胞亚群的情况。请注意，操作活体人类细胞可能具有极高危险性，在进行该实验流程时，应始终采取预防措施，例如启用气溶胶抽排系统。

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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