机械刺激诱导的单层细胞中钙波传播：以牛角膜内皮细胞为例

以下实验的总体目标是通过定量分析机械刺激在原代角膜内皮细胞单层中引发的细胞间钙波的传播，来研究通过缝隙连接通道和半通道（HEMI通道）介导的细胞间通讯。该目标首先通过从新鲜牛眼球中分离原代角膜内皮细胞来实现。第二步，在将细胞接种于腔室载玻片后两到三天，当细胞形成融合单层时，用荧光钙离子敏感性染料Fluo-4 AM对细胞进行负载。随后，我们对单层中的单个细胞施加可控且局部的机械刺激，以诱发细胞间钙波，并在共聚焦显微镜下观察该钙波的传播过程。

结果展示了细胞间钙波传播的扩散情况。最终，通过抑制间隙连接通道和半通道，可以解析构成间隙连接通道和半通道的不同连接蛋白（Connexin）和泛连接蛋白（Pannexin）亚型的特性及其调控机制。机械刺激诱导的细胞间钙波传播的主要优势在于，它提供了一种简单且可靠的方法，以非侵入性的方式检测连接通道和半通道的功能贡献及其特性。

此外，该方法依赖于所研究细胞系统中存在的生理信号分子及信号级联反应。最后，该方法可轻松适用于多种细胞系统，包括原代细胞以及异位表达特定连接蛋白或PanIN亚型的细胞模型。通过使用siRNA介导的内源性连接蛋白或PanIN亚型的敲低，以及特异性抑制帽状连接通道和HEMI通道，该方法可深入了解连接蛋白和PanIN介导的帽状连接通道与HEMI通道的功能及其动态调控机制。

该系统绝不仅限于角膜内皮细胞，它几乎可适用于任何细胞类型以及更复杂的组织。本实验步骤采用新鲜的、未去核的牛眼，牛的年龄不超过18个月，且在死亡后5分钟内获取眼球。

将其置于Earl's平衡盐溶液和1%碘溶液中，在4摄氏度条件下运送至实验室。首先，将眼球转移至直径100毫米、高20毫米的培养皿中。接着，用含有1%碘的EBSS冲洗眼球。

此后用含有70%乙醇的溶液进行消毒。在无菌操作台中操作。小心地从眼球上分离角膜，并将其置于含有EBSS的35毫米×10毫米培养皿中，使上皮细胞层朝上。

小心地去除仍附着在角膜上的任何残留虹膜组织。如有需要，将角膜转移至另一含有 EBSS 的培养皿中，内皮细胞层朝上，然后用 EBSS 冲洗两次。接着，将角膜内皮层朝上放入沙漏形培养皿中，并加入生长培养基覆盖。

冲洗时，用吸液管吸除培养基。向角膜的内皮层加入300微升浓度为0.5克/升的胰蛋白酶溶液。将含有角膜的沙漏形培养瓶放入加盖的培养皿中，转移至37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟。

取出沙漏后，用火焰抛光的钩状玻璃巴斯德吸管轻轻将角膜内皮细胞从角膜上刮下。吸取含有内皮细胞的溶液，并将其加入含有4毫升培养基的25平方厘米培养瓶中。接着，向角膜上施加300微升生长培养基。

重复刮取操作，将含有内皮细胞的溶液加入培养瓶中。再重复此步骤一次，然后将含有角膜内皮细胞的培养瓶置于含生长培养基的培养箱中，于37摄氏度及5%二氧化碳条件下培养。两天后，加入6毫升培养基，并每隔两天更换一次生长培养基。

细胞应在分离后7到10天内达到汇合，即可传代。首先吸除培养基，然后用EBSS冲洗两次。接着向细胞中加入2毫升胰蛋白酶溶液，将培养瓶放入培养箱中孵育3至4分钟。

然后加入 12 毫升培养基，用移液器将培养基吹打三次，以分散细胞。接着使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。将 165,000 个细胞加入到双孔培养板中。

接下来，为新传代准备75平方厘米的培养瓶，接种密度为每平方厘米6,250个细胞，并加入新鲜培养基至总体积25毫升，将培养瓶和腔室载玻片放入培养箱中。每两天更换一次培养基，细胞层应在三到四天内达到汇合状态。首先，在细胞于37摄氏度、轻度振荡条件下孵育时，用含10微摩尔Fluo-4 AM的磷酸盐缓冲液处理腔室载玻片中的细胞30分钟。同时，将尖端直径小于1微米的玻璃微量移液管连接至压电陶瓷纳米定位器，并将其与安装在显微操作仪上的放大器相连。

将纳米定位器的电压设置在 0.2 至 1.5 伏之间。去除凌晨 4:00 配制的溶液。随后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞五次，然后在室温下用 PBS 孵育细胞至少五分钟，再进行测量。

使用氩离子激光器激发488纳米，并采用HFT 48分光镜。通过设置为最小的针孔，使用长通发射滤光片LP 505在530纳米处收集荧光发射信号，此处使用40倍油浸物镜。将培养皿载玻片置于共聚焦显微镜载物台上，找到细胞汇合的区域。

接下来，移动显微操作仪，使玻璃微电极以45度角接触细胞膜。操作显微操作仪，用玻璃微电极短暂触碰小于单个细胞膜1%的区域，对细胞施加持续一秒的机械刺激。随后使用共聚焦显微镜检测机械刺激后钙离子浓度的空间变化，并采集和存储图像。

最后，使用共聚焦显微镜的软件绘制一个多边形感兴趣区域，以确定反应性细胞的总表面积。在对照条件下，通过代表性伪彩色荧光图像显示牛角膜内皮细胞中机械刺激诱导的钙瞬变在不同时间点的变化情况，刺激前的荧光强度显示在第一幅图像中。第二幅图像中的白色箭头标示了受到机械刺激的细胞。

钙波传播至六个相邻的细胞层，波及细胞的总面积达到62,870平方微米，形成一个活性区域。折线图显示了机械刺激细胞（标记为ms）中归一化荧光值（NF）随时间的变化过程，以及相邻第1至第5层细胞（在图中标记为MB1至MB5）NF值的平均变化。这些图像更详细地展示了在左侧图中经外源性核苷酸处理后、以及在右侧图中经外切核苷酸酶抑制剂处理后，细胞间钙波传播发生的显著变化。具体而言，左侧图显示，在用外源性腺苷三磷酸酶六（Aras Aase six）和腺苷三磷酸酶七（Aase seven）处理牛角膜内皮细胞后，活性区域显著减小；这两种酶可水解ATP和ADP，从而抑制旁分泌型细胞间通讯通路。

星号表示在存在与不存在 ace 时，P 值小于 0.001。右侧的图表显示，在用选择性外核苷酸抑制剂 ARL 67156 处理 BCEC 后，活性区域显著增加，从而增强了旁分泌细胞间通讯通路。星号表示在存在与不存在 ARL 时，P 值小于 0.001。

若操作得当，该技术在一种条件下完成一次实验仅需 5 到 10 分钟。要完成一系列可比较不同条件的实验并得出统计学结论，则需要一天时间。必须使用在不同日期、不同批次分离细胞中进行的独立实验。

测量和定量细胞内钙波传播，有助于识别和表征不同连接蛋白亚型（如间隙连接通道和半通道）在细胞生物学调控中的作用。我还想强调的是，该方法并非独立使用，而应与其他分子和功能学方法相结合，包括示踪剂转移、ATP释放检测以及电生理学技术。