Name: 机械刺激引起的钙波传播的细胞单层:牛角膜内皮细胞的例子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 了解机械刺激诱导牛角膜内皮细胞单层中钙波传播的方法，利用共聚焦显微镜可视化细胞间钙信号传递过程。该技术为研究缝隙连接通道和半通道介导的细胞间通讯提供了简单可靠的非侵入性手段。

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本实验室的研究工作得到了佛兰德研究基金会（FWO；资助号 G.0545.08 和 G.0298.11）、比利时科学政策 Interuniversity Attraction Poles 计划（资助号 P6/28 和 P7/13）的资助，并隶属于一个由 FWO 支持的研究团体。CDH 是佛兰德研究基金会（FWO）的博士后研究员。作者衷心感谢分子与细胞信号传导实验室（KU Leuven）所有现任和前任成员、美国印第安纳大学视光学学院 SP Srinivas 博士、根特大学 Leybaert 博士实验室以及布鲁塞尔自由大学（VUB）Vinken 博士实验室的同仁，他们提供了有益的讨论、优化了实验流程，或参与了用于研究连接蛋白半通道工具的开发工作。

1. 角膜内皮细胞的分离
开始之前：从当地屠宰场获取的新鲜眼球中，在眼球摘除后尽快分离细胞。确保眼球来自一头死亡后5分钟内、年龄不超过18个月的牛，并在运输至实验室期间以4 °C的Earle's平衡盐溶液-1%碘溶液保存。
<ol>
 <li>将眼球从Earle's平衡盐溶液-1%碘溶液中取出，放入培养皿（100 × 20 mm）中。</li>
 <li>用含70%乙醇的溶液对眼球进行消毒，并用含1%碘的Earle's平衡盐溶液冲洗。</li>
 <li>从本步骤开始，在无菌操作台中进行操作。小心地将角膜从眼球上分离，并将其放入含有Earle's平衡盐溶液的培养皿（35 × 10 mm）中，使上皮细胞层朝上。如有必要，小心去除仍附着在角膜上的残留虹膜组织。</li>
 <li>将角膜转移至另一含有Earle's平衡盐溶液的培养皿中，使内皮细胞层朝上，并用Earle's平衡盐溶液冲洗两次。</li>
 <li>将内皮层朝上的角膜转移至钟形杯（一种杯状培养皿）中，并加入生长培养基覆盖。生长培养基由含25 mM葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）组成，其中包含10%胎牛血清、6.6% L-谷氨酰胺、2.5 μg/ml两性霉素B，以及含10,000单位/ml青霉素、10,000 μg/ml链霉素和25 μg/ml两性霉素B的1%抗生素-抗真菌混合液。</li>
 <li>用吸液移液管吸除培养基。</li>
 <li>向角膜的内皮层加入300 μl胰蛋白酶溶液（0.5 g/L）（所有涉及胰蛋白酶的步骤均使用相同浓度）。</li>
 <li>将含有角膜的钟形杯放入加盖的培养皿中，置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟。</li>
 <li>在无菌操作台中，用火焰抛光的钩状玻璃巴斯德吸管轻轻刮取角膜上的内皮细胞。</li>
 <li>吸出含有内皮细胞的溶液，并将其加入含有4 ml培养基的培养瓶（25 cm2）中。</li>
 <li>向角膜中加入300 μl生长培养基，重复刮取操作，并将含有内皮细胞的溶液加入培养瓶中。</li>
 <li>将此最后一步（1.11）再重复一次。</li>
 <li>将含有角膜内皮细胞并加入生长培养基的培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。</li>
 <li>两天后，加入6 ml培养基。</li>
 <li>每两天更换一次生长培养基。</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
 <li>当细胞融合度达到时（分离后约10天内），移除培养基，并用Earle's平衡盐溶液洗涤细胞两次。</li>
 <li>向细胞中加入1.5 ml胰蛋白酶溶液以使细胞脱落，将培养瓶置于培养箱中（37 °C，5% CO2）孵育3至4分钟。</li>
 <li>加入12 ml生长培养基。用移液器将液体反复吹打三次，以分散细胞并进行细胞计数。</li>
 <li>根据细胞密度以不同比例接种细胞，并放入培养箱中。准备两个带孔的培养玻片（面积为4.2 cm2），每孔接种165,000个细胞（细胞密度为39,286个/cm2）。准备80 cm2的培养瓶用于新传代，接种密度为6,250个/cm2，并加入新鲜培养基至总体积为25 ml。</li>
 <li>每两天更换一次培养基。</li>
 <li>培养瓶中的细胞层在3至4天后达到融合状态，可用于实验。</li>
 <li>当培养瓶中的细胞层达到融合状态时，重复步骤2.1至2.6。传代次数不超过2代的细胞可用于实验。</li>
</ol>
3. 诱导钙波的机械刺激
<ol>
 <li>在37 °C、轻度振荡条件下，用含10 μM Fluo-4 AM的磷酸盐缓冲液将细胞加载至腔室载玻片中，孵育30 min。</li>
 <li>移除Fluo-4 AM溶液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞5次，随后将细胞在磷酸盐缓冲液中孵育，并在室温下静置至少5 min后再进行测量。</li>
 <li>使用氩离子激光器在488 nm处激发，采用HFT 488分光镜，通过长通发射滤光片LP 505在530 nm处收集荧光发射信号，针孔设为最小。使用40X油浸物镜（空气，1.2 N.A.）。在ARL-67156实验中，使用10X物镜（空气，0.3 N.A.）。</li>
 <li>在共聚焦显微镜下寻找细胞达到完全融合的视野。</li>
 <li>将移液管定位至与腔室载玻片成45°角，并接触细胞膜。对单个细胞施加短暂（≈1秒）的机械刺激。该机械刺激是通过连接在压电晶体纳米定位器上的玻璃微移液管（尖端直径&lt;1 μm）短暂接触小于1%的细胞膜，引起急性且持续时间短的细胞形变，纳米定位器通过安装在显微操作器上的放大器控制。玻璃微移液管由微电极拉制仪制备。确保在机械刺激过程中，纳米定位器的工作电压保持在0.2至1.5 V之间。电压超过1.5 V可能导致细胞损伤。对于每种细胞类型和实验条件，必须通过从低（0.2 V）到高（1.5 V）的一系列电压测试，仔细确定在不损伤细胞的前提下进行机械刺激的最佳电压。电压是刺激力度的度量指标，因为它决定了施加在细胞膜上的机械应力和应变。机械刺激的力可通过机械应力乘以面积计算得出。由于面积（&lt;3.14 μm2）和机械应力均非常小，因此机械刺激的力也很小。（注意：当细胞受损时，荧光会从细胞中泄漏，细胞变暗。）</li>
 <li>使用共聚焦显微镜测量机械刺激后[Ca2+]i的空间变化。</li>
 <li>采集并存储图像。</li>
 <li>利用共聚焦显微镜的软件绘制多边形感兴趣区域，以定义响应细胞的总表面积（活性区域，AA）。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本论文中，我们描述了一种简单的方法，通过使用微移液管提供局部且可控的机械刺激，来测量原代牛角膜内皮细胞单层中细胞间Ca2+波的传播。机械刺激的细胞会响应产生细胞内IP3和Ca2+的局部升高，这两种分子均为关键的细胞内信号分子，可驱动细胞间Ca2+波的传播11,67。IP3通过缝隙连接通道直接传递至邻近细胞via间隙连接通道5，而Ca2+则促使半通道开放并释放ATP68,69，后者通过激活G蛋白偶联的P2受体，在邻近细胞中触发Ca2+信号37-40。该过程中缝隙连接通道与半通道的相对贡献，可通过使用Cx模拟肽、ATP降解酶（外核苷酸酶）以及外核苷酸酶抑制剂进行表征。我们实验室已对牛角膜内皮细胞中由机械刺激诱导的细胞间Ca2+波传播特性进行了系统研究25-33。研究结果表明，细胞间Ca2+波的传播主要由Cx半通道介导的...

细胞间通信和信号传导对于组织和整个器官水平上响应细胞外激动剂的生理过程协调至关重要1,2。最直接的细胞间通信方式是由缝隙连接（gap junctions）的形成所介导的。缝隙连接是由多个缝隙连接通道组成的斑块结构，这些通道是由相邻细胞的两个连接蛋白（connexin, Cx）半通道以头对头方式对接形成的蛋白质通道3,4（图1）。缝隙连接允许分子量小于1.5 kDa的小分子信号物质通过，包括Ca2+或IP35，从而引发并调节邻近细胞内钙库的Ca2+释放6（图2）。缝隙连接通道受到细胞内和细胞间蛋白质相互作用以及细胞信号通路（如氧化还原修饰和磷酸化）的严密调控7。缝隙连接（GJs）促进相连细胞之间的协调反应，使其发挥化学和电同步合胞体的功能。例如，心房和心室肌细胞之间心脏动作电位的传播即由Cx构成的缝隙连接通道介导85。连接蛋白（Cxs）不仅作为缝隙连接通道发挥作用，还可形成未配对的半通道，在细胞膜上发挥类似常规离子通道的功能8-10（图1）。半通道通过调控细胞内外环境之间的离子和信号分子交换，参与邻近细胞间的旁分泌信号传递。
在多种细胞类型中（如上皮细胞、成骨细胞、星形胶质细胞、内皮细胞） 等。) 和器官（如脑、肝、视网膜、耳蜗和血管系统）中的细胞间 Ca2+-波是协调多细胞反应的基础 11. 细胞内 Ca²⁺ 浓度的升高2+ 特定细胞内的水平不仅限于该细胞本身，还会传播至周围的邻近细胞，从而建立细胞间的Ca2+-波 12,13 . 这些细胞间的Ca2+-波对于细胞层作为合胞体的正常生理调节至关重要，其失调已与病理生理过程相关联 11角膜内皮和上皮中，不同的研究团队 14-24，包括我们自己的 25-33，研究了细胞间通讯的机制与作用。在角膜内皮细胞等非兴奋性细胞中，存在两种不同的细胞间通讯方式 28,29 ，即间隙连接细胞间通讯和旁分泌细胞间通讯。间隙连接细胞间通讯涉及信号分子的直接交换 通过 间隙连接 7间隙连接细胞间通讯对于维持组织稳态、调控细胞增殖以及建立对胞外应激的同步反应至关重要 10,34,35 在多种病理状态下，由于连接蛋白（Cxs）功能缺陷，导致间隙连接耦合减少，从而影响间隙连接细胞间通讯。 36这强调了间隙连接细胞间通讯在多细胞生物中的重要性与影响。与间隙连接细胞间通讯不同，旁分泌细胞间通讯不依赖于细胞间的直接接触，因为它涉及可扩散的细胞外信使分子的释放图2）。信号细胞会向细胞外空间释放不同类型的信号分子。这些分子随后被运输至靶细胞，并由靶细胞上特异的受体蛋白识别。接着，受体-信号复合物诱导产生细胞反应，该反应通过信号的清除、失活或脱敏作用而终止。释放的亲脂性细胞外信号分子可穿过细胞膜，作用于细胞内受体。相比之下，亲水性信号分子无法穿过反应细胞的质膜，而是作为配体结合于细胞表面表达的受体蛋白，再由这些受体将信号传递至细胞内环境。参与该过程的细胞表面受体蛋白主要有三大类：离子通道偶联受体、酶偶联受体和G蛋白偶联受体。释放的信号分子可作用于同一细胞的受体（自分泌），也可作用于邻近的靶细胞（旁分泌），或通过循环系统作用于远距离的靶细胞（内分泌）。
在多种细胞类型中，包括角膜内皮细胞 28,29ATP 是一种主要的亲水性旁分泌因子，可驱动细胞间 Ca²⁺ 信号的传播2+-波 37-40在机械形变、缺氧、炎症或受到各种试剂刺激时，ATP可从健康细胞中释放出来 41-44 响应剪切应力、拉伸或渗透性肿胀 44,45已提出不同的ATP释放机制，包括囊泡胞吐作用 44 以及多种转运机制，例如ATP结合盒（ABC）转运蛋白、质膜电压依赖性阴离子通道 46P2X7受体通道 47,48以及 连接蛋白半通道 49-52 和泛连接蛋白半通道 43,49,53胞外ATP可迅速水解为ADP、AMP和腺苷 54,55 由存在于细胞外环境中的外核苷酸酶降解。细胞外释放的ATP及其代谢产物ADP 56 将通过扩散传播。这些核苷酸与邻近细胞中嘌呤能受体的后续相互作用，已被认为参与了细胞间Ca²⁺信号的传播。2+-波 28,37,51存在两类不同的嘌呤能受体：腺苷是P1嘌呤受体的主要内源性配体，而嘌呤核苷酸（ATP、ADP）和嘧啶核苷酸（UTP、UDP）均可作用于大多数P2嘌呤受体。 57.
细胞间通讯可通过多种方法进行研究，例如划痕加载法、染料转移法、局部解笼激动剂（如IP3 和 Ca2+机械刺激， 等等。. 本文描述了Ca的研究2+- 通过机械刺激单个细胞引发的钙波传播。研究钙波的优势在于2+- 通过机械刺激引发的波传播为量化Ca²⁺信号的扩散提供了一种简便的工具2+随时间变化的波动，可对细胞的不同预处理进行定量比较。在角膜内皮中，这些细胞间Ca2+- 波动使单层细胞产生协调反应，从而作为非再生性角膜内皮的一种可能防御机制，帮助内皮在眼内手术期间抵抗细胞外应激，或在免疫排斥反应或葡萄膜炎期间暴露于炎症介质时维持功能 58,59 .

<table><tbody><tr><td>Earle's 平衡盐溶液（EBSS）</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>碘</td><td>Sigma-Aldrich（德国德兴霍芬）</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（GlutaMax）</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Sigma-Aldrich（德国德兴霍芬）</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素混合液</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156（6-N,N-二乙基-β,γ-二溴亚甲基-D-ATP） </td><td>Sigma-Aldrich（德国德兴霍芬）</td><td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VI</td><td>Sigma-Aldrich（德国德伊森霍芬）</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich（德国德伊森霍芬）</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td><td>定制多肽合成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gap27（SRPTEKTIFII）</td><td>定制多肽合成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>对照肽（SRGGEKNVFIV）</td><td>定制多肽合成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA1 Cx43（正义链：5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT） </td><td>退火的siRNA购自比利时列日的Eurogentec公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43（正义链：5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT） </td><td>退火的siRNA购自Eurogentec（比利时，列日）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA 阴性对照：siCx43-1 的随机序列（正义链：5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT） </td><td>退火的siRNA购自Eurogentec（比利时，列日）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2（TAT-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK）</td><td>Thermo Electron（德国乌尔姆）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron（德国乌尔姆）</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双室玻璃载片</td><td>Laboratory-Tek Nunc（丹麦罗斯基勒）</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 </td><td>卡尔蔡司医疗技术公司（德国耶拿）</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>压电&amp;#8211;压电晶体纳米定位器（Piezo Flexure NanoPositioner）</td><td>PI Polytech（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT-放大器</td><td>PI Polytech（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>E463 HVPZT-放大器</td><td></td></tr><tr><td>玻璃管（3.5 纳升玻璃替代管）</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市 世界精密仪器公司</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>显微技术&amp;#8211;电极拉制仪 </td><td>Zeitz Instrumente（德国慕尼黑）</td><td>WZ DMZ-通用拉马</td><td></td></tr></tbody></table>

机械刺激诱导的单层细胞中钙波传播：以牛角膜内皮细胞为例

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

细胞间通讯对于多种器官和组织（包括脑、肝、视网膜、耳蜗和脉管系统）中细胞间生理过程的协调至关重要。在实验条件下，通过对单个细胞施加机械刺激可诱发细胞间Ca2+波。这会促使细胞内信号分子IP3和Ca2+的释放，从而引发Ca2+波从受机械刺激的细胞向周围邻近细胞呈同心圆式传播。调控细胞间Ca2+波传播的主要分子通路包括：通过缝隙连接通道直接转移IP3，以及通过半通道释放ATP。通过定量分析细胞间Ca2+波的扩散范围、使用siRNA以及缝隙连接通道和半通道抑制剂，可实现对不同连接蛋白（connexin）和泛连接蛋白（pannexin）亚型作为缝隙连接通道和半通道的功能特性及其调控机制的鉴定与表征。本文描述了一种方法，用于测量加载了Fluo4-AM的原代角膜内皮细胞单层在受到可控且局部的机械刺激后产生的细胞间Ca2+波，该刺激由微操纵器控制的玻璃微移液管短暂触碰细胞膜引发，微移液管尖端直径小于1 μm，导致细胞发生急性、短暂的形变。我们还描述了原代牛角膜内皮细胞的分离方法，并将其作为模型系统用于评估Cx43半通道活性作为通过ATP释放驱动细胞间Ca2+波的主要动力。最后，我们讨论了该方法在缝隙连接通道与半通道研究背景下的应用、优势、局限性及替代方案。

所有实验均严格遵守相关指南、法规及监管机构的要求，所演示的实验方案在鲁汶大学动物护理与使用委员会的指导和批准下进行。
在牛角膜内皮细胞（BCEC）中，功能性缝隙连接表达显著，且缝隙连接细胞间通讯与旁分泌型细胞间通讯以交互方式共同参与细胞间通讯；但研究表明，主要通路为通过Cx43半通道释放ATP介导的旁分泌型细胞间通讯通路。 28,29 ATP 和 ADP 通过外核苷酸酶 E-NTPD1（外核苷三磷酸二磷酸水解酶 1，CD39 ATP 二磷酸水解酶）水解为单磷酸腺苷（AMP），随后由 5'-外核苷酸酶 CD73 进一步转化为腺苷 28,29 ATP 和 ADP 参与调节 Ca2+通过结合 P2Y1 和 P2Y2 受体介导的波动传播 28,29 两种受体均与磷脂酶C（PLC）偶联 通过 Gq 并从而诱导 IP3诱导的 Ca2+释放（-release）图2). 在BCEC中，嘌呤能P2Y受体的刺激会导致[C...

细胞间的Ca2+波由间隙连接通道和半通道驱动。本文介绍一种用于测量单层细胞在局部单细胞机械刺激下产生细胞间Ca2+波的方法，并阐述其在研究间隙连接通道和半通道特性及其调控机制中的应用。

细胞间通讯对于多种器官和组织中细胞间生理过程的协调至关重要，包括……

以下实验的总体目标是通过定量分析机械刺激在原代角膜内皮细胞单层中引发的细胞间钙波的传播，来研究通过缝隙连接通道和半通道（HEMI通道）介导的细胞间通讯。该目标首先通过从新鲜牛眼球中分离原代角膜内皮细胞来实现。第二步，在将细胞接种于腔室载玻片后两到三天，当细胞形成融合单层时，用荧光钙离子敏感性染料Fluo-4 AM对细胞进行负载。随后，我们对单层中的单个细胞施加可控且局部的机械刺激，以诱发细胞间钙波，并在共聚焦显微镜下观察该钙波的传播过程。结果展示了细胞间钙波传播的扩散情况。最终，通过抑制间隙连接通道和半通道，可以解析构成间隙连接通道和半通道的不同连接蛋白（Connexin）和泛连接蛋白（Pannexin）亚型的特性及其调控机制。机械刺激诱导的细胞间钙波传播的主要优势在于，它提供了一种简单且可靠的方法，以非侵入性的方式检测连接通道和半通道的功能贡献及其特性。此外，该方法依赖于所研究细胞系统中存在的生理信号分子及信号级联反应。最后，该方法可轻松适用于多种细胞系统，包括原代细胞以及异位表达特定连接蛋白或PanIN亚型的细胞模型。通过使用siRNA介导的内源性连接蛋白或PanIN亚型的敲低，以及特异性抑制帽状连接通道和HEMI通道，该方法可深入了解连接蛋白和PanIN介导的帽状连接通道与HEMI通道的功能及其动态调控机制。该系统绝不仅限于角膜内皮细胞，它几乎可适用于任何细胞类型以及更复杂的组织。本实验步骤采用新鲜的、未去核的牛眼，牛的年龄不超过18个月，且在死亡后5分钟内获取眼球。将其置于Earl's平衡盐溶液和1%碘溶液中，在4摄氏度条件下运送至实验室。首先，将眼球转移至直径100毫米、高20毫米的培养皿中。接着，用含有1%碘的EBSS冲洗眼球。此后用含有70%乙醇的溶液进行消毒。在无菌操作台中操作。小心地从眼球上分离角膜，并将其置于含有EBSS的35毫米×10毫米培养皿中，使上皮细胞层朝上。小心地去除仍附着在角膜上的任何残留虹膜组织。如有需要，将角膜转移至另一含有 EBSS 的培养皿中，内皮细胞层朝上，然后用 EBSS 冲洗两次。接着，将角膜内皮层朝上放入沙漏形培养皿中，并加入生长培养基覆盖。冲洗时，用吸液管吸除培养基。向角膜的内皮层加入300微升浓度为0.5克/升的胰蛋白酶溶液。将含有角膜的沙漏形培养瓶放入加盖的培养皿中，转移至37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟。取出沙漏后，用火焰抛光的钩状玻璃巴斯德吸管轻轻将角膜内皮细胞从角膜上刮下。吸取含有内皮细胞的溶液，并将其加入含有4毫升培养基的25平方厘米培养瓶中。接着，向角膜上施加300微升生长培养基。重复刮取操作，将含有内皮细胞的溶液加入培养瓶中。再重复此步骤一次，然后将含有角膜内皮细胞的培养瓶置于含生长培养基的培养箱中，于37摄氏度及5%二氧化碳条件下培养。两天后，加入6毫升培养基，并每隔两天更换一

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生物学

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