Name: 获取荧光时间推移电影的芽殖酵母和分析单细胞动力学移植物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: 学习利用荧光延时显微技术获取芽殖酵母单细胞电影，并通过Graft软件追踪细胞谱系、提取基因表达时间序列数据。该方法可分析细胞周期中的转录动态变化。

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感谢 Emily Jackson、Joshua Zeidman 和 Nicholas Wren 对软件提出的建议。本工作由 GM95733（资助给 N.M.）、BBBE 103316 及麻省理工学院启动资金（资助给 N.M.）提供资助。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

上述方案描述了一种简单的方法，可用于获取和分析荧光时间序列数据，且对微流控技术或软件开发经验要求较低。该方法能够获得单个酵母细胞的延时荧光图像，提取相关的细胞大小和表达量数据，校正细胞追踪与谱系分配，并利用市售的微流控培养装置和多功能图形用户界面（GUI）对细胞随时间变化的行为进行分析。尽管此前已有多种方法用于实验操作、图像分割和细胞追踪11,13,14，但上述流程旨在使这些技术更易于被更广泛的生物学研究群体所采用。虽然本方案针对特定的微流控培养装置进行了优化，但随着即用型微流控培养技术成本降低且可定制性增强，整体分析流程也可适配于类似的装置。本质上，我们所采用的图像分割与区域测量算法与现有方法相似13,14，但GRAFTS软件增加了对区域追踪和谱系分配进行可视化校正的能力，并能准确标注细胞周期阶段。这两项功能对于精确计算数据序列的时间导数至关重要。
在实验方案中有多个步骤会显著影响最终时间序列数据的质量。最初向培养室接种过多细胞会降低室内的灌注效率（在动力学实验中尤其明显，因为培养室更新时间至关重要），并导致实验过程中细胞过早过度生长...

基因表达的单细胞分析加深了我们对基因调控多个方面的理解。利用流式细胞术或显微镜获取荧光报告基因表达的静态图像，可提供有关单细胞表达分布的有用信息，但缺乏直接揭示基因表达动态所必需的时间序列数据的历史与演化过程。荧光延时显微镜技术则能够同时获得单细胞测量结果及其时间历程。目前已开发出多种实验与分析技术，用于获取并量化荧光报告基因表达的动态影像，从而揭示基因调控的多种特征（参见1以了解综述），例如细胞间的变异2,3、细菌持留态形成4、转录起始与延伸5、转录爆发6,7、细胞周期依赖性8,9以及可遗传性10。然而，获得高质量的单细胞荧光时间序列数据在技术上仍面临重大挑战，包括在可控环境中培养单层细胞，以及对获取的荧光影像进行高通量量化。本文介绍了一种无需具备细胞培养装置制造或软件开发经验即可获取和分析S. cerevisiae荧光影像的实验流程（图1）。
首先，我们详细介绍一种用于生成表达一种或多种荧光报告蛋白的芽殖酵母荧光时间序列影像的示例性实验方案。尽管此前已有研究成功构建并使用了定制的微流控培养室 11-13我们使用 CellAsic（美国加利福尼亚州海沃德）生产的商用微流控装置。该系统可将细胞限制在单层生长状态，并实现对灌注环境的持续调控。本文所介绍的显微镜检测方案是一种获取芽殖酵母荧光录像的简便方法，但也可根据任何经修改的实验方案（如定制的培养装置、不同的培养基条件等）进行调整。 等等可替换为产生相似单个酵母细胞荧光影像数据的方法。
接下来，我们介绍如何使用基于图形用户界面（GUI）的 MATLAB（Mathworks，Natick，MA）软件包对录像进行分析，该软件包被称为荧光时间序列快速分析图形界面（GUI for Rapid Analysis of Fluorescence Time Series, GRAFTS），用于提取单个细胞的时间序列数据。GRAFTS 在细胞分割与追踪、荧光强度及几何信息提取方面具有与多功能开源软件包 Cell-ID14 类似的功能。然而，GRAFTS 提供了若干重要的附加功能。首先，它支持对分割和追踪结果进行便捷的交互式编辑，以验证数据的准确性，而不仅仅是在分析后通过统计门控方式排除异常区域轨迹。此外，该软件可将分析扩展至自动指定出芽酵母的谱系关系及细胞周期中的关键时间点。确定母细胞与子细胞分裂形成两个独立细胞区域的时间，对于在整个细胞周期中获取完整细胞（包括母细胞及其连接的芽体）的测量数据至关重要8。该软件套件包含三个模块以完成上述任务。第一个模块基于聚焦与非聚焦明场图像之间的对比度对细胞区域进行分割，并允许用户定义和可视化测试分割参数。第二个模块通过时间序列追踪（采用 Blair 和 Dufresne 基于 Crocker et al. 的 IDL 程序开发的 MATLAB 实现，可访问网址：<a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a>）并测量细胞区域，自动分配谱系关系，并支持可视化检查与错误校正。该模块还包含一个简单的绘图 GUI，用于查询单细胞特性。第三个模块用于判定芽体出现和分裂的时间，并输出完整细胞的时间序列数据及其一阶和二阶时间导数（如文献9所述）。分析模块将数据输出为以空格分隔的文本文件，以便在用户选定的统计软件中进一步分析。因此，该软件包使用户能够通过图形界面提取高质量的时间序列数据。我们已利用该方法估算了单个出芽酵母细胞在细胞周期进程中实时转录速率的变化9。尽管这些模块针对出芽酵母进行了优化，但相关参数或必要时其自由开放的代码可被调整，以适用于其他生物体和图像类型。分割、追踪和谱系分配算法可能因成像方式和具体生物体而异。现有算法可被替换，但仍可保留图形用户界面，以便对任何算法不可避免产生的分割与追踪错误进行直观、用户友好的视觉检查与修正。

<table><tbody><tr><td>Y04C 酵母灌流板</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX 微流控灌流平台</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 油镜 DIC 物镜</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Cascade II EMCCD 相机</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200 金属卤化物弧光灯</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三通带通二向色滤光片立方体及激发与发射滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>set #89006</td><td>用于 YFP (Venus/Citrine)、CFP (Cerulean)、RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>MAC 5000 控制器及滤光轮</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>64 位版本处理大型数据文件优于 32 位版本</td></tr></tbody></table>

获取芽殖酵母荧光延时成像并利用grafts分析单细胞动态

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

荧光延时显微镜已成为在单细胞水平研究多种生物学过程的有力工具。特别是，展示基因表达时间依赖性的动态图像可揭示其调控机制的动力学特征；然而，在获取和分析单细胞荧光动态图像方面仍存在诸多技术挑战。本文介绍一种简便的实验方案，利用市售的微流控培养装置获取此类数据，并结合基于 MATLAB 的图形用户界面（GUI）软件包对荧光图像进行定量分析。该软件可实现细胞的分割与追踪，允许用户通过可视化方式校正数据中的错误，并自动分配谱系关系和细胞分裂时间。GUI 还可进一步分析时间序列，生成全细胞荧光轨迹及其一阶和二阶时间导数。尽管该软件最初是为 S. cerevisiae 设计的，但其模块化和多功能性使其只需少量修改即可作为研究其他细胞类型的通用平台。

成功执行并分析的实验将获得大多数单个完整细胞的连续时间序列数据，并合理分配芽体出现和分裂时间。例如，我们使用表达由组成型 ADH1 启动子驱动的整合型蓝色荧光蛋白（CFP）的单倍体酵母菌株执行了上述方案，以观察单个细胞中生长和全局表达随时间的变化情况（表4，Y47）。我们进行了时间序列分析，以获得随时间变化的全细胞（图7A）测量值，结果发现体积和表达均呈现出与细胞周期相关的依赖性，这与文献9中的发现一致。芽体形成后，总体积（母细胞 + 芽体）的增长速度比芽体出现前更快（与文献8,16结果一致），而蛋白质浓度或平均荧光强度则略有下降（图7B 和 7C）。总的整合蛋白量（此处为体积 × 浓度）的上升也在出芽后加快（图7D）。与仅分析母细胞区域的结果（图7B&amp;D）相比，这些结果表明在全细胞测量中正确纳入芽体贡献的重要性，并凸显了准确确定芽体形成和分裂时间的必要性。正如我们此前报道的<sup...

我们提供了一种简单的实验方案，用于获取酵母细胞生长过程的荧光显微镜视频，以及一个基于图形用户界面的软件包，用于提取单细胞时间序列数据。该分析方法结合了自动化的谱系追踪与分裂时间分配，并整合了可视化检查及对追踪数据的手动校正。

获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

荧光延时显微镜已成为在单细胞水平研究多种生物学过程的有力工具。特别是，视频……

本实验的总体目标是获得单个酵母细胞生长过程中的荧光动态图像，并提取每个细胞的报告基因表达时间序列。该目标首先通过在微流控腔室中培养单层细胞来实现，第二步则是对一个或多个报告基因进行延时荧光显微成像。接下来，使用 graft 软件包对电影图像进行处理，以随时间追踪并测量细胞。最后一步是分析细胞测量结果和谱系分配，并导出每个完整细胞的报告基因表达时间序列。最终，通过表达时间序列推断出的瞬时转录速率可用于展示转录在细胞周期中的变化以及对转录因子水平变化的响应。该方法有助于回答基因调控领域中的关键问题，例如不同启动子对活性转录因子的突然添加或去除的响应速度有多快？在细胞群体中，这种响应的变异性如何？包括形态学特征和细胞周期时相在内的不同细胞特性如何影响该响应？此外，该方法还可用于探究多次添加和去除活性转录因子对基因表达的影响。按照文本方案中的描述，准备处于营养丰富、稳态生长条件下且密度适合上样至微流控装置的酵母细胞。随后，从 CellASIC 获取 Y04C 微流控培养板，使用 Onyx 灌注系统除去运输溶液后，用无菌水冲洗板孔：以 6 PSI 压力让水流经第 1 至第 6 孔 5 分钟，以冲洗通道，然后以 6 PSI 压力从上样孔（第 8 孔）流过 10 秒钟。移除所有孔中的水，将进样孔（第 1 至第 6 孔）替换为 250 微升 SC 培养基，细胞上样孔中加入 50 微升制备好的细胞培养物。第八步，将黑玉色多路接头密封到板上，并通过入口孔1至6以6 PSI压力持续灌注2分钟，开始对通道和培养室进行预处理。随后，仅从装有起始培养基的入口孔以6 PSI持续灌注至少5分钟。在整个实验过程中保持6 PSI的持续流动，并将板用胶带固定在显微镜载物台上，以防止其移动，从而在数据分析期间提高细胞追踪效果。按照文本方案中所述准备显微镜后，在物镜上滴加数滴浸油，并牢固安装微流控装置。在倒置显微镜的载物台上，使用其中一个嵌入式位置标记，聚焦于第一个培养腔最左侧的三分之一区域。关闭培养基进液孔的流体，然后以6 PSI的压力、每次5秒的脉冲模式关闭第8个细胞加样孔的流体。移动载物台，在培养腔内观察细胞分布情况。增加上样流速和压力，直至达到所需细胞密度，但应避免过度加载以及堵塞最左侧新鲜培养基进入腔室的屏障。从含有起始培养基的培养基入口孔开始，以6 PSI的压力进行灌注。在Metamorph或其他显微镜自动化与控制软件中操作。设置多维采集程序，以在多个时间点对多个载物台位置进行成像。设定时间点的数量及时间间隔，然后选择多个载物台位置，每个位置约包含10个细胞。设置采集程序，使得在每个载物台位置和每个时间点，程序均使用 MetaMorph 内置的自动对焦方法，通过在每个载物台位置开始时运行自定义编写的脚本实现对透射光明场图像的自动对焦，从而提供更精确的对焦控制。同时，设置程序在焦平面以上 1 µm 处采集明场图像，并在焦平面以下 4 µm 处采集离焦的明场图像。根据需要在图像之间切换，使用自定义编写的日志来调整焦点。最后设置程序，在焦平面上为每个荧光报告分子采集一幅灰度图像。使用针对快速采集且光漂白最小化的优化设置。在 Onyx 控制软件中为实验准备流体程序。然后同时启动 Metamorph 中的采集程序和 Onyx 控制软件中的流体程序。在 MATLAB 中运行 format data M 文件，以打开数据输入的图形用户界面（GUI）。在界面顶部，指定或浏览至包含图像文件的文件夹，以设置数据目录，然后使用该图形界面指定实验中记录的数据类型和图像文件。接着根据文本方案中描述的内容选择分割参数。为明场图像的分割选择合适的参数可能较为困难，并且对最终获得的时间序列数据质量有显著影响。我们的重点是识别所有细胞区域，在分割时优先考虑过度分割而非分割不足。在进行视觉数据检查时，过度分割的区域可以合并形成完整的细胞区域，但分割不足的区域之后无法再进行拆分。设置不同的分割参数，通过点击“测试成功”来检验分割质量。分割出的区域将显示为绿色，并带有品红色边框。当分割效果满意时，务必使用滑块在视频中检查多个时间点。选择“完成”以将分割参数返回到格式化数据界面。按照文中所述选择颜色参数后，点击“自动阈值”按钮，以自动确定阈值。采用Tzu的方法，图像将高亮显示高于阈值的保留区域。可通过编辑框手动调整阈值。使用滚动条确认该阈值适用于所有时间点。确认无误后，点击“完成”。要将阈值返回至“格式化数据”图形界面，请点击“添加”和“分割”。要创建颜色掩膜，请点击“格式化数据”以读取图像文件，处理数据并在指定文件夹中创建点阵文件。该文件将作为“处理时间序列”图形界面的输入。在 MATLAB 中运行过程时间序列 M 文件以打开追踪图形用户界面。打开界面后，首先设置腔室高度，该数值表示细胞被捕获所在的腔室高度。它被用作根据细胞区域的长轴和短轴将细胞体积近似为三维椭球体时的约束条件。然后设置每像素对应的微米数。该转换系数用于校准图像中像素与微米之间的距离，从而使横截面积和体积分别以平方微米和立方微米为单位进行校准。接下来，使用滤镜面板设置最小和最大参数，以滤除掩膜中的无效区域。面积表示区域的像素数。ECC 为偏心率因子，其值越接近零，形状越接近圆形。其中SF为形状因子，其值越接近1，形状越接近圆形。在文件输入输出面板中单击加载图像，并选择由Format Data GUI输出的目标.mat数据文件。区域掩膜将应用于每个颜色通道，并进行多种不同的测量。然后按照文中所述选择“追踪细胞”参数，保存数据文件。单击跟踪细胞，使用区域OID在连续帧之间跟踪区域，为新出现的芽分配谱系，并保存数据。根据需要在弹出窗口中更改参数。系统通过最小化假定芽体与潜在母细胞之间的距离，自动分配谱系。每一帧均进行此处理。单击所选细胞信息面板上方的按钮，使用文中方案所述的各种黏性工具或快捷键，对分割效果不佳的区域以及细胞 ID 或谱系分配中的错误进行校正，以正确整理数据。合并任何过度分割的区域，删除未能完整捕获整个细胞的区域，并确保母细胞-芽细胞关系得到正确分配。同时，通过合并区域消除所有绿色 ID。固定 id，将区域分配给母细胞，或不分配母细胞，或删除该区域。由于在最终的最终分析中，芽的将被添加到其母细胞的数据中，因此请勿将芽区域与其母细胞合并。目视检查每个时间帧的数据，直至最后一个关注时间点。无需检查整个时间序列。若不使用后续帧，请确保在完成所有感兴趣时间段内细胞区域的检查后，及时保存更改。此时，所有荧光通道的数据及其随时间变化的情况均已准备就绪，可进行输出。推动时间序列分析，以分析随时间变化的全细胞时间序列数据。计算细胞周期信息并进行微分运算。此时将弹出一个窗口，允许选择感兴趣的测量指标并输入分析参数。在图形用户界面中输入已整理的最后一个时间点。默认的平滑和细胞周期分配参数适用于以五分钟间隔成像的单倍体和二倍体菌株，但为了获得最佳结果，这些参数可能需要进行调整。当所有参数设置完成后，选择“分析”以导出单细胞时间序列数据，具体方法如文本方案所述。成功执行并分析的实验将获得大多数连续的单个完整细胞时间序列数据，并为表达由 DH 一个启动子组成型驱动的整合拷贝 Ian 荧光蛋白或 CFP 的裂殖酵母菌株，合理地分配出萌发和分裂时间。随时间变化的完整细胞测量值来自时间序列分析。明场图像中，蓝色显示分割出的母细胞，绿色显示其出芽。以红色勾勒出连续的完整细胞，可观察到细胞体积和表达均依赖于细胞周期。其中，着色区域表示细胞处于SG2M期，出芽始于G1至S期的过渡阶段，即由白色变为灰色的时期。在芽体形成后，从M期到G1期的过渡阶段发生明暗变化和细胞分裂，即从灰色阴影变为白色阴影。总体积的增加速度比之前更快，但蛋白质浓度或平均强度略有下降。与仅母细胞区域相比，出芽后总整合蛋白量的上升速度也加快。这些结果表明，正确地将芽体贡献纳入全细胞测量具有重要意义，同时强调了准确判断芽体形成和分裂时间的必要性。通过对时间序列进行微分，可计算瞬时相对 mRNA 水平和转录速率，二者在出芽后均呈现上升趋势，从而能够生成稳定的时间信号。测量时间序列的导数也有助于利用本文实验方案中所述的可切换表达系统开展动力学研究。时间序列分析显示了转录因子在细胞核中的定位时间以及目标基因的启动和终止时间。此处展示的转录过程来自一个细胞的四个指定采集通道的显微图像，该细胞表达一种可切换的YFP融合PHO四聚TetR转录激活因子。该转录激活因子在低磷酸盐条件下会定位于RFP标记的细胞核，并驱动七重XTetO启动子控制的CFP报告基因的表达。推断的转录速率在平均值水平和单细胞水平上均随定位而变化。通过此流程，可对单细胞多维时间序列数据进行其他分析，以回答更多问题，例如：随时间推移，群体中的基因表达如何变化？外源性波动的影响是否会在多代之间遗传？基因激活动力学在重新激活时是否会发生变化？细胞周期是否发挥作用？以及其他许多需要通过单细胞基因表达动态和谱系轨迹来回答的问题。

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生物学

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酵母的4D显微成像

本文介绍了一种非毒性显微成像技术——活细胞成像，该方法可使研究人员在活体裂殖酵母细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，观察蛋白质行为及核动态变化。...

利用荧光活细胞显微镜观察裂殖酵母有丝分裂和减数分裂的核动态

此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。...

以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

学习利用荧光延时显微技术获取芽殖酵母单细胞电影，并通过Graft软件追踪细胞谱系、提取基因表达时间序列数据。该方法可分析细胞周期中的转录动态变化。

获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

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