一个人的3D组织工程在体外肿瘤测试系统

该程序的总体目标是在脱细胞的生物支架上构建原代细胞的 3D 肿瘤测试系统。这是通过首先使用脱细胞工艺制备支架来实现的，在该工艺中，猪 al 片段被泵入脱细胞溶液。第二步是使用标准分离方案从患者的活检中分离原代人细胞。

接下来，通过在一侧切开管状小肠粘膜下层，将其固定在两个金属环之间，并以规定的细胞密度接种肿瘤细胞和相关基质细胞来建立肿瘤测试系统。最后一步是在静态或动态条件下，在合适的设置中培养细胞加载的构建体。最终，免疫组织化学显微镜检查用于评估肿瘤生长的特征。

与 TT 肿瘤测试系统等现有方法相比，该技术的主要优点是，使用这种方法，可以创建比普通 2D 模型更准确地模拟肿瘤体内条件的 3D 组织模型。动态培养的优点是保持了细胞特异性。这种方法可以帮助回答肿瘤生物学领域的关键问题，例如癌细胞如何在 3D 环境中形成细胞细胞和细胞基质相互作用，这将有助于阐明癌症相关过程，例如肿瘤进展和转移。

该肿瘤测试系统中使用的生物血管化支架或 biova 来源于猪 jaal 节段。通过空心动脉通路用 PBS 冲洗猪段的血管系统和肠腔。重复直到完全干净。

准备一个直径为 200 毫米的玻璃水箱，带有四个适配器，并通过硅管将它们连接到蠕动泵。压力控制单元可以通过连接到无菌一次性圆顶的压力传感器进行监控。用脱细胞或 DZ 溶液填充储液瓶。

检查管道系统是否有气泡。用电缆扎带将肠腔连接到玻璃连接器，以实现管腔流动。将 500 毫升 DZ 溶液泵入血管系统的红动脉通路。

每 15 分钟中断一次泵送过程，以手动压出整个肠腔。在脱细胞过程中监测缓冲溶液的压力非常重要。压力应在 80 到 100 毫米汞柱之间，以自然血压为模型。

用 PBS 洗涤 biova，直到它没有细胞残留物并且维管结构完全呈白色。首先，用手术刀将皮肤活检切成 2 到 3 毫米宽的条状，然后用 PBS 溶液冲洗 3 次。将组织与 disbe 溶液孵育后，用两把镊子将表皮与真皮分离。

两者分别转移到装有 PBS 的培养皿中，以分离原代真皮微血管内皮细胞或 MV eecs 冲洗真皮条一次，在真皮条中加入 10 毫升 EDTA 溶液，并在 37 摄氏度下孵育 40 分钟。用 1% FCS 终止酶反应，并将皮肤条转移到充满 vascu life 的培养皿中。用手术刀在每侧刮出每条条带八次，增加一点压力以产生细胞悬液。

随后离心细胞悬液并复苏，用 vascu life 悬浮细胞沉淀。分离成纤维细胞。首先，用手术刀将真皮条切成小块。

将真皮块转移到 Falcon 管中，加入 10 毫升胶原酶溶液，在 37 摄氏度下孵育 45 分钟。接下来，离心溶液并小心去除上清液。用 DMEM 加 10% FCS 加 1% pen strep 洗涤沉淀。

离心后，小心去除上清液，将沉淀重悬于培养基中，并转移到 T 75 培养瓶中，让细胞从静态条件下孵育的组织生长出来。首先要设置肿瘤检测系统，切开管状小肠粘膜下层或 SIS 粘液，一侧打开并将其固定在两个金属环之间。这些自建细胞牙冠的直径为 10 毫米。

第二天在细胞培养基中覆盖 SIS mu 过夜，将初级 MVE CS 接种到 SIS 的基底后期表面，将前 CI.在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 3 小时。三小时后，用培养基填充孔，以确保浸没培养物并将其放回培养箱中。三天后让内皮细胞粘附三天。

将静态培养系统翻转 180 度，然后将其转移到 12 孔板中。接下来，在 SIS 的顶端表面看到原代真皮成纤维细胞和肿瘤细胞的混合物。前管腔的侧面。

让细胞粘附 3 小时。用培养基填充孔中，使培养物浸没，肿瘤试验系统在 37 摄氏度的静态条件下，5%二氧化碳再放置 14 天，每两至三天更换培养基进行动态培养。如前所述，修复两个金属环之间的 SIS mu 并播种主 MV eecs。

三天后，从金属环中取出 SIS mu，并用注射器和套管将膜插入流动反应器中。将原代真皮成纤维细胞和肿瘤细胞涂在生物反应器中的基质上。让细胞粘附 3 小时，然后在第二天用培养基填充生物反应器系统，将生物反应器放入自行构建的培养箱系统中，并将其连接到蠕动泵。

这种设置允许使用压力调节的脉动流或恒定流进行动态培养。在本实验中，使用 3.8 mL/min 的恒定介质流量。将动态培养物保持 14 天，7 天后更换培养基。

实验完成后，将组织固定、石蜡、包埋和染色，然后使用反向显微镜成像。代表性结果如下所示。图 A 概述了用 hemat tolin 染色的 2D 单一培养中静态培养的 S 4 62 肿瘤细胞系。

3D 共培养显示在图 B、C 和 D 中，该 H 和 e 染色图像显示了肿瘤细胞 S 4 62 和 SIS MU 和 MVEC 顶端侧原代成纤维细胞的三重培养。在基底外侧，箭头标记内皮细胞。通过对细胞类型特异性标志物进行染色，例如血管性血友病因子来标记 MVEC，如图 C 所示，P 53 阳性 S 4 62 细胞可以与 P 53 阴性原代成纤维细胞区分开来，并且可以以相同的方式分析细胞的 3D 分布。

在动态培养的三重培养组中可以识别不同的细胞类型，A 是 H 和 E 染色图像，其中箭头标记内皮细胞。图 B 显示血管性血友病因子的免疫组织学染色，图 C 显示 P 53 的染色 遵循此程序。可以进行其他方法，例如药物测试，以回答其他问题，例如如何找到新的癌症疗法或分析肿瘤发生中的重要信号通路。

此外，原代细胞可用于为个体患者定义最佳的个性化治疗。