生物传感器检测抗生素耐药金黄色葡萄球菌细菌

以下实验的总体目标是通过特别选择的抗改良裂解细菌噬菌体来区分甲氧西林耐药或 MRSA 和甲氧西林敏感或金黄色葡萄球菌的 MSSA 菌株。当细菌附着在裂解噬菌体的长而灵活的尾巴上时，附着的细胞与传感器表面之间的距离大于 QC m 声波的穿透力。因此，不会生成 binding 事件的信号。

用球体替换完整的噬菌体导致功能齐全的噬菌体具有短尾巴，它们在 QC m 声波的穿透深度内结合细菌，因此当噬菌体类固醇沉积在 A-Q-C-M-D 晶体上并暴露于混合细菌悬浮液时，它们会结合金黄色葡萄球菌的 MRSA 和 MSSA 菌株， 而不是将金黄色葡萄球菌与晶体表面的其他细菌分开的其他细菌。最后，当添加 Mr.RSA 特异性 PPP 两个 A 抗体结合珠时，在金黄色葡萄球菌 Mr.RSA 菌株存在下产生信号。与现有方法（如 PCR）相比，该技术的主要优点是该方法不需要 DNA 提取并且对经验不敏感。

虽然这种方法可以为口球菌的筛查和消毒提供见解，但它也可以应用于其他抗生素耐药细菌。这种方法的视觉演示至关重要，因为生物传感器的制造需要精度、准确性和耐心。首先通过在 Argonne 中等离子蚀刻 10 分钟清洁金编码石英片，然后在无菌柜中用 50 微升噬菌体悬浮液在无菌培养皿中对每块的金表面进行消毒后，在紫外线下对石英片进行消毒 6 小时，然后在第二天早上在室温下的潮湿室中孵育过夜， 去除剩余的噬菌体悬浮液进行滴度，然后用 PBS 洗涤每个带有结合噬菌体的石英片五次，以去除任何未结合的噬菌体。

要在干燥的表面上测试固定化噬菌体的感染性，首先将金黄色葡萄球菌的过夜培养物铺在 NZY eRate 上，并让悬浮液干燥。然后将带有固定化噬菌体的镀金石英片面朝下放在板上。在 37 摄氏度下放置 12 小时后，可以观察到指示感染性的裂解区，以测试液体中游离噬菌体的裂解活性。

首先，将金黄色葡萄球菌过夜细菌培养物添加到四个 300 毫升侧臂烧瓶中的每一个 10 毫升 NZY 中。然后将每毫升游离噬菌体的 6 个 PFU 中加入 2 乘以 10 的 2 个培养瓶中。现在，通过以 30 分钟的间隔测量每个培养瓶的光密度，监测葡萄球菌细胞裂解的时间进程 570 分钟，并在 24 小时进行最终测量。

为了测试结合噬菌体在液体中的裂解活性，重复刚刚演示的步骤，但将带有结合噬菌体的金片添加到实验瓶中，而不是游离噬菌体。为了制备噬菌体类固醇，首先在室温下将 400 微升噬菌体 1 2600 原液与等体积的光谱光度级氯仿混合到一个 1 毫升的小瓶中。接下来，在 1 分钟内以 5 秒的间隔轻轻涡旋噬菌体氯仿悬浮液 5 到 6 次。

让悬浮液稳定 30 秒后，收集含有类固醇悬浮液的顶部馏分。将几微升类固醇悬浮液转移到 500 微升小瓶中，用于透射和扫描电子显微镜检查。将剩余的类固醇悬浮液保存在 1 毫升小瓶中，用于生物传感器制造。

首先准备生物传感器时，在等离子清洗机中用氩气等离子体蚀刻 10 分钟来清洁 QCMD 传感器。然后用己烷冲洗传感器以去除任何有机杂质。接下来，按照 Olson Etal 之前在《微生物学方法杂志》中描述的那样清洁薄膜天平的槽。

用亚相溶液填充 LB 槽并用槽屏障清洁它。然后将槽稳定在 20 摄氏度 10 分钟。现在，小心滴注 300 微升 Eloqua 噬菌体 1 2600 水性悬浮液，在 LB 亚相溶液上形成噬菌体单层，该玻璃棒部分浸没在 SOPH 相中 让单层稳定 10 分钟后，以每分钟 30 毫米的速度压缩单层，直到达到每米 19 牛顿的恒定压力。

垂直薄膜沉积是此过程中最棘手的部分。为确保成功，需要确保该程序的所有组件都是干净的，并且还应优化单层沉积参数。现在以每分钟 4.5 毫米的速度连续将传感器浸入和浸出单层 7 次，以进行垂直薄膜沉积。

到垂直定位的 QCMD 传感器上。垂直薄膜沉积将完整的噬菌体结合到生物传感器表面。最后，使用制造的噬菌体生物传感器进行 MRSA 检测电子显微镜和游离和结合噬菌体的 el 验光。

通过使用 qof T 软件建立 QCM 传感器在水中的基线、共振频率和能量耗散来开始此步骤。约 30 分钟后，通过测试池在水中抽取活甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌或 MSSA 细菌细胞的悬浮液。蓝线显示频率值，而红线表示能量耗散水平。

水平线显示基线的建立。屏幕中间的数字 2 表示事件与传感器相关。四个中的第二个持续监测传感器的谐振频率和能量耗散的变化，以显示第一个泛音。

以下是细菌通过测试室后的变化。请注意，当传感器共振频率和内部能量耗散的变化达到 PVP 抗体偶联乳胶液悬浮液的饱和水平时，频率降低和能量耗散增加只需要几秒钟，并继续持续监测频率耗散。这里显示的是整个检测过程，显示了基线的建立、添加细菌后频率和能量耗散的几秒钟变化、饱和度，最后是添加珠子后的变化。

该表显示了针对所有测试的马里斯链球菌菌株的噬菌体裂解活性，包括噬菌体斑点试验所示的 MRSA 菌株。斑块大小通常在 5 到 15 毫米之间。未发现针对其他测试培养物的活性。

在这里，证明葡萄球菌 Urus A TCC 1 2600 在 NZ Y 培养基中在 37 摄氏度的摇床培养箱中正常生长，细菌数量从 3.2 乘以 10 增加到 6 到 4.0 乘以 10 再到每毫升 8 CFU。在大约 24 小时内，固定在金表面上的噬菌体表现出与悬浮液中噬菌体活性相似的裂解活性。即使在 24 小时生长实验中使用、多次洗涤并在 4 摄氏度的 PBS 中储存 6 天后，固定化噬菌体在新鲜细菌感染中仍具有传染性。

在这张图片中，可以观察到金片周围的溶酶体，表明固定化的噬菌体能够裂解细菌细胞。因此，如此处所示，在细菌和松动噬菌体的共培养中发现的细菌生长的有效减少是水悬浮细菌和结合噬菌体初级相互作用的结果。在这里，当噬菌体悬浮液经过氯仿处理时，显示了完整裂解噬菌体 1 2600 在金基材表面上的透射和扫描电子显微照片，噬菌体的尾部长度收缩并变厚，多边形头部变成圆形或类固醇。

尽管结构发生了重大变化。通过噬菌斑数测量的类固醇的裂解活性没有因氯仿处理而改变。带有固定化裂解噬菌体的 QCM 传感器在暴露于 MRSA 时，共振频率或能量耗散没有显着变化，表明 MRSA 噬菌体相互作用导致了 nom 质量变化。

然而，根据 QCM，分析后生物传感器的电子显微照片显示传感器表面有明显的细菌结合。当使用噬菌体类固醇生物传感器将 MRSA 混悬液注射到流通池中时，观察到频率显着降低和消散增加。在噬菌体球状细菌 MRSA 结合相互作用之后，将检测传感器暴露于 BBP 2 A 抗体偶联的乳胶快速悬液中。

这些 MRSA 测定生物传感器对 BPP 两种 A 抗体偶联的乳胶速悬浮液有反应，因为观察到频率的进一步降低和耗散的增加。使用扫描电子显微镜研究证实了 MSA 与噬菌体探针和 PPP 两个 A 抗体偶联乳胶的结合速度。当噬菌体类固醇生物传感器暴露于 MSSA 时，观察到噬菌体类固醇 MSSA 结合相互作用后频率的显着降低和耗散的增加，检测传感器受到 PPP 两种 A 抗体偶联的乳胶速度悬浮液的攻击。

最初，MSSA 测定生物传感器在 MSSA 和 PPP 两种 A 抗体偶联乳胶快速相互作用几分钟后显示出频率增加和耗散减少的短暂瞬变。然而，频率恢复到 PVP 后 2 A 抗体引入的水平，但 deci 能量增加。然后通过扫描电子显微镜分析 MSSA 与噬菌体探针的结合，但此处未观察到 MSSA 和 PPP 两种 A 抗体偶联乳胶速度之间的结合，显示了椭圆对称厚度剖面和裂解噬菌体的 3D 厚度图。

在厚度图上画一条线以生成厚度分布。这些最后的图像显示了与A-Q-C-M-D传感器的金表面结合的噬菌体捕获的MRSA的代表性CCD光学相机图像，以及MRSA在噬菌体固定的玻璃基材上的3D强度分布，浓度为每毫升10至8 CFU，每毫升10至9 CFU。每个圆代表一个细菌。

很明显，液体悬浮液中的细菌浓度从每毫升 10 到 8 CFU 增加到每毫升 10 到 9 CFU，导致 3D 强度曲线中捕获的细菌显着增加。顶层白色峰的数量与捕获的细菌数量成正比，正如预期的那样，当细菌暴露量从每毫升 10 个增加到 8 个到 10 个再到每毫升 9 个 CFU 时，峰的密度显着增加。底部的深蓝色层对应于与金底物接触的噬菌体层。

随着捕获的细菌越多，噬菌体的光学特性在与细菌结合时会发生变化，从而产生更深、更深的蓝色。按照这个程序，我们可以定义细菌捕获效率，以了解噬菌体细菌在发育后的相互作用。这项技术为噬菌体疗法领域的研究人员探索动物和人类的病原体抑制指明了道路不要忘记，在病原菌中使用有机溶剂可能非常危险，遵循严格的规定非常重要。