用于检测耐抗生素葡萄球菌的生物传感器

以下实验的总体目标是利用特别筛选的抗修饰性裂解性噬菌体，区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌（MSSA）菌株。当细菌附着于裂解性噬菌体的长而柔韧的尾部时，附着细胞与传感器表面之间的距离大于石英晶体微天平（QC m）声波的穿透深度，因此不会产生结合事件的信号。

用球状体替代完整的噬菌体，可获得具有短尾的完全功能性噬菌体，这些噬菌体能够结合到石英晶体微天平（QCM）声波穿透深度范围内的细菌。因此，当噬菌体类固醇沉积在A-Q-C-M-D晶体上并暴露于混合细菌悬液时，它们会选择性结合金黄色葡萄球菌的MRSA和MSSA菌株，而不结合其他细菌，从而将金黄色葡萄球菌从晶体表面的其他细菌中分离出来。最后，当加入针对MRSA特异性的PPP2A抗体包被的磁珠后，若存在金黄色葡萄球菌的MRSA菌株，则会产生检测信号。该技术相较于PCR等现有方法的主要优势在于无需进行DNA提取，且不受经验性因素干扰。

尽管该方法可用于金黄色葡萄球菌的筛选与消毒研究，但也适用于其他耐抗生素细菌的研究。该方法的可视化演示至关重要，因为生物传感器的制备需要精确性、准确性和耐心。首先，在氩气中通过等离子体刻蚀对金编码石英片进行10分钟的清洁处理，随后将石英片置于无菌柜中，在紫外光下灭菌6小时。灭菌后，在无菌培养皿中向每片石英的金表面加入50 µL噬菌体悬液，然后将石英片置于室温下的湿盒中孵育过夜。次日早晨，回收残留的噬菌体悬液用于滴定，随后用PBS缓冲液将结合了噬菌体的每片石英清洗五次，以去除未结合的噬菌体。

为了检测固定化噬菌体在干燥表面的感染能力，首先将一株金黄色葡萄球菌的过夜培养物涂布于NZY平板上，并让其悬液自然干燥。然后将带有固定化噬菌体的金镀膜石英片有噬菌体的一面朝下放置于平板上。在37摄氏度孵育12小时后，可观察到裂解圈，以评估游离噬菌体在液体中的裂解活性。

首先，将金黄色葡萄球菌的过夜细菌培养物分别加入四个 300 毫升侧臂烧瓶中的每一个，每个烧瓶内含 10 毫升 NZY 培养基。然后，向其中两个烧瓶中加入浓度为每毫升 2 × 10⁶ PFU 的游离噬菌体。接着，通过在 30 分钟时间间隔下测定光密度，监测每个烧瓶中金黄色葡萄球菌细胞裂解过程的时间进程，持续 570 分钟，并在 24 小时时进行最终测定。

为了检测液体中结合型噬菌体的裂解活性，重复上述已演示的步骤，但在实验烧瓶中加入带有结合型噬菌体的金片，而非游离噬菌体。制备噬菌体粗提物时，首先在室温下将400微升的噬菌体原液1 2600与等体积的分光光度级氯仿加入1毫升小瓶中。接着，在一分钟内，每隔五秒轻柔涡旋振荡噬菌体-氯仿悬浮液五至六次。

静置悬浮液30秒使其稳定后，收集含有类固醇悬浮液的上层部分。取几微升类固醇悬浮液转移至500微升样品瓶中，用于透射和扫描电子显微镜检测。将剩余的类固醇悬浮液保存在1毫升样品瓶中，用于生物传感器的制备。

首先制备生物传感器，将QCMD传感器置于等离子清洗机中，使用氩气等离子体刻蚀10分钟进行清洁。随后用正己烷冲洗传感器，以去除任何有机杂质。接下来，按照Olson等人在《微生物学方法杂志》中所述方法，清洁膜天平的槽体。

通过向朗缪尔槽（LB trough）中加入亚相溶液，并用槽屏障清洗。然后将槽在 20 摄氏度下稳定 10 分钟。现在通过倾斜的可食用玻璃棒，小心地将 300 微升的噬菌体 1 2600 水悬浮液滴加到 LB 亚相溶液上，形成单层膜，该玻璃棒部分浸没在 SOPH 相中。让单层膜稳定 10 分钟后，以每分钟 30 毫米的速率压缩单层膜，直至达到 19 牛顿每米的恒定压力。

垂直成膜沉积是该实验步骤中最关键的部分。为确保成功，必须保证该步骤中的所有组件均清洁无污染，同时需优化单分子层沉积参数。现在将传感器以每分钟4.5毫米的速度连续七次浸入并提拉出于单分子层溶液中，以完成垂直成膜沉积。

将垂直定位的QCMD传感器上。垂直成膜沉积可使完整的噬菌体结合到生物传感器表面。最后，利用制备的噬菌体生物传感器进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测，并对游离态和结合态的噬菌体进行电子显微镜和椭圆偏光测量分析。

使用 qof T 软件，首先在水中建立 QCM 传感器的基线、共振频率和能量耗散。约 30 分钟后，将水中活的甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）细胞悬液通过检测池。蓝线显示频率值，红线显示能量耗散水平。

水平线表示基线的建立。屏幕中央的数字 2 表示事件与传感器相关。四个数字中的第 2 个持续监测所示第一泛音的传感器共振频率和能量耗散的变化。

以下是细菌通过检测细胞后的变化。请注意，当传感器的共振频率和内部能量耗散达到饱和水平时，仅需几秒钟频率即下降，能量耗散则上升，此时聚乙烯吡咯烷酮（PVP）抗体偶联乳胶微球的悬浮液停止流动，继续对频率耗散进行连续监测。图中显示了整个检测过程，包括基线的建立、加入细菌后几秒钟内频率和能量耗散的变化、达到饱和状态，以及最后加入微珠后的变化。

本表格显示了噬菌体对所有测试的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA菌株）的裂解活性，结果由噬菌体斑点试验确定。噬菌斑大小通常在5至15毫米之间。未发现对其他测试菌株有裂解活性。

在此，展示了金黄色葡萄球菌 *Staphylococcus aureus* ATCC 12600 在 37 °C 条件下于摇床培养箱中于 NZY 培养基中的正常生长情况，细菌数量从 3.2 × 10⁶ 增加至 4.0 × 10⁸ CFU/mL。约 24 小时后，固定在金表面的噬菌体表现出与悬浮状态噬菌体相似的裂解活性。即使在 24 小时生长实验中使用后，经过数次洗涤并在 4 °C 的 PBS 中储存六天，固定化的噬菌体在新鲜的细菌感染中仍保持感染能力。

在此图像中，可以观察到金颗粒周围的溶酶体，表明固定的噬菌体具有裂解细菌细胞的能力。因此，如图所示，细菌与脱固定噬菌体共培养时观察到的细菌生长显著减少，是由于悬浮在水中的细菌与固定化噬菌体之间发生的初始相互作用所致。此处展示了裂解性噬菌体1 2600在金基底表面保持完整形态时的透射电子显微镜和扫描电子显微镜图像；当噬菌体悬液经氯仿处理后，噬菌体尾部长度缩短、变粗，多面体头部则变为圆形或类固醇状。

尽管发生了显著的结构变化，但通过噬菌斑数量测定的类固醇溶菌活性在氯仿处理后并未发生改变。固定了溶菌性噬菌体的QCM传感器在暴露于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）时，其共振频率和能量耗散均未发生显著变化，表明MRSA与噬菌体的相互作用未导致明显的质量变化。

然而，根据石英晶体微天平（QCM）结果，反应后生物传感器的电子显微图像显示传感器表面存在显著的细菌结合。当将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）悬液注入带有噬菌体类固醇生物传感器的流动池时，观察到频率显著下降，同时耗散明显增加。在噬菌体球形颗粒与MRSA细菌发生结合反应后，将检测传感器暴露于BBP二抗标记的乳胶微球悬浮液中。

这些耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测生物传感器对BPP二抗偶联乳胶微球悬浮液产生响应，表现为频率进一步降低和耗散增加。通过扫描电子显微镜研究，确认了MSA与噬菌体探针及PPP二抗偶联乳胶微球之间的结合。当噬菌体生物传感器暴露于甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（MSSA）时，在噬菌体-MSSA结合相互作用后，观察到频率显著下降和耗散增加；随后，检测传感器被进一步挑战以PPP二抗偶联乳胶微球悬浮液。

最初，MSSA 检测生物传感器在 MSSA 与 PVP 二抗偶联乳胶微球相互作用数分钟后，表现出频率升高和耗散降低的短暂变化。然而，频率恢复至加入 PVP 二抗后的水平，但耗散能量有所增加。随后通过扫描电子显微镜分析 MSSA 与噬菌体探针的结合情况，但在此未观察到 MSSA 与 PVP 二抗偶联乳胶微球之间的结合，图中显示了裂解性噬菌体的椭圆对称厚度分布图及三维厚度图。

在厚度图上画一条线以生成厚度分布曲线。最后这些图像显示了由结合在A-Q-C-M-D传感器金表面的噬菌体捕获的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的代表性CCD光学相机图像，以及在噬菌体固定化玻璃基底上浓度为10⁸ CFU/毫升和10⁹ CFU/毫升时MRSA的三维强度分布图。每个圆形代表一个单独的细菌。

显然，液体悬浮液中细菌浓度从每毫升10的8次方CFU增加到每毫升10的9次方CFU，会导致3D强度图谱中捕获的细菌数量显著上升。顶层白色峰的数量与捕获的细菌数量成正比，正如预期，当细菌暴露浓度从每毫升10的8次方增加到每毫升10的9次方CFU时，峰的密度显著增加。底部深蓝色层对应于与金基底接触的噬菌体层。

随着捕获的细菌增多，噬菌体在结合细菌后其光学性质发生变化，导致蓝色加深且更加浓重。通过该步骤，我们可在开发后定义细菌捕获效率，以理解噬菌体与细菌之间的相互作用。该技术为噬菌体治疗领域的研究人员探索病原体在动物和人体内的抑制作用提供了方向。切记，操作病原性细菌时使用有机溶剂可能具有极高危险性，严格遵守相关规范至关重要。