Name: 生物传感器检测抗生素耐药金黄色葡萄球菌细菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-08T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 学习利用裂解性噬菌体生物传感器和抗体微珠区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）的方法。该技术无需DNA提取即可实现快速检测。

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本研究工作得到了奥本大学AUDFS和美国空军CRADA 07-277-60MDG-01资助项目的资助。本文所表达的观点仅为作者观点，不代表美国空军、国防部或美国政府的官方政策或立场。

1. 准备工作
<ol>
	<li>获取模式菌株 S. aureus ATCC 12600 S. aureus ATCC 27690 和 枯草芽孢杆菌 ATCC 6051。耐甲氧西林菌株 S. aureus - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌2、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌5、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌13、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌26、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌34、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌45、 B. anthracis 斯特恩, 鼠伤寒沙门氏菌 LT2 志贺氏菌属弗氏志贺菌、耶尔森菌属肠道耶尔森菌、变形杆菌属奇异变形杆菌、克雷伯菌属肺炎克雷伯菌 13882；裂解性噬菌体 12600</li>
	<li>获取与PBP 2a抗体偶联的乳胶微珠。</li>
	<li>按所述方法制备NZY培养基 21.</li>
	<li>获取磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	<li>准备去离子水作为朗缪尔-布洛杰特（Langmuir-Blodgett，LB）单层膜沉积的亚相。</li>
</ol>
2. 噬菌体的扩增与滴定
<ol>
	<li>在2 L三角瓶中，将5 ml过夜培养的金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 12600菌液（3.6 × 108 菌落形成单位（CFU）/ml）与500 μl噬菌体（3 × 109 PFU/ml）加入500 ml NZY培养基中，于37 °C摇床培养箱中振荡培养过夜。</li>
	<li>在4 °C条件下，以4,424 × g离心培养物10分钟。</li>
	<li>将上清液再次在4 °C条件下以11,325 × g离心10分钟。</li>
	<li>使用0.22 μm Millipore滤膜过滤上清液。</li>
	<li>将滤液在75,395 × g离心1.5小时。</li>
	<li>用100 μl蒸馏水重悬沉淀。</li>
	<li>用NZY培养基对噬菌体悬液进行10倍系列稀释。</li>
	<li>将过夜（ON）培养的金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 12600菌液各1 ml涂布于2块NZY琼脂平板表面，确保完全覆盖平板表面。吸除多余菌液，室温静置干燥30分钟。</li>
	<li>取适当稀释度的噬菌体悬液10 μl点样于平板表面，于37 oC培养18–24小时。</li>
	<li>观察噬菌斑形成情况并计算噬菌体滴度。噬菌体滴度（T）根据每10 μl噬菌体悬液（v）在平板上形成的噬菌斑数量（N）及稀释倍数（F）估算。滴度计算公式为：T = N / (v × F)。例如，当稀释度为10-7、点样体积为10 μl（10 × 10-3 ml）时，若观察到75个噬菌斑，则滴度为75 / (10 × 10-3 × 10-7) = 7.5 × 1010 噬菌斑形成单位（PFU）/ml悬液。</li>
</ol>
3. 金固定的噬菌体
<ol>
	<li>将镀金石英片（60 mm2）在氩气中进行10分钟的等离子体刻蚀清洗，然后在无菌操作台中用紫外光照射6小时以灭菌。</li>
	<li>在无菌培养皿中，向每片石英片的镀金表面加入50微升浓度为1 × 109 PFU/ml的噬菌体悬液，并在室温下的湿盒中孵育过夜。</li>
	<li>回收未吸附的噬菌体悬液并测定其滴度。</li>
	<li>用PBS洗涤已结合噬菌体的石英片5次，以去除未结合的噬菌体。</li>
</ol>
4. 干燥表面固定化噬菌体感染性的检测
<ol>
	<li>将金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 12600 的过夜培养物涂布于 NZY 琼脂平板上，静置使其干燥。</li>
	<li>将固定有噬菌体的金片朝下放置于平板表面。</li>
	<li>在 37 °C 培养 12 小时后观察溶菌圈，以确认噬菌体的感染活性。</li>
	<li>对照实验中使用未固定噬菌体的覆金片。</li>
</ol>
5. 检测游离及结合噬菌体在液体中的裂解活性
<ol>
	<li>在四个300 ml侧臂烧瓶中的每一个中加入10 ml NZY培养基，并接种处于对数生长期的S. aureus ATCC 12600（每瓶终浓度为6 × 106 CFU/ml）。</li>
	<li>向其中两个烧瓶中加入终浓度为2 × 106 PFU/ml的游离噬菌体。</li>
	<li>另两个烧瓶作为对照组。</li>
	<li>通过每30分钟测定一次光密度（OD600），连续监测所有烧瓶中S. aureus细胞裂解的时间进程，持续570分钟。</li>
	<li>在24小时时进行最后一次测定。</li>
	<li>重复步骤5.1–5.5，但使用结合了噬菌体的金颗粒代替游离噬菌体，并在对照烧瓶中使用未结合噬菌体的金颗粒。</li>
</ol>
6. 孵育过程中结合噬菌体的丢失
<ol>
	<li>在无菌培养皿中的金片表面加入 50 μl 浓度为 1 × 109 PFU/ml 的噬菌体，并将培养皿置于湿润环境中，室温孵育过夜。</li>
	<li>移除金片表面未结合的噬菌体悬液，并测定滴度。</li>
	<li>用 PBS 缓冲液将结合了噬菌体的金片清洗 5 次，然后放入含有 1 ml NZY 溶液的 15 ml 离心管中，在摇床培养箱中 37 °C 振荡孵育 8 小时。</li>
	<li>按照步骤 2 中所述方法测定脱落噬菌体的滴度。</li>
</ol>
7. 噬菌体球状体制备
<ol>
	<li>在1 ml小瓶中，将400 μl的噬菌体12600储备液（1011 PFU/ml）与等体积的分光光度级氯仿在室温下混合。</li>
	<li>在1分钟内轻轻涡旋噬菌体-氯仿悬浮液5至6次（每次间隔5秒）。</li>
	<li>让悬浮液静置30秒，然后用移液器吸取含有球状体的上层相，用于单层膜制备。</li>
	<li>取少量球状体悬浮液用于透射和扫描电子显微镜观察。</li>
	<li>使用剩余的球状体悬浮液进行生物传感器的制造。</li>
</ol>
8. 生物传感器制备
<ol>
	<li>使用PDC-32G Harrick等离子清洗仪，在氩气中对QCM-D传感器进行10分钟的等离子体刻蚀清洗。</li>
	<li>用正己烷冲洗传感器，以去除任何有机杂质。</li>
	<li>按照文献22所述方法准备并清洁膜天平的槽体。</li>
	<li>向LB槽中加入亚相溶液，并使用槽屏障进行清洁，将槽体温度稳定在20±0.1 °C。</li>
	<li>将300 μl噬菌体12600的水相悬浮液（1011 PFU/ml）铺展到LB亚相表面。</li>
	<li>通过将300 μl噬菌体12600水相悬浮液（1011 PFU/ml）沿部分浸入亚相的倾斜润湿玻璃棒流下，从而在LB亚相溶液上形成噬菌体单层膜22,23。</li>
	<li>将制备好的单层膜稳定10分钟，然后以30 mm/min（45 cm2/min）的速率压缩，直至达到19 N/m的恒定压力。</li>
	<li>以4.5 mm/min的速率将QCM-D传感器垂直浸入和提出单层膜七次，实现垂直膜沉积。在接触细菌样品前对沉积的噬菌体单层膜进行电子显微镜观察，结果显示膜层连续、均匀且均一（数据未显示）。</li>
	<li>使用在3中制备的噬菌体球状悬浮液，重复步骤4.5–4.8。</li>
	<li>将制备的噬菌体生物传感器用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测、电子显微镜观察和椭圆偏振测量。</li>
</ol>
9. 耐甲氧西林与敏感型葡萄球菌的生物传感器检测与区分
<ol>
	<li>在此方案中，制备了含有未修饰及修饰噬菌体和噬菌体球状体的生物传感器。采用具有四个传感流路腔室的石英晶体微天平，监测细菌与固定于QCM传感器表面的噬菌体之间的结合反应。使用PBP 2a抗体偶联的乳胶微球来区分耐甲氧西林（MRSA）与甲氧西林敏感的葡萄球菌。所有测量均在流动模式下（50 μl/min）于5 MHz条件下进行。</li>
	<li>在水中建立QCM传感器的基线共振频率（约30分钟）。</li>
	<li>吸取悬浮于水中的活体甲氧西林敏感型葡萄球菌细胞（109 CFU/ml）通过检测池。</li>
	<li>使用 Q-Soft 软件持续监测传感器在第一泛音模式下的共振频率和能量耗散变化。</li>
	<li>当传感器的共振频率和耗散变化达到饱和水平时，加入PBP抗体偶联的乳胶微球悬浮液（6.77×10⁷）10 珠粒/mL）加入流动相中，同时持续监测频率和耗散。</li>
	<li>对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）细胞重复步骤 9.2–9.5。</li>
	<li>通过细菌结合引起的质量变化，利用Sauerbrey方程定义频率变化 24,25 Δf = -Δm xn/C，其中 C 是质量灵敏度常数（C=17.7 纳克 × 厘米-2 x Hz-1 在 5 MHz 时）， m 是质量 n 为泛音序号（n = 1).</li>
	<li>定义能量耗散变化（ΔD）来自的 记录振荡的指数衰减（频率和振幅衰减），从而量化一个振荡周期内耗散和储存的能量， E消散 和 E储存分别：ΔD = E消散 / 2πE储存. ΔD 以耗散单位（DU）测量，1 DU = 10-6 相对单位</li>
</ol>

<ol><li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+using+lytic+phage+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).</li>
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<li>Sorokulova, I., Watt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+biopolymer+for+preservation+of+microorganisms+during+sampling+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage.</a> J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

众所周知，噬菌体可作为细菌病原体的生物传感器探针28。本研究证明，噬菌体与PBP 2a抗体联用，能够解决一个长期存在的难题：快速区分抗生素耐药菌株与敏感菌株。
然而研究发现，普通的未经修饰的葡萄球菌噬菌体不适合用于QCM设备的细菌检测，即使它们能够结合细菌。噬菌体的尾部过长，导致声波无法“触及”结合在噬菌体尾部末端的细菌。这种情况导致了“缺失质量”效应29，即使电镜图像（图3A和3B）显示存在显著的结合，仍无法检测到共振频率和耗散的变化。这一问题通过用球状体替代完整的噬菌体得以轻松解决，球状体是经氯仿-水处理修饰后的噬菌体。该处理使噬菌体转变为具有短而粗且无柔性的尾部，但仍保持完全功能（图2D、2E和2F）。当生物传感器中使用球状体替代噬菌体后，QCM-D设备可轻松检测到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。
当噬菌体颗粒以适当的方向结合到金表面时，其受体可与宿主细菌发生接触。如果带有噬菌体的固体表面与干燥的细菌层发...

耐甲氧西林菌株 金黄色葡萄球菌 已被认为是导致原发性感染和医院内暴发的重要因素 4-8常见的耐甲氧西林检测方法，如纸片扩散法、苯唑西林琼脂筛选试验或肉汤微量稀释法，均依赖特定的培养条件以增强耐药性的表达。这些条件的调整包括使用苯唑西林、在30或35 °C而非37 °C下孵育，以及在培养基中添加氯化钠。此外，为确保这些技术的准确检出，需要24小时的较长孵育时间，而非通常的16至18小时。具有适当准确性的快速检测技术&gt;96%）的敏感性水平用于鉴定耐甲氧西林耐药性，包括自动化微量稀释技术，例如 Vitek GPS-SA 卡、Rapid ATB Staph 系统和 Rapid Microscan Panel 系统，这些方法在 3–11 小时内出具结果 9-11. 晶体MRSA鉴定系统是一种基于识别生长情况的快速方法 S. aureus 在含2% NaCl和每升4 mg苯唑西林的条件下，使用氧敏感型荧光传感器进行检测。据称，在培养4小时后，敏感性范围为91%至100% 12-14这些表型方法在准确性上受到普遍存在的、具有异质性耐药特性的菌株的影响，因此，目前公认最可靠的检测甲氧西林耐药性的方法是针对mecA基因的PCR或DNA杂交技术。 15然而，该技术需要纯化的DNA，且对多种混合物（杂质）极为敏感，其中包括细胞碎片16.
此外，这些技术需要较长的时间才能完成。针对mecA基因产物PBP 2a蛋白的检测策略可用于判定耐药性，与标准检测方法相比可能更为可靠17。
先前的研究表明，噬菌体12600可作为识别包括耐甲氧西林菌株在内的Staphylococcus aureus菌株的识别探针1,2,18。在本研究中，我们提出了一种用于特异性识别和检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的新技术，能够实现实时识别细菌并确认其是否为MRSA。为此，我们联合使用了一种宿主谱广泛的S. aureus噬菌体与针对PBP 2a蛋白的单克隆抗体。PBP 2a是一种细胞壁蛋白，是MRSA产生抗生素耐药性的原因。然而，PBP 2a抗体并不特异于S. aureus，因为其他一些细菌也含有与PBP 2a序列相似的抗生素结合蛋白19,20。因此，在本研究中，我们同时采用了S. aureus噬菌体和抗PBP 2a蛋白的抗体。为了构建能够特异性检测和鉴定MRSA的生物传感器，我们采用了一种具有两步作用机制的装置。第一步使用S. aureus噬菌体单分子层作为传感探针，第二步则使用针对PBP 2a的特异性抗体。因此，第一步可识别S. aureus细菌，而第二步则对抗生素结合蛋白具有敏感性。当两个步骤均产生阳性信号时，即可确认为MRSA的特异性检测。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS） </td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>分光光度级氯仿 </td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>154733</td><td>（99.8% A.C.S.） </td></tr><tr><td>己烷-无水 </td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州</td><td>29609-0</td><td>(95%)</td></tr><tr><td>乙醇 </td><td>Pharmco产品公司，康涅狄格州布罗克菲尔德</td><td>64-17-5</td><td>190 证明</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PBP 2a 抗体偶联乳胶微球</td><td>日本东京，德卡精工株式会社</td><td>MRSA-Screen 检测</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. aureus&lt;/em&gt; ATCC 12600 &lt;em&gt;S. aureus&lt;/em&gt; ATCC 27690 和 &lt;em&gt;枯草芽孢杆菌&lt;/em&gt; ATCC 6051 来自 </td><td>美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA）；</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45 &lt;em&gt;B. anthracis&lt;/em&gt; 斯特恩, &lt;em&gt;鼠伤寒沙门氏菌&lt;/em&gt; LT2 &lt;em&gt;志贺氏菌属弗氏志贺菌、耶尔森菌属肠道耶尔森菌、变形杆菌属奇异变形杆菌、克雷伯菌属肺炎克雷伯菌&lt;/em&gt; 13882；裂解性噬菌体 12600 </td><td>阿拉巴马州奥本市奥本大学的菌种保藏中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心 </td><td>贝克曼库尔特</td><td>Optima L-90K 超速离心机</td><td></td></tr><tr><td>KSV 2200 LB 膜天平</td><td>KSV Chemicals，芬兰</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜光学系统 </td><td>CitoViva Technology Inc.，阿拉巴马州奥本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D</td><td>Q-Sense AB, V&amp;#228;stra Fr&amp;#246;隆德，瑞典</td><td>E4</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>JEOL USA Inc.，美国马萨诸塞州皮博迪</td><td>JEOL-7000F 扫描电子显微镜</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜（TEM）</td><td>JEOL USA Inc.，美国马萨诸塞州皮博迪</td><td>JEOL，JEM 2010</td><td></td></tr><tr><td>Stericup，预灭菌</td><td>默克密理博公司，比勒里卡，马萨诸塞州</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &amp;mu;m，GP Express PLUS 膜</td></tr><tr><td>生物测定皿</td><td>NUNC A/S，丹麦</td><td>240835</td><td>尺寸（毫米），245 × 245 × 25</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson，Pipetman，法国</td><td>P100、P200、P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 恒温振荡培养箱</td><td>新不伦瑞克科学公司，康涅狄格州</td><td>经典 C24</td><td></td></tr><tr><td>镀金石英片</td><td>阿拉巴马州奥本大学</td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Brand，美国</td><td>0875713</td><td>100 mm × 15 mm </td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company, ME</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>培养用生长瓶</td><td>康宁公司，纽约</td><td>4995</td><td>PYREX 250 ml 锥形瓶 </td></tr><tr><td>光学光谱仪</td><td>Genesys 20. Thermo Spectronic，美国</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma，美国</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 水纯化系统</td><td>Millipore</td><td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>成像椭偏仪</td><td>美国 Accurion</td><td>纳米膜_ep&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;se</td><td></td></tr><tr><td>软件 </td><td>Q-Sense AB，瑞典</td><td>QSoft，QTools</td><td></td></tr></tbody></table>

用于检测耐抗生素葡萄球菌的生物传感器

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

一种结构转化的裂解性噬菌体，具有广泛的Staphylococcus aureus菌株宿主范围，并结合了青霉素结合蛋白（PBP 2a）抗体偶联的乳胶微珠，已被用于构建一种生物传感器，旨在区分耐甲氧西林（MRSA）和甲氧西林敏感（MSSA）的S. aureus菌种1,2。该裂解性噬菌体通过与水-氯仿界面接触转化为噬菌体球状体。噬菌体球状体单层通过朗缪尔-布洛杰特（Langmuir-Blodgett, LB）技术转移至生物传感器表面3。所构建的生物传感器采用带耗散监测的石英晶体微天平（QCM-D）进行检测，以评估细菌与噬菌体之间的相互作用。细菌与球状体的结合导致MRSA和MSSA菌株均出现共振频率降低和耗散能量升高。在细菌结合后，这些传感器进一步暴露于青霉素结合蛋白抗体乳胶微珠中。经MRSA检测的传感器对PBP 2a抗体微珠产生响应，而经MSSA检测的传感器则无响应。该实验差异实现了对耐甲氧西林与敏感型S. aureus菌株的明确区分。无论结合态还是游离态的噬菌体均能抑制表面及水悬浮液中的细菌生长。一旦裂解性噬菌体转化为球状体，其仍保持强烈的裂解活性，并表现出高效的细菌捕获能力。噬菌体及其球状体可用于耐药微生物的检测与灭菌。其他应用可能包括噬菌体治疗及抗菌表面的开发。

噬菌体对所有测试的S. aureus菌株（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA菌株）均表现出裂解活性，噬菌斑点试验结果证实了这一点。噬菌斑大小通常在5至15 mm之间。对其他测试菌株未发现裂解活性（表1）。
S. aureus ATCC 12600 在 37 °C 条件下于摇床培养箱中的 NZY 培养基内正常生长情况如图 1A所示（以空心圆圈标记的曲线）。细菌数量从 3.2 × 106 增加至 4.0 × 108 CFU/mL。图 1A（以实心圆圈标记的曲线）显示了将 2.0 × 106 PFU/mL 游离噬菌体与相同浓度的S. aureus ATCC 12600 同时加入后共培养的结果。固定在金表面的噬菌体表现出与悬浮状态噬菌体相当的裂解活性（图 1A，以倒三角标记的曲线）。当携带噬菌体的金片首次用于 24 小时生长实验后，经 ...

裂解性噬菌体生物传感器和抗体微珠能够区分耐甲氧西林（MRSA）和敏感型葡萄球菌。通过朗缪尔-布洛杰特法将噬菌体固定在石英晶体微天平传感器表面，作为广谱葡萄球菌探针。抗体微珠可特异性识别MRSA。

一种结构发生改变的裂解性噬菌体，具有广泛的金黄色葡萄球菌菌株宿主范围，以及一种青霉素结合蛋白（PBP 2a）……

本实验的总体目标是利用特别筛选的抗修饰型裂解性噬菌体，区分耐甲氧西林或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）与对甲氧西林敏感或甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（MSSA）菌株。当细菌附着于裂解性噬菌体的长而柔韧的尾部时，附着细胞与传感器表面之间的距离大于石英晶体微天平（QCM）声波的穿透深度，因此不会产生结合事件的信号。用球形体替代完整的噬菌体后，可获得具有短尾的完全功能性噬菌体，这些噬菌体能够结合细菌，并处于石英晶体微天平（QCM）声波的穿透深度范围内。因此，当噬菌体固醇沉积在A-Q-C-M-D晶体表面并暴露于混合细菌悬液时，它们会选择性结合金黄色葡萄球菌的MRSA和MSSA菌株，而不结合其他细菌，从而将金黄色葡萄球菌与其他细菌在晶体表面分离开。最后，当加入针对MRSA特异性PPP2A抗体结合的磁珠后，若存在MRSA菌株的金黄色葡萄球菌，即可产生检测信号。该技术相较于PCR等现有方法的主要优势在于：无需进行DNA提取，且不受经验性因素影响。尽管该方法可为耳葡萄球菌的筛选和消毒提供参考，也可应用于其他耐抗生素细菌的研究。该方法的可视化演示至关重要，因为生物传感器的制备需要精确性、准确性和耐心。首先，在氩气环境中对金编码石英片进行等离子体刻蚀处理10分钟以清洁表面，随后将石英片置于无菌操作台中经紫外光照射灭菌6小时。灭菌后，在无菌培养皿中向每片石英的金表面加入50 µL噬菌体悬液，然后将石英片置于室温下的湿盒中孵育过夜。次日早晨，回收残留的噬菌体悬液用于滴定，并用PBS缓冲液将每片结合了噬菌体的石英片清洗五次，以去除未结合的噬菌体。为了检测固定化噬菌体在干燥表面的感染能力，首先将一株金黄色葡萄球菌的过夜培养物涂布于NZY eRate培养基上，并让其悬液自然干燥。然后将带有固定化噬菌体的一面朝下放置在培养基上的金镀膜石英片。在37摄氏度孵育12小时后，可观察到裂解圈，以评估游离噬菌体在液体中的裂解活性。首先，在四个 300 毫升侧臂烧瓶中的每一个加入 10 毫升 NZY 培养基和 1 份金黄色葡萄球菌的过夜细菌培养物。然后，向其中两个烧瓶中加入每毫升 2 × 10⁶ PFU 的游离噬菌体。接着，通过每 30 分钟测量一次光密度，连续监测 570 分钟内每个烧瓶中金黄色葡萄球菌细胞的裂解过程，并在 24 小时时进行最终测量。为了检测液体中结合型噬菌体的裂解活性，重复上述已演示的步骤，但在实验烧瓶中加入带有结合型噬菌体的金片，而非游离噬菌体。制备噬菌体类固醇时，首先在室温下将400 µL的噬菌体原液1 2600悬浮液与等体积的分光光度级氯仿混合至一个1 mL的小瓶中。接着，在一分钟内，以每5秒一次的频率轻轻涡旋振荡噬菌体-氯仿悬浮液5至6次。待悬浮液稳定30秒后，收集含有类固醇悬浮液的上清部分。取数微升类固醇悬浮液转移至500微升样品瓶中，用于透射和扫描电子显微镜检测。将剩余的类固醇悬浮液保存在1毫升样品瓶中，用于生物传感器的制备。首先制备生物传感器，将QCMD传感器置于等离子清洗机中，使用氩气等离子体刻蚀10分钟进行清洁。随后用正己烷冲洗传感器，以去除任何有机杂质。接下来，按照Olson等人在《微生物学方法杂志》（Journal of Microbiological methods）中所述的方法，清洁膜天平的槽体。通过在 LB 亚相槽中加入亚相溶液，并用槽屏障进行清洁。然后将槽在 20 摄氏度下稳定 10 分钟。现在通过倾斜的可食用玻璃棒，将 300 微升噬菌体 1 2600 的水悬浮液（Eloqua）小心滴加到 LB 亚相溶液上，形成单层膜，其中玻璃棒部分浸没在 SOPH 相中。待单层膜稳定 10 分钟后，以每分钟 30 毫米的速度压缩单层膜，直至达到 19 牛顿每米的恒定压力。垂直成膜沉积是该实验步骤中最关键的部分。为确保成功，必须保证该步骤的所有组件均清洁，并且单分子层沉积参数已优化。现在，将传感器以每分钟4.5毫米的速度连续进出单分子层溶液七次，以完成垂直成膜沉积。将垂直定位的QCMD传感器进行操作。垂直成膜沉积可使完整的噬菌体结合到生物传感器表面。最后，利用制备的噬菌体生物传感器对游离态和结合态噬菌体进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测、电子显微镜观察以及椭圆偏光测量分析。使用 qof T 软件，首先在水中建立 QCM 传感器的基线、共振频率和能量耗散。约 30 分钟后，将水中活的耐甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌（MSSA）细胞悬液通过检测池。蓝色线条显示频率值，红色线条显示能量耗散水平。水平线表示基线的建立。屏幕中央的数字 2 表示事件与传感器相关。四个数字中的第二个持续监测所示第一泛音的传感器共振频率和能量耗散的变化。以下是细菌通过检测细胞后发生的变化。请注意，当传感器的共振频率和内部能量耗散达到饱和水平时，频率下降和能量耗散增加仅需几秒钟即可发生；此时聚乙烯吡咯烷酮（PVP）抗体偶联乳胶微球的悬浮液停止流动，继续对频率耗散进行连续监测。图中显示了整个检测过程，包括基线的建立、加入细菌后几秒钟内频率和能量耗散的变化、达到饱和状态，以及最终加入微珠后的变化。本表格显示了噬菌体对所有测试的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA菌株）的裂解活性，结果由噬菌体斑点试验确定。噬菌斑大小通常在5至15毫米之间。未发现对其他测试菌种有裂解活性。在此，展示了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 12600）在37摄氏度、NZY培养基中振荡培养时的正常生长情况，细菌数量从每毫升3.2 × 10⁶上升至4.0 × 10⁸ CFU。约24小时内，固定于金表面的噬菌体表现出与悬浮状态噬菌体相似的裂解活性。即使在24小时的生长实验中使用后，经过多次洗涤并在4摄氏度的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存六天，固定化的噬菌体在新鲜细菌感染中仍保持感染能力。在此图像中，可以观察到金颗粒周围的溶酶体，表明固定的噬菌体具有裂解细菌细胞的能力。因此，如图所示，细菌与失活噬菌体共培养时观察到的细菌生长显著减少，是由于悬浮在水中的细菌与固定化的噬菌体之间发生了直接相互作用。此处展示了完整的裂解性噬菌体 1 2600 在金基底表面的透射和扫描电子显微照片；当噬菌体悬液经氯仿处理后，噬菌体的尾部缩短并增粗，多面体头部则变为圆形或类固醇状。尽管发生了显著的结构变化，但通过噬菌斑数量测定的类固醇溶菌活性在氯仿处理后并未改变。固定了溶菌性噬菌体的QCM传感器在暴露于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）时，其共振频率和能量耗散均未发生显著变化，表明MRSA与噬菌体的相互作用未导致明显的质量变化。然而，根据石英晶体微天平（QCM）结果，反应后生物传感器的电子显微镜图像显示传感器表面存在显著的细菌结合。当将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）悬液注入带有噬菌体类固醇生物传感器的流动池时，观察到频率显著下降，同时耗散增加。在噬菌体球形细菌与MRSA结合反应后，将检测传感器暴露于BBP two A抗体偶联的乳胶微球悬液中。这些耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测生物传感器对BPP二抗偶联乳胶微球悬浮液产生响应，表现为频率进一步降低和耗散增加。通过扫描电子显微镜研究，证实了甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（MSA）与噬菌体探针以及PPP二抗偶联乳胶微球之间的结合。当噬菌体类固醇生物传感器暴露于甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（MSSA）时，噬菌体类固醇与MSSA结合后，观察到频率显著下降和耗散增加；随后，检测传感器被进一步挑战以PPP二抗偶联乳胶微球悬浮液进行测试。最初，MSSA检测生物传感器在MSSA与PPP二A抗体偶联乳胶微球相互作用数分钟后，表现出频率升高和耗散降低的短暂变化。然而，频率恢复至加入PVP二A抗体后的水平，但耗散能量有所增加。随后通过扫描电子显微镜分析MSSA与噬菌体探针的结合情况，但在此未观察到MSSA与PPP二A抗体偶联乳胶微球之间的结合。图中显示了裂解性噬菌体的椭圆对称厚度分布图及三维厚度图。在厚度图上画一条线以生成厚度分布曲线。最后这些图像展示了由结合在A-Q-C-M-D传感器金表面的噬菌体捕获的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的代表性CCD光学相机图像，以及在噬菌体固定化玻璃基底上浓度为10⁸ CFU/毫升和10⁹ CFU/毫升时MRSA的三维强度分布图。每个圆形代表一个单独的细菌。显然，液体悬浮液中细菌浓度从每毫升10的8次方CFU增加到每毫升10的9次方CFU时，会导致3D强度图谱中捕获的细菌显著增多。顶层白色峰的数量与捕获的细菌数量成正比，正如预期，当细菌暴露浓度从每毫升10的8次方CFU增加到每毫升10的9次方CFU时，峰的密度显著上升。底部深蓝色层对应于与金基底接触的噬菌体层。随着捕获的细菌增多，噬菌体在结合细菌后其光学性质发生变化，导致颜色变深，呈现出更浓的蓝色。通过该步骤，我们可在开发后定义细菌捕获效率，以理解噬菌体与细菌之间的相互作用。该技术为从事细菌噬菌体治疗研究的科研人员探索病原体在动物和人体内的抑制作用提供了方向。切记，操作有机溶剂和病原菌时可能具有极高危险性，严格遵守安全规范至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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设计一种简便的单日工作流程方案用于细菌病原体诊断，可实现对血流感染的快速识别。该方案包含八种临床相关细菌靶标及其抗生素耐药谱，可使临床医生在同一天内获得初步诊断信息，从而有助于制定更为恰当的治疗方案。...

从血培养中检测细菌病原体及进行抗菌药物耐药性测试的一日工作流程方案

我们描述了一种用于快速检测和鉴定细菌的电化学传感器分析方法。该分析方法采用经DNA寡核苷酸捕获探针功能化的传感器阵列，该探针针对核糖体RNA（rRNA）的物种特异性序列。目标rRNA与捕获探针及辣根过氧化物酶标记的DNA寡核苷酸检测探针发生夹心杂交反应，产生可测量的安培电流。...

使用电化学传感器进行细菌检测与鉴定

来源：Zhang, M. 等，通过受激拉曼散射成像检测单个细菌中氘掺入实现快速抗菌药物敏感性测试。J. Vis. Exp.

使用受激拉曼散射显微镜检测细菌对抗生素的敏感性

本视频展示了一种阻抗生物传感器检测方法，用于研究抗体与固定在换能器芯片上的靶抗原之间的相互作用。该生物传感器经工程化设计，含有一种双功能嵌合蛋白——即一个具有功能性催化位点的β-内酰胺酶，与一个可结合固定化靶抗原的纳米抗体相融合。当发生结合后，β-内酰胺酶对抗生素底物的催化水解反应产生电信号，从而确认抗原-抗体的相互作用。...

基于β-内酰胺酶的电导率生物传感器检测蛋白质-蛋白质相互作用

介绍了一种用于快速检测细菌的无标记光学生物传感器。该生物传感器基于纳米结构的多孔硅，设计用于将目标细菌细胞直接捕获到其表面。我们将单克隆抗体固定在多孔换能器上，作为捕获探针。研究结果表明，该生物传感器可在数分钟内检测出低浓度细菌，且无需对样品进行预处理（如细胞裂解）。...

光学检测 大肠杆菌 多孔硅生物传感器检测细菌

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芯片上应激诱导的抗生素敏感性测试

大多数细菌感染都会形成生物膜。由于其所处的环境，与生物膜相关的细菌通常在表型上具有耐药性。因此，开发能够杀灭生物膜中细菌的新型抗菌分子成为当务之急。我们建立了一种检测方法，用于快速筛选可有效清除生物膜的抗菌化合物。...

使用基于刃天青的药物敏感性检测靶向生物膜相关Staphylococcus aureus

在本研究中，我们报道了一种基于杂合β-内酰胺酶技术的电导型生物传感器新方法，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该方法依赖于β-内酰胺水解过程中质子的释放。...

基于β-内酰胺酶的导电生物传感器检测法用于检测生物分子相互作用

本文介绍了一种利用分子印迹技术结合电容型生物传感器检测和定量复杂溶液中低丰度分子的实验方案。...

基于分子印迹电容型生物传感器的生物标志物超灵敏检测

基于液滴的微流控平台有望用于高通量实验，因其能够以千赫兹速率低成本生成皮升级、自成隔室的微小反应容器。通过与快速、灵敏且高分辨率的荧光光谱方法相结合，可高效地提取、利用并整合这些系统中产生的大量信息。...

微流控液滴平台的荧光检测方法

学习利用裂解性噬菌体生物传感器和抗体微珠区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）的方法。该技术无需DNA提取即可实现快速检测。

用于检测耐抗生素葡萄球菌的生物传感器

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