Name: 新生小鼠皮肤干细胞分化成生殖细胞 em在体外 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 了解如何利用新生小鼠皮肤来源的体细胞干细胞在体外分化培养基中诱导形成卵母细胞样细胞。该方法通过实时PCR检测卵母细胞特异性标志物表达，为生殖生物学研究提供重要实验模型。

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PWD 得到了加拿大卫生研究院（CIHR）博士后奖学金以及加拿大卫生研究院向西安大略大学 Gerald M. Kidder 提供的基金资助。作者还要感谢圭尔夫大学的 Julang Li 在本方案开发过程中提供的帮助。

1. 培养基制备	
	<ol>
	<li>在使用前 2-3 小时配制培养基，并将瓶盖略微松开后放入即将进行实验的细胞培养箱中。本方案中使用的培养基：
		<ol>
			<li>配制干细胞培养基，成分为添加了 1× B27、40 ng/ml bFGF 和 20 ng/ml EGF 的 DMEM/F12 培养基。</li>
			<li>配制生殖细胞分化培养基，成分为添加了 0.05 IU FSH、0.03 IU LH、3 mg/ml BSA、5 μl/ml ITS、0.23 mM 丙酮酸钠、1 mg/ml 胎球蛋白和 1 ng/ml EGF 的 m199 培养基。可预先配制不含 FSH、LH 和 EGF 的基础培养基，于 4 °C 保存，最多可保存一周。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
	2. 干细胞培养准备	
	<ol>
		<li>从小鼠幼崽中分离干细胞，方法如前所述12使用第2至第4代的干细胞进行 体外 生殖细胞分化。卵母样细胞（OLC）形成的效率与起始干细胞的质量直接相关。通常在细胞传至第二代左右，群体呈现干净健康状态时，即应开始分化。若将干细胞继续培养超过第二代，会负面影响OLC形成的效率（未发表结果）。</li>	 
	 <li>在启动分化前 48 小时对干细胞进行传代培养。使用血清移液管将培养皿中所有悬浮的球形细胞聚集体及用过的培养基转移至 15 ml 离心管中。需注意仅收集悬浮的球形细胞聚集体，避免收集已贴壁于培养皿底部并自发分化的细胞。</li>	 
	 <li>在500 × g离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于500 μl预热至37 °C的新鲜干细胞培养基中。轻轻吹打聚集体以实现细胞的部分解离。切勿剧烈吹打细胞，以免降低细胞活力。将部分解离的细胞转移至含9.5 ml预热的全新低吸附10 cm细胞培养皿中的新鲜干细胞培养基中。</li>	 
	 <li>将细胞放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 细胞培养箱中孵育48小时，然后开始诱导分化。</li>	
	</ol>
	3. OLC 分化	
	<ol>
		<li>使用血清学移液管将干细胞从培养皿中吸出，转移至15 ml离心管中，弃去任何贴壁细胞。在500 × g条件下离心收集细胞，并用500 μl无菌PBS重悬。使用宽口1,000 μl枪头剧烈吹打细胞，使其形成不超过10–20个细胞的细胞团块。在解离过程中，定期取出少量细胞，在白光显微镜下观察，确认聚集的细胞为10–20个单个细胞组成的团块。过度解离将导致细胞活力下降。</li>	 
		<li>向解离后的细胞中加入9.5 ml PBS，取15 μl该细胞悬液加入血细胞计数板进行细胞计数。在500 × g条件下离心5分钟收集细胞。</li>	 
	 <li>将细胞以1.32×106 cells/ml的浓度重悬于分化培养基中。</li>	 
	 <li>每孔加入500 μl细胞悬液，接种至平底24孔悬浮培养板中。</li>	 
	 <li>将24孔板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养48小时。从每孔中移除250 μl培养基，转移至相应标记的1.5 ml离心管中。向每孔加入250 μl新鲜分化培养基。将废弃的培养基在500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。将离心所得的细胞沉淀用50 μl新鲜分化培养基重悬，并加回至分化板中对应的培养孔。</li>	 
	 <li>每隔48小时更换一半培养基，直至分化第12天。</li>	
	</ol>

<ol><li>van den Hurk, R., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+mammalian+oocytes+and+their+growth%2C+differentiation+and+maturation+within+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles.</a> Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).</li>
<li>Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+analysis+of+living+mouse+germ+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration.</a> Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).</li>
<li>Lawson, K. A., Hage, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+origin+of+primordial+germ+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found+Symp%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse.</a> Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).</li>
<li>Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cells+in+the+mouse+embryo+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation.</a> Development. 110, 521-528 (1990).</li>
<li>Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+oocytes+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells.</a> Science. 300, 1251-1256 (2003).</li>
<li>Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+can+form+germ+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells can form germ cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).</li>
<li>Wang, L., Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-like+Cells+Induced+from+Mouse+Spermatogonial+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells.</a> Cell Biosci. 2, 27(2012).</li>
<li>Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+germline+potential+of+stem+cells+derived+from+fetal+porcine+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin.</a> Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).</li>
<li>Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+oocyte-like+cells+from+a+clonal+pancreatic+stem+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line.</a> Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).</li>
<li>Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP15+gene+is+activated+during+human+amniotic+fluid+stem+cell+differentiation+into+oocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells.</a> DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).</li>
<li>Song, S. H., Kumar, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+porcine+multipotent+stem%2Fstromal+cells+derived+from+skin%2C+adipose%2C+and+ovarian+tissues+and+their+differentiation+in+vitro+into+putative+oocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells.</a> Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).</li>
<li>Dyce, P. W., Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+germ+line+potential+of+stem+cells+derived+from+newborn+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin.</a> PLoS One. 6, e20339(2011).</li>
<li>Linher, K., Dyce, P., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cell-like+cells+differentiated+in+vitro+from+skin-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells.</a> PLoS One. 4, e8263(2009).</li>
<li>Hayashi, K., Ogushi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offspring+from+Oocytes+Derived+from+in+Vitro+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice.</a> Science. , (2012).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

迄今为止，尚未利用完全 体外 检测。最近，由 Hayashi 进行的一项研究 等 能够从形成的 PGC 样细胞产生后代 体外 并转移 体内 用于进一步开发14从胚胎干细胞或诱导性多能干细胞出发，他们能够生成类似原始生殖细胞的细胞，这些细胞在经回收后 体内 移植的卵母细胞能够成熟、受精，并用于产生后代 14这表明，在适当条件下，不同来源的干细胞具有形成功能性卵母细胞的潜力。	
	培养体系的某些方面对其功能至关重要。用于分离干细胞的小鼠品系非常关键。本方案使用的是杰克逊实验室（Jackson Lab）的 B6 小鼠（货号 #008214）。这些小鼠携带 Oct4-EGFP 转基因，可通过 EGFP 蛋白可视化表达 Oct4 的细胞。当使用 CD1 小鼠的干细胞尝试该方案时，效率显著降低，OLC 的形成也更不可靠。目前即使使用 B6 小鼠，OLC 形成的效率仍然较低。在启动生殖细胞分化之前，所使用的干细胞应处于第 2 至第 4 代，因为使用更晚代次的细胞时...

在早期胚胎发生过程中，配子发生通过一系列阶段进行，包括原始生殖细胞（PGC）的形成、迁移，最终定植于性腺嵴。在此期间，PGC经历增殖并逐步分化为更为成熟的配子1。由于PGC从尿囊基部迁移至胚胎后肠，再沿背侧壁移动，最终定植于性腺嵴，这一过程使其极难研究2。尽管该领域已取得进展，但PGC的数量稀少、位置深在以及迁移特性，仍严重阻碍了对其形成与分化机制的研究3,4。	
	近年来，已发现胚胎干细胞具有形成生殖细胞的潜力 体外 5,6同样，多种体细胞干细胞也被证明具有形成生殖细胞的潜能，继而 体外 培养 7-11最近，从新生小鼠皮肤中分离的干细胞被诱导分化 体外 转化为类生殖细胞和早期卵母细胞 12分化过程中，表达Oct4的干细胞亚群增加，并形成类似卵丘-卵母细胞复合体的结构。可从培养物中挑选卵母细胞样细胞（OLCs）并与天然卵母细胞进行比较。采用此培养方法可获得直径为40–45 μm、表达类似于卵母细胞标志物的OLCs，例如 Gdf9b，VASA 和 DAZL。迄今为止，所获得的卵样细胞（OLCs）仍无法成熟或受精 12.	
	尽管OLCs仍无法发挥功能，但用于形成这些OLCs的方案可能仍可作为一种检测手段，用于研究封闭环境中早期生殖细胞的形成与发育过程 体外 系统。最初讨论由体细胞干细胞形成OLCs的研究使用了胎猪皮肤作为干细胞来源 8在该研究的基础上，进一步发现诱导分化早期形成的 PGC 样细胞是 OLC 的前体细胞，并表达 OCT4、VASA、STELLA、C-KIT 和 DAZL 等 PGC 标志物。 13该数据支持利用此系统研究生殖细胞形成与分化的潜力 体外本视频文章将演示从小鼠新生皮肤形成OLCs所采用的实验方案。该方案提供了一种 体外 研究生殖细胞发育的模型，可能为阐明其增殖和分化相关的重要因素提供途径。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>胎球蛋白</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>925</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD</td><td>352095</td><td></td></tr></tbody></table>

新生小鼠皮肤来源干细胞体外分化为类生殖细胞 in vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

研究生殖细胞的形成与分化一直非常困难，主要是由于细胞数量稀少且位于发育中胚胎的深层部位。“封闭”系统的可用性 体外 基于该系统可能对我们理解配子发生过程具有重要价值。本视频方案展示了从小鼠新生皮肤中分离的体细胞干细胞形成卵母细胞样细胞（OLCs）的过程。所获得的OLCs表达多种与卵母细胞一致的标志物，例如 Oct4，Vasa，Bmp15，以及 Scp3然而，由于无法完成减数分裂，这些细胞仍不能经历成熟或受精过程。本方案将提供一个可用于研究生殖细胞早期形成及其向更成熟配子分化的系统。在早期分化过程中，表达 Oct4（具有潜在生殖样细胞特征）的细胞数量可达约 5%，但目前卵样细胞（OLCs）的形成效率仍然相对较低。该方案整体较为简便，但需特别注意确保起始细胞群体健康且处于早期传代阶段。

最初，细胞会附着在培养皿底部并铺展开来。在分化开始后的42-72小时，会出现少量悬浮的OCT4阳性细胞，并开始增殖（图1A）。这些细胞出现后不久，大部分将消失，而贴壁细胞则在培养皿底部形成致密的集落样细胞团。数天后，这些细胞团将从培养表面脱落。在部分脱落的细胞团中，可观察到一个较大的细胞（图1b 和 图1c）。初次观察时，这些细胞的直径约为35 μm。随着持续培养，卵母细胞样细胞（OLCs）将逐渐生长至直径约45 μm。这些即为卵母细胞样细胞，可连同支持细胞一起收集，或经胰蛋白酶消化以获得未附着其他细胞的纯OLCs（图1d）。
为了确认OLCs表达与天然卵母细胞相似的转录本，可收集OLCs并检测其相关标志物的表达情况，例如 Zpc、Scp3、Cmos、Oct4、Bmp15，以及 Vasa。尽管 Oct4 和 Vasa 在未分化的干细胞中表达多种标志物，例如 Bmp15<...

近年来，利用多种不同类型的体细胞干细胞，已通过体外培养方法实现了生殖细胞的形成。本文将直观展示由新生小鼠来源的干细胞分化为早期卵母细胞样细胞的过程。

新生小鼠皮肤来源干细胞体外分化为类生殖细胞 In vitro

研究生殖细胞的形成与分化历来非常困难，原因在于细胞数量稀少，且其位置深藏于发育中的组织内部……

以下实验的总体目标是利用体表皮肤来源的干细胞形成卵母细胞样细胞。该目标通过使用来自新生小鼠皮肤的纯净未分化干细胞来实现。第二步是将干细胞解离，以使其为后续分化做好准备。接下来，将干细胞接种于特定的分化培养基中。为了诱导生殖细胞的形成，实验结果通过半定量实时PCR显示卵母细胞特异性标志物的表达。该方法有助于回答生殖生物学领域内的关键科学问题。为了提供一个用于研究生殖细胞、类胚体形成与发育的封闭系统，本方案所需的所有培养基均应在使用前两到三小时预先配制，并将瓶盖略微松开后放入即将进行实验的细胞培养箱中。此处使用的两种培养基分别为：干细胞培养基，由D-M-A-M-F 12组成，添加B 27、BFGF和EGF；以及生殖细胞分化培养基，由M1 99组成，添加FSH、LH、B-S-A-I-T-S、丙酮酸钠、tuin和EGF。干细胞来源于新生小鼠。在第二至第四代时使用幼鼠进行体外生殖细胞分化。由于类细胞或卵样细胞（OLC）形成的效率与起始干细胞的质量直接相关，因此最好在细胞群体看起来干净且健康时立即开始分化。通常在传代2约48小时前，使用血清移液管将干细胞进行传代，去除培养皿中所有悬浮的球形细胞团和用过的培养基，并将其放入15毫升离心管中。重要的是仅收集悬浮的球形细胞团，而不收集已自发分化并贴壁于培养皿底部的细胞。在500 × g条件下离心细胞5分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于500 µL新鲜干细胞培养基中。升温至37 °C。轻轻吹打聚集体，使细胞部分解离。切勿剧烈吹打细胞，以免降低细胞活力。将部分解离的细胞在低吸附10厘米细胞培养皿中，用9.5毫升新鲜预热的干细胞培养基洗涤。然后将细胞放回37摄氏度、5%CO2的细胞培养孵箱中培养48小时。开始OLC分化实验时，使用移液管将培养皿中的干细胞吸出，并转移至15毫升离心管中。弃去任何贴壁残留的细胞。在500 × g条件下离心5分钟以收集细胞，弃去上清液，用500微升无菌PBS重悬细胞，并使用宽口1000微升枪头用力吹打细胞，使其形成细胞团块，每个团块不超过10至20个细胞。为了确保本实验方案的成功，必须在解离过程中定期检查解离程度，以保证达到适当的解离水平。定期取出少量细胞，在白光显微镜下观察，确认聚集体为由10至20个单个细胞组成的细胞团。切勿过度解离，以免导致细胞活力下降。接下来，向解离的细胞中加入 9.5 毫升 PBS，取 15 微升该细胞悬液转移至血细胞计数板进行细胞计数。在 500 × g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。弃去上清液后，将细胞重悬于分化培养基中，调整细胞浓度至每毫升 1.32 × 10⁶ 个细胞。将细胞接种到平底24孔悬浮培养板中，每孔加入500微升。将24孔板置于37摄氏度、5%CO2的细胞培养箱中培养48小时。48小时后，从每孔中移除250微升培养基，并转移至相应标记的1.5毫升离心管中。向每个孔中加入 250 µL 新鲜分化培养基，将用过的培养基在 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于 50 µL 新鲜分化培养基中。将细胞悬液返回至相应的培养孔中，置于分化培养板内。每 48 小时更换一半培养基，操作方式相同，直至分化第 12 天为止。在早期分化阶段，细胞会贴附于培养皿底部并铺展开来。此代表性图像显示了分化42至72小时后OCT4阳性的细胞。未分化干细胞的标记物呈绿色，细胞核经Hirst复染，呈蓝色。随着分化过程的进行，可观察到一些细胞聚集体中存在OCT4阳性细胞（绿色标记），周围环绕着OCT4阴性细胞。该图像的标尺为100微米。此图显示的是从培养表面脱离后类似卵泡结构的明场图像，标尺代表40微米。随着持续培养，LCS 的直径将生长至约 45 微米。本图像中的比例尺代表 10 微米。大的 OCT4 阳性 LCS 可见于被细胞包围或在培养物中单独存在。这些卵母样细胞（LCS）可通过支持细胞或胰蛋白酶消化眼球来收集，以获得未附着其他细胞的LCS。为了确认这些LCS表达的转录本与天然卵母细胞（OO）位点相似，研究人员收集了LCS并检测了常见卵母细胞位点标志物的表达，例如ZP3、SCP3、C-MOS、BMP15和vasa。该图显示了10个LCS中这些标志物的转录水平相对于10个新生小鼠卵母细胞的表达水平。结果显示，LCS 表达的 ZPC 少于 cytes。由于 ZPC 是 cyte 特异性 zop lucidum 膜结构的一个组分，这或许可以解释 LCS 膜的脆弱性及其较薄的 zita 膜。与天然 cytes 相比，LCS 中减数分裂 SCP3 的表达水平更高。然而，另一种减数分裂标志物CMOs的表达水平较低。这种表达水平的差异可能部分解释了LCS目前无法完成减数分裂的原因。其他标志物如BMP 15和vasa在lcs与O位点之间无显著差异。在进行该操作时，重要的是要记住，起始干细胞群体的健康状态对其成功至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

新生小鼠皮肤干细胞分化成生殖细胞<em在体外</em

胚胎生殖细胞在早期发育阶段分化为原始生殖细胞的能力，是研究我们关于癌症与不育假说的理想模型。本方案展示了如何从小鼠交配后10.5至11.5天胚胎的发育性性腺中分离原始生殖细胞。...

小鼠胚胎生殖细胞的分离与获取

本视频演示了一种方法 体外 从小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成神经前体细胞（NPCs）。将mESCs在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），随后诱导其分化为NPCs 通过...

一种从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞的技术

我们描述了小鼠胚胎皮肤的分离及ex...

离体 小鼠胚胎皮肤培养及黑素母细胞迁移的活体成像

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。...

小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

表皮角质形成细胞构成功能性皮肤屏障，在抵御外界环境侵害的宿主防御中处于前沿位置。本文介绍了从小鼠新生及成年皮肤中分离表皮角质形成细胞并进行原代培养的方法，以及诱导角质形成细胞终末分化和紫外线B诱导的炎症反应的实验方案。...

从新生及成年小鼠皮肤中分离和培养原代小鼠角质形成细胞

本文介绍了一种从囊胚阶段小鼠胚胎中高效建立和培养多能干细胞系的实验方案。...

从小鼠植入前胚胎中建立干细胞系

本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外...

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

本实验方案的目的是从成年小鼠背部皮肤中分离表皮角质形成细胞，用于多种后续应用，如分子生物学、生物化学、荧光激活细胞分选以及原代体外培养（例如，克隆形成性角质形成细胞）。...

小鼠表皮角质形成细胞的分离及其体外克隆培养

本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。...

小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

我们描述了利用悬滴法将小鼠胚胎干细胞在体外分化为神经元细胞的实验步骤。此外，我们通过RT-qPCR、免疫荧光、RNA测序和流式细胞术进行了全面的表型分析。...

小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

本报告描述了一种从新生小鼠中同时分离原代棕色和白色前脂肪细胞的实验方案。分离得到的细胞可在体外培养，并可诱导其分化为完全成熟的白色和棕色脂肪细胞。该方法可用于在培养条件下对原代脂肪细胞进行遗传学、分子水平及功能特性分析。...

从新生小鼠中分离与分化原代白色和棕色前脂肪细胞

了解如何利用新生小鼠皮肤来源的体细胞干细胞在体外分化培养基中诱导形成卵母细胞样细胞。该方法通过实时PCR检测卵母细胞特异性标志物表达，为生殖生物学研究提供重要实验模型。

新生小鼠皮肤来源干细胞体外分化为类生殖细胞 In vitro

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