富亮氨酸的代谢标记重复激酶1和2与放射性磷酸盐

以下实验的总体目标是用放射性磷酸盐标记目标蛋白质，以量化蛋白质、细胞磷酸化水平。这是通过在磷 32 存在下培养细胞以放射性标记细胞中表达的蛋白质的磷酸盐修饰来实现的。作为第二步，裂解标记的细胞，并将裂解物与亲和珠一起孵育，以便对待分析的蛋白质进行免疫纯化。

接下来，标记和纯化的蛋白质样品在硫酸钠、聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行，并印迹到聚奥兰碱氟化物膜上。为了检测放射性磷酸盐掺入和蛋白质水平，获得的结果显示，基于自体放射成像和免疫检测，富含亮氨酸的重复激酶 1 和 2、缩写的 L rrk 1 和 L rrk 2 在细胞中被磷酸化至相当水平。与磷酸化、免疫印迹等其他技术相比，代谢标记技术的主要优点是该技术可以测定蛋白质的总细胞磷酸化水平，包括没有磷酸化抗体的蛋白质。

该技术的第二个主要优点是可以在不同蛋白质的总细胞磷酸化水平之间进行定量比较。演示该程序的技术人员 F gao 将根据标准培养条件在 dcos 改良的鹰、培养基或 DMM 中开始培养 HEC 2 93 T 细胞系，其中含有 8% 胎牛、血清和庆大霉素。扩增板并通过转染或慢病毒载体介导的转导表达三重标记的 L rrk two 蛋白，如文本方案中所述。

当细胞达到 80% 至 100% 汇合时，用预热的无磷酸盐 dmm 冲洗。在层流下，准备一个猎鹰管，每 6 孔板细胞含 2.1 毫升不含磷酸盐的 DM，以用磷标记。32 正磷酸盐。

准备将进行电离辐射实验的工作台。工作空间由防溢垫覆盖，上面放置了吸收性材料的保护衬垫。还要在工作区提供一个有机玻璃罐，并将无磷酸盐培养基管放入其中。

从冰箱中取出装有小瓶磷 32 标记的正磷酸盐的衬铅容器，并将其带到放射性工作台上。使用盖革计数器监测容器的外部放射性污染，将磷 32 标记的正磷酸盐稀释到不含磷酸盐的 DMEM 管中。添加每毫升 24 微居里 的浓度。

将试管放在有机玻璃罐中。在将磷 32 标记的正磷酸盐放回冰箱之前，请关闭装有剩余磷 32 的容器。接下来，从培养箱中取出带有要标记的细胞的六个孔板，并放在放射性工作台上。

去除培养基上清液并丢弃。然后加入 2 毫升含磷的无磷酸盐培养基。每孔 32 个标记的正磷酸盐。

将培养板放入有机玻璃盒中，然后使用盖革计数器监测容器是否有外部放射性污染。然后将装有细胞的有机玻璃盒转移到专用于同位素代谢标记的真核细胞培养箱中，并将细胞孵育 1 至 20 小时。在方案的这一点上，如果需要，可以按照文本方案中的说明用化合物处理细胞 细胞处理和孵育后，从细胞中取出培养基并丢弃到放置在有机玻璃罐中的废物收集管中。

用 2 毫升冰冷的 tris 缓冲盐水冲洗细胞两次。将漂洗液丢弃到废物收集管中。然后向每个孔中加入 0.5 mL冰冷的免疫沉淀裂解缓冲液，并通过上下移液收集裂解物。

为了松散所有裂解的细胞，将裂解物转移到微量离心管中，并在离心前至少在冰上孵育 10 分钟，以通过免疫纯化分离目标蛋白质。首先，将装有离心裂解物的微量离心管转移回冰中。然后将上清液移液到含有 10 微升床体积的微量离心管中，flag M 两个 aro 速度。

按照文本方案中的讨论进行平衡，将微量离心管转移到 50 毫升试管中。将微量离心管转移到冰上标记的 50 毫升试管中后，将样品放在冷藏室指定区域有机玻璃防护罩后面的旋转装置上，在 4 摄氏度下进行端到端混合 1 至 20 小时，将上清液丢弃到废物收集管中后，在微量离心管中旋转蛋白质结合的标志 M 两个 aro 珠子。按照文本方案中的讨论继续洗涤珠子。

然后将洗涤后的磁珠重悬于 40 μL IP 样品 SDS 上样缓冲液中 在上样缓冲液中加热样品 2 分钟，然后以大于 1000 次 g 的离心速度离心 1 分钟以沉淀磁珠 在 Perspec 筛选后面的放射性工作台上制备蛋白质凝胶电泳模块。在进行电泳之前，将样品上样到 3 至 8%T tris 乙酸 SDS 页面凝胶上，包括适用于识别高分子量蛋白质大小的分子量标记物。电泳后，从塑料外壳中取出凝胶，并转移至装有 western blotting 转印缓冲液的容器中。

制备凝胶和 PVDF 膜后。如文本方案中所述，在半干印迹模块的表面上准备印迹三明治。转移后，以 15 伏电压转移蛋白质 1 至 2 小时。

从印迹模块中取出带有印迹蛋白的 PVDF 膜，然后干燥膜以进行自动射线照相。首先，将膜暴露在磷光板上 1 到 5 天。使用磷光扫描仪从暴露的磷光板上读取磷 32，并将图像保存为高分辨率 tiff，以便通过免疫检测检测蛋白质水平。

将膜短暂浸入甲醇中，然后将其转移到含 PBS 的浅 blott 孵育容器中，使膜再水化。在含有 5% 牛奶的 PBST 中封闭膜。将印迹与抗 LR K 二抗体或抗 Flag 抗体一起孵育，并通过适当的洗涤步骤和二抗孵育进一步处理。

抗体应用后，进行化学发光检测以确认 LRRK 2 的相对蛋白水平。最后，如文本方案中所述，使用直径分析定量 LRK 2 中磷 32 的掺合 此处显示的是 HEC 2 93 T 细胞中 L Rrk 1 和 L Rrk 2 代谢标记的代表性结果。这里描述的是磷 32 掺入的代表性自动射线图，以及通过三重标志标签检测的 L Rrk 1 和 L Rrk 2 的代表性蛋白质印迹。

在 L rrk 1 和 L rrk 2 中均观察到放射性磷酸盐掺入。定量磷后，将 32 水平标准化为通过 Anti-Flag 抗体免疫检测密度法分析测量的蛋白质水平。发现在测试条件下，L rrk one 的平均磷酸化水平低于 L rrk 2，尽管未达到统计显着性，但不要忘记，与放射性一起工作可能非常危险，预防措施，例如非常个人的防护设备和通过您所在机构的安全部门提供的程序工作应始终通过执行此协议来采取。