Name: 富亮氨酸的代谢标记重复激酶1和2与放射性磷酸盐 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 了解利用放射性磷酸盐代谢标记技术定量检测LRRK1和LRRK2激酶的细胞磷酸化水平。该方法通过磷-32标记、免疫纯化和放射自显影实现蛋白质磷酸化定量分析，适用于缺乏特异性磷酸化抗体的蛋白研究。

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我们还感谢迈克尔·J·福克斯基金会对本研究的支持。感谢弗拉芒研究基金会（FWO）（FWO 项目 G.0666.09，授予 JMT 的高级研究员奖学金）、IWT SBO/80020 项目 Neuro-TARGET 以及鲁汶大学（OT/08/052A 和 IOF-KP/07/001）提供的支持。本研究还部分得到了由博杜安国王基金会管理的 Druwé-Eerdekens 基金对 JMT 的资助。

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<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16(2010).</li>
<li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li>
<li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.Mol.Genet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供了一种利用代谢标记法检测细胞系中LRRK1和LRRK2总体磷酸化水平的基本实验方案 32P-正磷酸盐。总体策略十分直接。在HEK293T细胞中表达带有亲和标签的LRRK蛋白，并将细胞暴露于含有 32P-正磷酸盐。该 32P-正磷酸盐在孵育数小时后即被细胞吸收，从而使细胞内所有含磷酸基团的分子均被放射性标记。随后利用亲和标签（3xflag）通过免疫共沉淀法将LRRK蛋白从其他细胞组分中分离。免疫沉淀物经SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜，通过放射自显影分析掺入的磷酸基团32P信号）以及印迹上蛋白质的Western检测（蛋白信号）。本方案应与测量LRRK2自磷酸化的方案相区分。17 在细胞培养中而非在体外进行LRRK1或LRRK2的标记 体外 使用纯化蛋白进行磷酸化反应。
需要注意的是，此处提供的详细实验方案可根据实验需求进行多种调整。例如，由于标记在大多数常见的实验室细胞系中效率较高，因此本方案并不局限于使用 HEK293T 细胞系。此外，也可使...

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有相似结构域组织的多结构域旁系同源蛋白。这两种蛋白均编码一个类似于Ras家族GTP酶的GTP酶序列（即复杂蛋白中的Ras，Ras of Complex Proteins，ROC），以及一个ROC结构域的C端结构域（COR），因此被归类为ROCO蛋白家族成员5,6。在ROC-COR结构域串联的N端，两种蛋白均含有一个富含亮氨酸重复序列的结构域和一个类似锚蛋白的结构域，而只有LRRK2还额外编码一个犰狳重复结构域6-8。在ROC-COR结构域的C端，两种蛋白均具有一个丝氨酸-苏氨酸激酶结构域，而只有LRRK2在C端区域编码一个WD40结构域8。LRRK1和LRRK2确切的细胞功能尚未完全阐明，但已有研究表明LRRK1参与酪氨酸激酶受体信号通路1,2，而遗传学证据则表明LRRK2在帕金森病的发病机制中发挥重要作用3,4。
蛋白质的磷酸化是细胞中常见的调控机制。例如，磷酸化对于酶的激活或蛋白质向信号复合物的募集可能是必需的。LRRK2 的细胞磷酸化已被广泛表征，磷酸化位点作图显示，大多数细胞磷酸化位点位于锚蛋白重复区与富含亮氨酸重复区之间的簇状区域9-11。尽管目前尚未完成对 LRRK1 细胞磷酸化位点的定位，但来自 COS7 细胞中免疫沉淀的 LRRK1 蛋白印迹的磷酸化蛋白染色研究的证据表明，LRRK1 蛋白在细胞中会发生磷酸化12。
本文提供了一种利用32P-正磷酸盐代谢标记法测定细胞系中LRRK1和LRRK2总体磷酸化水平的基本实验方案。整体策略简明直接：在HEK293T细胞中表达带有亲和标签的LRRK蛋白，并将其置于含有32P-正磷酸盐的培养基中孵育。细胞仅需数小时即可吸收32P-正磷酸盐，从而使细胞内所有含磷酸基团的分子被放射性标记。随后利用亲和标签（3xflag）通过免疫沉淀法将LRRK蛋白从其他细胞组分中分离出来。免疫沉淀产物经SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上，再通过放射自显影（32P信号）和蛋白质印迹检测（蛋白信号）对蛋白条带中掺入的磷酸基团进行分析。

<table><tbody><tr><td>磷-32 放射性核素，1 mCi，1 ml 水中含磷酸氢二钠缓冲液</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#8217;s 修饰型 Eagle 培养基 (D-MEM) (1X)，液体（高葡萄糖）</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>该培养基不含磷酸盐</td></tr><tr><td>抗 Flag M2 亲和凝胶</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>如需使用颜色为红色的凝胶（便于更清晰地观察珠粒），可选用货号 F2426 的等效产品。</td></tr><tr><td>加厚型印迹滤纸</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>丽春红 S 溶液</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

富含亮氨酸重复序列激酶1和2的放射性磷酸盐代谢标记

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有相似结构域组织的同源蛋白，包括丝氨酸-苏氨酸激酶结构域、复杂蛋白中的Ras结构域（ROC）、ROC的C端结构域（COR），以及位于N端的富含亮氨酸重复序列和类似锚蛋白的重复序列。LRRK1和LRRK2在细胞内的确切功能尚未完全阐明，但已有研究表明LRRK1参与酪氨酸激酶受体信号通路1,2，而LRRK2则与帕金森病的发病机制相关3,4。本报告中，我们介绍一种利用32P-正磷酸盐对细胞中的LRRK1和LRRK2蛋白进行标记的实验方案，从而实现对这两种蛋白在细胞内总体磷酸化水平的测定。简言之，将带有亲和标签的LRRK蛋白在HEK293T细胞中表达，并将细胞置于含有32P-正磷酸盐的培养基中孵育。细胞仅需数小时即可将32P-正磷酸盐吸收，从而使细胞内所有含磷酸基团的分子被放射性标记。通过亲和标签（3xflag），利用免疫沉淀法将LRRK蛋白从其他细胞组分中分离出来。免疫沉淀产物经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，并通过放射自显影（32P信号）和蛋白质印迹检测（蛋白信号）对掺入的磷酸基团进行分析。该方案可轻易地被调整用于监测任何可在细胞中表达并可通过免疫沉淀分离的其他蛋白的磷酸化状态。

为了比较细胞中LRRK1和LRRK2的整体磷酸化水平，将带有3xflag标签的LRRK1和LRRK2在HEK293T细胞中表达15。细胞培养于6孔板中，并用32P标记，随后按照上述方案文本所述进行分析。图1显示了LRRK1和LRRK2在HEK293T细胞中代谢标记的代表性结果。 在LRRK1和LRRK2中均观察到放射性磷酸盐的掺入。通过对32P信号水平进行定量，并以抗flag抗体免疫检测信号的密度分析结果归一化蛋白表达量，发现LRRK1的平均磷酸化水平低于LRRK2，但在所测试条件下该差异未达到统计学显著性（P&gt;0.05）。
<img alt="LRRK1/2 磷酸化，P32 掺入，Flag 免疫印迹，柱状图比较，蛋白质分析。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50523/50523fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50523/50523fig1.jpg" data-...

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有多个结构域的蛋白质，包含GTP酶和激酶结构域，并可在细胞内发生磷酸化。本文中，我们介绍一种在细胞中使用32P正磷酸盐标记LRRK1和LRRK2的实验方案，从而提供一种检测其在细胞内总体磷酸化水平的方法。

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有相似结构域组织的旁系同源蛋白，包括丝氨酸-苏氨酸激酶结构域，……

以下实验的总体目标是利用放射性磷酸盐对目标蛋白质进行标记，以定量分析蛋白质及细胞内的磷酸化水平。该目标通过在含有磷-32的培养基中培养细胞，使细胞表达的蛋白质上的磷酸化修饰被放射性标记来实现。第二步，将标记后的细胞裂解，裂解液与亲和磁珠孵育，以免疫纯化待分析的蛋白质。接下来，将标记并纯化的蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转印至聚偏二氟乙烯膜。为了检测放射性磷酸盐的掺入情况及蛋白质水平，通过自显影和免疫检测获得的结果显示，富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（简称Lrrk1和Lrrk2）在细胞中的磷酸化水平相当。与磷酸化免疫印迹等其他技术相比，代谢标记技术的主要优势在于，该方法能够测定蛋白质的总体细胞内磷酸化水平，包括那些尚无可用磷酸化特异性抗体的蛋白质。该技术的第二个主要优势在于，可以在不同蛋白质之间对其细胞内总磷酸化水平进行定量比较。演示该实验步骤的是本实验室的技术员 F gao。首先，按照标准培养条件，在含8%胎牛血清和庆大霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养HEK 293T细胞系。扩大培养后，通过转染或慢病毒载体介导的转导方法，表达三重Flag标签的Lrrk2蛋白，具体操作如文本方案中所述。当细胞融合度达到80%至100%时，用预热的无磷酸盐DMEM洗涤细胞。在超净工作台中，为每六孔板待标记磷的细胞准备一个含有2.1毫升无磷酸盐DMEM的Falcon管。32正磷酸盐。准备进行电离辐射实验的工作台。工作区域应覆盖防溅垫，并在防溅垫上放置一层吸水性材料制成的保护衬垫。同时在工作区准备一个有机玻璃罐，并将无磷酸盐培养基的试管放入其中。从冰箱中取出装有磷-32标记的正磷酸盐小瓶的铅衬容器，并将其带到放射性工作台。使用盖革计数器检测容器外部是否存在放射性污染，将磷-32标记的正磷酸盐稀释至无磷酸盐的DMEM培养基中，加入终浓度为24微居里/毫升。将试管放入丙烯酸树脂罐中。在将剩余的磷32标记的正磷酸盐放回冰箱前，先将其容器盖好。接着，从培养箱中取出待标记的六孔板细胞，放置于放射性操作台。移除培养基上清液并弃去。然后每孔加入含有磷-32标记的正磷酸盐的无磷酸盐培养基 2 毫升。将培养皿放入丙烯酸盒中，然后使用盖革计数器检测容器外部是否存在放射性污染。随后将装有细胞的丙烯酸盒转移至专用于同位素代谢标记的真核细胞培养箱中，孵育细胞1至20小时。在此步骤中，可根据文本方案中的指示，对细胞进行化合物处理（如需要）。完成细胞处理和孵育后，移除细胞中的培养基，并弃置于废液收集管中，将收集管置于丙烯酸罐内。用两毫升冰预冷的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液冲洗细胞两次，将冲洗液弃入废液收集管中。然后向每孔中加入0.5毫升冰预冷的免疫沉淀裂解缓冲液，通过上下吹打收集裂解液。为了充分解离所有已裂解的细胞，需将裂解液转移至微量离心管中，在冰上孵育至少10

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使用荧光染料标记干细胞以实现光学成像的无创检测

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