多尺度孔梯度，聚电解质和间接监测改性金属植入物在体内
July 1st, 2013
在这段视频中，我们将演示多孔金属植入物的改性技术，以提高它们的功能和控制细胞迁移。这些技术包括孔梯度发展，控制细胞的移动3D和生产基底膜模仿在2-D控制细胞运动。此外，描述一个基于HPLC的监测方法，通过分析血液中的蛋白质被检体内的植入物的整合。
该程序的总体目标是在多个长度尺度上修饰金属植入物，以控制体外和体内的细胞行为。这是通过首先在 3D 管状植入物内产生孔径梯度（Biofreeze 提取法）来实现的。第二步是通过逐层方法开发基于胶原蛋白和藻酸盐的纳米纤维基底膜模拟物。
接下来，使用血浆分析在植入后监测此类植入物的间接方法。HPLC 和随后的肽测序最终证明是一种植入物，其中不同区域可以根据需要容纳不同的细胞类型。对于一些多细胞组织，虽然这个系统可以提供一种修饰金属植入物的方法。
它还可以应用于 3D 细胞培养模型系统，例如人工组织或疾病模型。当我们试图找到一种技术来控制体内多孔钛植入物周围的细胞运动时，我们第一次有了这种方法的想法。要开始此过程，请按照书面文本中的说明清洁植入物并设计和制造特氟龙模具，以进行冷冻和提取。
通过将聚合物粉末引入有机溶剂中，在二恶英和水的二元混合物中制备合成聚合物 PLLA 溶液。在磁性 Starr 上，将混合物加热到 60 摄氏度，以获得均匀的溶液。选择这个温度是因为它是用于将溶液引入植入物的精密玻璃注射器的耐温上限。
同时，考虑到冷冻溶液体积的变化，根据植入物的孔隙率计算所需聚合物溶液的体积。接下来，使用精度为 0.1 μL 的精密玻璃注射器将溶液引入植入物中。聚合物浓度的下限为 3%，用于可重现的 PO 梯度形成，或者当难以在高于 6% 的厚样品中获得均匀分布时，直接在零下 80 摄氏度下冷冻样品，或在室温下预先孵育 30 分钟。
冻结条件部分决定了孔隙的形成。因此，冷冻条件可以根据目标孔隙率进行调整。将样品在零下 80 摄氏度下放置过夜。
在冻结状态下分离霉菌是一个非常困难的步骤。应注意减少冷冻的打底剂溶液与霉菌的接触，在头皮的帮助下，将植入物浸入 80% 预冷的乙醇中以获得孔隙率梯度。使用预冷的手术刀去除除心轴以外的所有模具部件，对于管状植入物和除圆盘状植入物底部以外的所有部件，在零下 20 摄氏度下过夜进行提取。
提取后，取出剩余的模具部件并风干植入物。用于表征结构的整体孔隙率。需要进行汞血氧仪分析。
在此示例中，汞血氧仪测量显示与植入物两侧的孔隙和较小的分散孔隙相对应的不同峰值。然而，更关键的数据是腔内和腔外表面孔隙率之间的差异，这可以通过图像 J 分析孔径分布。通过扫描电子显微镜观察横截面，对样品进行冷冻断裂。
由于所用植入物的开放多孔性质和钛的光反射能力，可以在多孔植入物内进行标记细胞的 Z 堆栈。用 PKH 26 或钙 AM 标记的细胞可用于通过共聚焦激光显微镜观察植入物，以构建多层。使用浸渍机器人获得最高的可重复性。
但是，如果没有浸渍机器人，则可以手动完成这些步骤。要制备胶原蛋白溶液，请使用医用级 1 型胶原蛋白和海藻酸钠。最佳浓度为 150 毫摩尔中每种 0.5 克/升。
pH 值为 3.8 的柠檬酸氯化钠缓冲液将胶原溶液溶解过夜，以确保均匀性。由于结构不稳定，因此溶液的酸性 pH 值为 3.8 对于层的稳定积累是必需的。交联前。
在中性 pH 设计中，用于利用植入物的特定支架，用于聚电解质多层生产中使用的浸渍机器人。将层沉积在仅钛植入物或如文中所述改性植入物的表面上。使用浸渍机器人系统，首先将植入物浸入海藻酸盐溶液中 15 分钟，然后用 pH 值为 3.8 的 150 毫摩尔氯化钠冲洗结构 5 分钟。
然后浸入胶原蛋白溶液中 15 分钟。为了首先稳定基底膜，制备 100 毫摩尔 genin 的交联溶液。在 A-D-M-S-O 柠檬酸盐缓冲液中，以 1 比 4 体积比将 genin 溶解在 DMSO 组分中，然后溶解在水组分中，以避免结块，之后 12 至 24 小时浸入交联溶液中交联样品。
用大量 pH 值为 3.8 的柠檬酸盐缓冲液冲洗清洗步骤后，用紫外线处理 30 分钟或在抗生素抗真菌浴中对样品进行消毒。决定基底膜模拟物质量的主要参数是其厚度和纤维直径。使用原子力显微镜或在接触模式下获得的 FM 图像计算纤维直径。
用氮气流干燥样品后，在成像之前量化每个图像至少 10 根纤维的厚度，以确定平均原纤维厚度。使用 Image J 软件，在干燥海藻酸盐 24 双层胶原蛋白多层膜后，可以通过划痕测试确定薄膜的厚度。首先使用 FM，用光学显微镜定位划痕后，使用注射器针头刮擦薄膜，在 10 x 10 平方微米的划痕边界处用 FM 获得图像。
根据使用 A FM 软件获得的轮廓计算高度，该软件提供薄膜层的厚度。如文中所述将装置植入兔子的气管后，从它们的耳静脉获取血样，将样品在 4 摄氏度下以 5， 000 RPM 离心 20 分钟。用 0.1% 三乙酸提取兔血浆后，使用获得的上清液进行分析。
通过使用细胞核细胞反向相 305 C 18 色谱柱纯化提取物，对血浆蛋白含量进行反相 HPLC 纯化。使用文本方案中的溶剂系统和流速记录 214 和 280 纳米处的吸光度。在通过蒸发浓缩之前收集峰馏分。
使用快速真空应用程序，在完全干燥之前停止快速真空很重要。将植入过程中不同时间点获得的峰相关联。使用在植入过程中显示出一致趋势的纯化肽，通过自动 Edmond 测序进行鉴定。
将样品加载到多脑处理的玻璃纤维过滤器中，通过使用专业精密微测序仪的自动 Edmond 降解来确定纯化肽的末端序列。下一步是在 C 18 色谱柱上通过色谱法鉴定苯基 th 和 1 个氨基酸。获得序列后，可以使用 Swiss Prote 数据库通过爆炸软件进行鉴定。
通过改变 PLLA 溶液的浓度，可以控制植入物管腔外侧的孔隙大小。孔径和形状受钛植入物的存在显着影响。孔径范围为 40 至 100 微米，利用较低浓度可产生较小的孔，而腔内侧孔尺寸受限制提取控制，约为 9 微米，小于成纤维细胞的平均尺寸。
通过在室温下添加孵育步骤，可以获得双孔结构，其中较大孔隙的孔壁具有自己的孔隙率。此功能对于较厚的植入物很重要，因为它会促进气体和营养物质的移动。形成孔隙梯度后，可以在结构顶部添加胶原藻酸盐膜层。
该薄膜层在 PLLA 泡沫上稳定，也可以在没有泡沫纳米级胶原纤维形成的情况下保持在表面上。随着薄膜层的增长，薄膜的增长呈指数级增长。因此，可以获得几百纳米的厚膜。
多孔钛植入物与宿主组织整合，并在体内 4 到 6 周内完全填充，如外植植入物横截面所示。孔内的组织是成熟的结缔组织，具有良好的血管形成水平。在此期间，HPLC 分析显示明显的峰值在植入过程中波动。
对感兴趣的峰分数进行测序并确定为 α 和 β 血红蛋白半链，其与 C 反应蛋白读数显示出相似的趋势。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一天内完成。观看此视频后，您应该对如何生成用于金属植入物改性和细胞培养实验的 3D 多尺度 PO 梯度有很好的了解。
冷冻提取和分层成膜是开发您自己的改性植入物或细胞微环境的简单金属。
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概述
本视频演示了多孔金属植入物的改性技术，旨在提高功能性并控制细胞迁移。技术包括开发用于3D细胞移动的孔隙梯度和用于2D细胞行为的基底膜模拟物。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物医学工程
- 细胞生物学
背景
- 金属植入物的改性可以增强其整合和功能性。
- 控制细胞迁移对于组织工程应用至关重要。
- 孔隙尺寸梯度可以影响三维环境中的细胞行为。
- 基底膜模拟物可以为细胞粘附和移动提供适当的环境。
研究目的
- 在多个长度尺度上改性金属植入物。
- 在体外和体内控制细胞行为。
- 开发植入物植入后监测整合的方法。
使用的方法
- 生物冷冻提取法用于创建孔隙尺寸梯度。
- 逐层法用于开发纳米纤维状基底膜模拟物。
- 基于HPLC的血浆分析用于监测植入物整合。
- 肽序列测定用于评估对植入物的生物反应。
主要结果
- 成功在管状植入物内创建了孔隙尺寸梯度。
- 开发了有效的胶原蛋白和藻酸盐基底膜模拟物。
- 展示了监测植入物整合的间接方法。
- 根据设计，植入物具有容纳不同细胞类型的潜力。
结论
- 改性技术可以显著提高金属植入物的功能性。
- 通过结构设计可以实现对细胞迁移的控制。
- 监测方法为植入物的生物整合提供了见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables multi-scale modification of metallic implants to control cell behavior and monitor integration, supporting preclinical model development for tissue engineering. By creating pore gradients and biomimetic surfaces, it provides a tunable platform for studying cell migration and tissue-implant interactions. The indirect in vivo monitoring approach reduces reliance on histology, accelerating iterative design cycles in implant optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how pore size gradients influence cell migration and tissue integration pathways.
- Operational Value: Provides a reproducible system to validate implant design hypotheses before in vivo studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, functionalized implant surfaces for consistent cell adhesion and migration assays.
- Operational Value: Supports high-throughput screening of biomaterial coatings using layer-by-layer deposition with quantifiable thickness control.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Mimics multicellular tissue requirements by enabling spatial control of different cell types within implant zones.
- Operational Value: Facilitates longitudinal monitoring of implant integration via plasma biomarker analysis, reducing endpoint histology dependence.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow supports discovery biology through assay-ready implant preparation, screening via surface functionalization, and translational research via in vivo monitoring of integration markers.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on how structural cues direct cell behavior in 3D microenvironments.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable surface modifications for evaluating cell-material interactions.
- Analytics: Provides HPLC-based peptide profiling to correlate implant changes with host response over time.
- Translational Research: Links implant design to functional outcomes through biomarker tracking in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for iterative implant optimization across multiple organ-specific applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in implant performance by decoupling topographical and biochemical cues.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized freeze-extraction and dipping robot-assisted layer deposition.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early assessment of tissue integration potential.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions based on quantitative integration metrics rather than endpoint histology alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial synthesis, freeze-extraction techniques, and layer-by-layer polyelectrolyte deposition.
- Depends on precision instrumentation including glass syringes, freezing equipment, mercury porosimeter, and HPLC systems.
- Necessitates cross-team standardization for consistent pore gradient formation and surface coating reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different implant geometries or polymer systems.
- Limited by the accessibility of specialized equipment such as dipping robots and automated sequencers for peptide analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Preparation of Micropore Gradients in Macroporous Metallic Implants
4:35
Surface Coating of Porous Metallic Implants with Collagen/Alginate Multilayers
7:50
Indirect Monitoring of Implant Integration In vivo By Analysis of Blood Plasma
9:33
Results: Modification of Porous Metallic Implants and Analysis of Blood Plasma after Implanatation
11:41
Conclusion
