Name: 多尺度孔梯度，聚电解质和间接监测改性金属植入物在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 了解多尺度孔梯度改性金属植入物技术，通过冷冻萃取法制备孔径梯度，并利用层层组装技术构建胶原-海藻酸钠纳米纤维基底膜模拟物，结合HPLC血液分析实现植入物整合的间接监测。

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作者感谢Andre Walder博士和Nicolas Perrin制造了钛植入物，K. Benmlih协助搭建聚四氟乙烯模具，以及G. Prevost博士在动物实验中提供的帮助。我们还感谢阿尔萨斯地区和阿尔萨斯材料与纳米科学中心（PMNA）提供的经费支持。

1. 大孔金属植入物中微孔梯度的制备
<ol>
	<li>用乙醇清洗植入物（例如由医用级钛珠制成的植入物，粒径范围为400-500 μm，Neyco SAS，法国），然后在丙酮中进行15分钟的超声处理。</li>
	<li>根据植入物的尺寸和形状设计并制造聚四氟乙烯（Teflon）模具（标准实验使用直径1.5 cm、高2 cm的圆柱形模具）。模具应具有模块化结构，以便在提取过程中移除特定部分。此类模具设计可通过引导提取液定向流动，从而实现对提取过程的控制。</li>
	<li>对于用于替代气管的管状植入物，其结构应由三部分组成：i）确定植入物尺寸的底部部分，ii）芯轴，以及iii）可拆卸的外层芯体。通过这种方式，可形成由外向内逐渐变化的孔径梯度。</li>
	<li>制备合成聚合物（PLLA）溶液：用于冷冻/萃取的PLLA溶液需在二噁烷与水的二元混合液（87:13%，v:v）中配制。</li>
	<li>将混合物加热至60 °C，以获得均一溶液。选择60 °C是因为这是必须用于将溶液注入植入物的精密玻璃注射器所能耐受的最高温度。</li>
	<li>若使用高浓度（≥6%）、高分子量的PLLA溶液，应在加热后立即注入植入物中。否则溶液会在未完全浸润的情况下发生凝胶化。</li>
	<li>根据植入物的孔隙率计算所需聚合物溶液的体积，为提高准确性，可考虑冷冻后溶液体积的变化。</li>
	<li>使用精度为0.1 μl的精密玻璃注射器将溶液注入植入物中。为实现可重复的孔径梯度形成，聚合物浓度下限为3%，而当浓度超过6%时，在较厚样品中难以获得均匀分布。然而，针对特定应用也可使用其他浓度。</li>
	<li>将样品直接置于-80 °C下冷冻，或先在室温下孵育30分钟后再冷冻。冷冻条件部分决定了孔结构的形成，因此可根据目标孔隙率调整冷冻条件。将样品在-80 °C下保存过夜。</li>
	<li>萃取：将植入物浸入预冷的80%乙醇（EtOH）中，在-20 °C下过夜进行萃取。为获得孔隙梯度，对于管状植入物，仅保留芯轴；对于盘状植入物，仅保留底部部分，其余模具部件均需移除。使用预冷的手术刀可更易于分离模具。</li>
	<li>在-20 °C下萃取过夜后19，移除剩余的模具部件，并将植入物自然晾干。为表征结构的整体孔隙率，需进行汞孔隙率分析。汞孔隙率测定结果显示了对应于植入物两侧及分散小孔的明显峰。然而更为关键的数据是管腔内表面与管腔外表面孔隙率之间的差异，该差异可通过Image J结合扫描电子显微镜（SEM）分析孔径分布20。为验证孔隙梯度，可对样品进行冷冻断裂处理，并用SEM观察其横截面。</li>
	<li>由于所用植入物具有开放多孔结构，且钛具有较强的光反射能力，因此可在多孔植入物内部对标记细胞进行z轴层扫成像。使用PKH26或Calcein-AM标记细胞，并通过共聚焦激光显微镜观察植入物。</li>
</ol>
2. 胶原蛋白/海藻酸盐多层膜在多孔金属植入物表面的涂层
<ol>
	<li>为构建多层结构，使用浸渍机器人可获得最高的重复性。然而，若无浸渍机器人，这些步骤也可手动完成。</li>
	<li>使用医用级I型胶原蛋白和海藻酸钠。优化的浓度为每种成分在pH 3.8的柠檬酸盐缓冲液（含150 mM NaCl）中均为0.5 g/L。</li>
	<li>将胶原溶液溶解过夜，以确保溶液的均一性。pH 3.8的酸性环境对于稳定多层结构的构建至关重要，因为在中性pH条件下交联前，该结构在中性环境中不稳定。</li>
	<li>通过浸渍机器人系统将植入物交替浸入胶原和海藻酸钠溶液中以沉积各层。每层沉积时间为15分钟。每次沉积步骤之间，用pH 3.8的150 mM NaCl溶液冲洗5分钟。</li>
	<li>设计专用夹具，以便在用于聚电解质多层膜制备的浸渍机器人上使用植入物。将多层结构沉积在仅含钛的植入物表面，或沉积在如第1节所述经过修饰的植入物表面。</li>
	<li>使用京尼平稳定基底膜模拟物：将交联溶液按1:4体积比配制为二甲基亚砜（DMSO）与柠檬酸盐缓冲液（150 mM NaCl，pH 3.8）的混合液。可使用较宽范围的浓度，其中100 mM浓度足以实现交联。先将京尼平溶于DMSO组分中，随后再加入水相组分，以避免结块。</li>
	<li>将样品浸入交联溶液中12–24小时进行交联。之后用大量pH 3.8的柠檬酸盐缓冲液冲洗。</li>
	<li>洗涤步骤完成后，可通过紫外照射（30分钟）或抗生素/抗真菌溶液处理（青霉素/链霉素，Fungizone）对样品进行灭菌。</li>
	<li>决定基底膜模拟物质量的主要参数为其厚度和纤维直径。使用接触模式下获得的原子力显微镜（AFM）图像计算纤维直径。成像前用氮气流干燥样品。每幅图像中至少量化10根纤维，利用Image J软件确定平均原纤维厚度。</li>
	<li>薄膜厚度可通过AFM进行划痕测试测定。干燥(COL/ALG)24/COL多层膜，用注射器针头在膜表面划痕。在光学显微镜下定位划痕后，在划痕边缘处获取10 × 10 μm2区域的AFM图像。利用AFM软件获得的剖面图计算高度，从而得到薄膜层的厚度。</li>
</ol>
3. 通过血液血浆分析对植入物整合进行体内间接监测
<ol>
	<li>应根据各国管理动物实验的相关规定，取得所有必要的伦理委员会批准21。在本研究中，遵循《实验动物护理与使用指南》（国家研究委员会，2010年），并已获得斯特拉斯堡大学伦理委员会的批准。</li>
	<li>在目标部位进行植入操作。此处提供的血液监测方案用于新西兰白兔15 mm气管切除后的气管替代手术。</li>
	<li>植入后需进行每日随访，包括监测动物的一般健康状况（手术部位愈合情况、呼吸频率）并记录其体重变化。</li>
	<li>为验证血液检测结果，应采用成熟的方法，例如使用ELISA法检测血液中C反应蛋白（CRP）水平。多种动物的CRP检测试剂盒均可获得，本研究中用于兔子的特异性试剂盒列于表1。同样，采用蛋白质印迹法（Western blotting）测定嗜铬粒蛋白A（CGA）水平。本方案中使用了抗CGA的单克隆抗体（抗-CGA47-68）。</li>
	<li>进行血浆表征时，从兔耳缘静脉采集血液样本。在4 °C条件下以5,000 rpm离心20分钟，取上清液用于分析。在本实验流程中，上述检测每周进行一次，但也可根据需要更频繁地开展。</li>
	<li>血浆蛋白成分的反相高效液相色谱（HPLC）纯化：用含0.1%三氟乙酸（TFA）的溶液按1:1（v:v）比例提取兔血浆。使用Dionex HPLC系统（Ultimate 3000；美国加利福尼亚州森尼韦尔）和Nucleosil反相C18柱（300-5C18，4 × 250 mm，粒径5 μm，孔径300 Å）对提取物进行纯化。</li>
	<li>记录214 nm和280 nm处的吸光度。所用溶剂系统为：i）溶剂A：含0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）的水溶液；ii）溶剂B：含0.09%（v/v）TFA的70%（v/v）乙腈-水溶液。</li>
	<li>设置流速为700 μl/min，并采用梯度洗脱。收集各峰对应的组分。通过真空离心浓缩法（speed-vacuum）浓缩各组分。注意应在样品完全干燥前停止真空浓缩过程。</li>
	<li>比对植入期间不同时间点获得的色谱峰。选择在植入过程中呈现一致变化趋势的纯化肽段，用于后续的自动Edman测序鉴定。</li>
	<li>肽段的自动Edman测序：使用Procise蛋白质测序仪通过自动Edman降解法测定纯化肽段的N端氨基酸序列。将样品加载至聚溴化苯乙烯处理的玻璃纤维滤膜上。下一步是通过C18色谱柱（PTH C-18，2.1 × 200 mm）进行苯基硫代乙内酰脲-氨基酸（Pth-Xaa）的色谱鉴定22。获得序列后，可利用Blast软件结合SWISS-Prot数据库进行比对鉴定。</li>
</ol>

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</ol>

NE Vrana 是 Protip SAS 公司的员工。

孔隙梯度是界面组织工程中的重要工具，此处描述的系统可单独使用，也可与金属植入物结合使用，以形成孔隙梯度用于研究细胞迁移。该系统除需使用化学通风橱处理有机溶剂外，无需额外设置或额外设备，因此可在生物学实验室中应用。类似聚合物如聚乙醇酸（Poly(glycolic acid), PGA）、聚乳酸-乙醇酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA）和聚己内酯（Poly(caprolactone), PCL）也可通过轻微调整后使用。其他在有机溶剂中不溶解的大孔结构也可被采用。若需在一侧表面获得更小的孔径（纳米尺度），还可额外形成一层薄的纳米多孔膜。该膜可通过先将聚合物的稀溶液（1%）溶于高挥发性溶剂（如氯仿）并滴加至结构顶部，随后立即浸入纯乙醇溶液中引发相分离而实现。由此可构建仅基于一种材料的共培养系统。
聚四氟乙烯模具的设计对于控制孔径至关重要，因为萃取液的流动由该设计决定。萃取液的流动以及萃取液与溶剂之间的交换速率会影响孔隙的形成。通过在植入物中施加萃取液的层流，可进一步提高控制精度。萃取液体积是一个重要参数，应根据所用聚合物的量以及植入物的尺寸进...

目前可用的金属植入物适用于承重应用，但其不可降解性要求设计时必须确保与周围组织形成牢固的界面 1通过提供促进细胞长入和定植的结构 体内，金属植入物的使用寿命可以延长 2开放多孔金属植入物是组织界面工程及确保植入物良好定植的有前景材料。此类植入物已被广泛用于骨科植入物以及气管植入物。 3-5然而，仍存在一些需要解决的问题，例如对细胞在孔隙区域移动的精确控制。若无法有效控制这一过程，可能导致一端细胞定植不完全，而另一端发生再狭窄。此外，还需对这些植入物进行进一步的功能化修饰，以实现更高级的功能，如生长因子的递送、定向血管化以及不同类型细胞的同步迁移。 6-8对于气管植入物而言，这一点至关重要，因为希望植入物被血管化组织定植。然而，组织向气管腔内的不受控生长是不利的，因为它会降低植入物的通畅性。
控制细胞移动的一种方法是利用尺寸排阻效应。通过了解目标细胞的尺寸及其与特定合成聚合物相互作用的能力，可以构建出具有梯度孔径的材料，从而有效控制细胞迁移的深度。例如，设计一种孔径结构，使其足够大，允许成纤维细胞等结缔组织细胞从管外进入，但又足够小（小于10 μm），以阻止这些细胞向管腔内部迁移，从而实现对管状植入物定植过程的有效调控。
在现有的造孔方法中，例如冷冻干燥、粒子沥滤和气体发泡9,10，最易于适应且能以最少设备快速形成孔隙梯度的方法是冷冻萃取法11。该方法将聚合物溶液在有机溶剂与水的二元混合体系中冷冻，随后通过与乙醇等可混溶的预冷液体进行萃取，实现溶剂交换。冷冻和萃取条件决定了孔隙的形态和尺寸；若以可控的方式进行萃取液的流动，则可实现孔隙大小和形状的定向调控。
多细胞组织的第二步是形成不同类型细胞之间的多孔屏障，以调控它们之间的相互作用。根据各类细胞的不同需求，这一结构对于建立不同的微环境也十分必要12,13。气管是一种连接喉部与支气管的管状器官，其内壁由假复层纤毛上皮构成，并散布有分泌黏液的杯状细胞。气管的三维结构和稳定性由呈C形的软骨环支撑。因此，在人工气管中，结缔组织与纤毛上皮层之间应具有明确的连接界面。结缔组织部分需要具备三维结构，而上皮细胞的迁移则需要类似基底膜的表面，以实现定向移动和创面闭合。聚电解质多层膜（PEMs）是获得基底膜模拟结构的一种可行选择。逐层自组装法（LbL）是一种获得薄而功能性表面涂层的通用技术，其原理基于两种带相反电荷的聚电解质通过静电相互作用依次沉积，形成纳米级表面涂层，且可通过简单调节聚电解质种类、pH值、层数、封端层的添加、交联等变量来调控涂层性能。LbL方法的主要优势之一是能够顺应底层基材的表面形貌。因此，在受控条件下，该方法也可用于对多孔结构实现表面覆盖。若将胶原蛋白作为其中一种聚电解质，则可形成纳米纤维结构，从而模拟基底膜表面。钛的疏水性有利于此类结构的形成，并可在较厚涂层中保持纤维结构14。通过这种方式，也可调控细胞在表面的黏附与移动行为。结合冷冻萃取与LbL薄膜涂覆的顺序操作，可构建一种能够在横向、纵向及周向上均实现细胞运动控制的结构15。
本文介绍了两种利用钛植入物疏水特性的新型改性方法，这些方法可扩展应用于多种多孔植入物的改性：i) 在大孔钛植入物内部形成微孔梯度结构，并使用疏水性合成聚合物进行修饰；ii) 在植入物表面形成一层较厚的聚合物薄膜，通过聚电解质多层膜支持细胞生长和内衬层的形成。这两种方法可依次使用，也可单独使用。它们可提供特定结构，以确保多细胞组织中不同类型细胞的受控迁移和空间有序排列16,17。以气管修复为例，理想的植入物效果是在微孔梯度区域内由纤维血管组织实现充分定植，且不发生再狭窄，同时在聚电解质多层膜表面形成由纤毛柱状上皮细胞构成的内衬层。
控制植入物与宿主整合的一种方法是在植入物与宿主整合期间进行微小的外科干预 原位为了能够确定干预措施的时机，了解植入物的全身性影响至关重要。C反应蛋白（CRP）已用于临床环境中感染和炎症反应的监测。嗜铬粒蛋白A（CGA）也可用于类似目的，并可能提供更为准确的炎症水平评估结果。 18. 作为一种观察金属植入物整合的可能方法 体内我们提出一种通过高效液相色谱法（HPLC）分析动物血液样本并结合后续蛋白质测序，以持续监测植入物全身效应的方法。该方法的完善有望避免常规的终点组织学分析。金属植入物的组织切片是一项耗时、繁琐且昂贵的操作，且仅能在特定时间点进行。因此，根据欧盟近期关于动物实验的规定，设计合理的血液检测方法以提供有关植入物状态的可靠信息，将成为减少动物实验的可行途径。
本文介绍的方法可用于通过功能化改性提升金属植入物的性能，或为监测现有植入物提供一种替代方案。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>二恶烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360481</td><td>有毒物质，须在通风橱内严格操作</td></tr><tr><td>聚-L-乳酸（PLLA） &lt;br/&gt; i. 聚-L-乳酸特性粘度 ~0.5 dl/g&lt;br/&gt; ii. 聚-L-丙交酯 特性黏度 ~2.0 dl/g </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94829, 81273</td><td>分子量和特性粘度的选择取决于具体应用。</td></tr><tr><td>PRONOVA UP LVG（海藻酸钠）</td><td>诺瓦矩阵</td><td>4200006</td><td>低黏度（20–200 mPa·s）</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白（牛源）</td><td>Symatese</td><td>CBPE2US100</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素，两性霉素B </td><td>Promocell</td><td>C42020</td><td></td></tr><tr><td>京尼平</td><td>Wako</td><td>0703021</td><td></td></tr><tr><td>硅氮化物探针，其弹簧常数为 0.03 N/m&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;. </td><td>Bruker</td><td>MSCT</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱用三氟乙酸，&amp;ge;99.0% </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td>危险材料，请严格遵循材料安全数据表（MSDS）</td></tr><tr><td>乙腈，用于高效液相色谱&amp;ge;99.9% </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（通用型细胞膜标记） </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>兔C反应蛋白（CRP）ELISA试剂盒</td><td>Genway Bio</td><td>GWB-9BF960</td><td></td></tr><tr><td>DMSO，生物试剂 &amp;ge;99.7% </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Multimode Nanoscope IV 原子力显微镜</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Procise 微量测序仪 </td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultima 3000 HPLC 系统 </td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>日立扫描电子显微镜 TM 100</td><td>日立</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦扫描激光显微镜 Zeiss LSM 510 </td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p类=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;表1. 材料与试剂列表&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

具有孔隙梯度、聚电解质及其间接监测的金属植入物多尺度改性 在体

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

金属植入物，尤其是钛植入物，广泛应用于临床。植入物在组织中的长入与整合是决定临床效果成功与否的重要参数。为了改善组织整合，已开发出多孔金属植入物。金属泡沫的开孔结构极具优势，因其孔隙区域可在不损害整体结构机械性能的前提下进行功能化修饰。本文描述了基于钛微珠的多孔钛植入物的此类改性方法。利用钛固有的疏水性等物理特性，可在基于微珠的金属植入物内部构建疏水性孔隙梯度，同时基于亲水性天然聚合物构建类似基底膜的结构。三维孔隙梯度通过聚-L-乳酸（PLLA）等合成聚合物经冷冻萃取法制备而成。二维纳米纤维表面则通过胶原蛋白/海藻酸钠体系形成，并使用天然交联剂京尼平进行交联。该纳米纤维膜采用逐层（LbL）沉积法，由带相反电荷的两种分子——胶原蛋白与海藻酸钠交替沉积构建而成。最终可获得一种不同区域可容纳不同类型细胞的植入物，这对于许多多细胞组织的再生具有必要性。通过这种方式，可控制不同类型细胞在不同方向上的迁移行为。本文以气管再生为例描述了该系统，但其亦可针对其他靶器官进行调整。文中详细阐述了细胞迁移分析及构建不同孔隙梯度的可能方法。此类植入物分析的下一步是植入后的表征。然而，金属植入物的组织学分析过程漫长且繁琐，因此为监测宿主对金属植入物的反应 体内 一种基于监测绿原酸（CGA）和不同血液蛋白的替代方法也有所描述。这些方法可用于开发 体外 定制的迁移与定植实验，也可用于功能化金属植入物的分析 体内 无需组织学检查。

孔隙梯度的形成
通过改变PLLA溶液的浓度，可以调控植入物外腔侧孔隙的尺寸。孔隙的大小和形状受到钛植入物存在的显著影响（图1a 和 图1b）。孔径范围为40–100 μm，使用较低浓度的溶液会形成更小的孔隙。而在内腔侧，孔径受限于溶剂的有限萃取，约为9 μm 23，小于成纤维细胞的平均尺寸。通过在室温下增加一个孵育步骤，可获得双层多孔结构，即较大孔隙的孔壁本身也具有微孔性。这一特性对于较厚的植入物尤为重要，因为它有助于气体和营养物质的传输（图1c）。
纳米原纤维基底膜模拟物的形成
在形成孔隙梯度后，可将胶原/海藻酸盐薄膜层添加到结构的顶部（图2）。该薄膜层在聚-L-乳酸（PLLA）泡沫上方具有良好的稳定性，即使在无泡沫的情况下也能维持在表面（图3a 和 图3b）...

在本视频中，我们将演示用于多孔金属植入物的改性技术，以提升其功能并控制细胞迁移。这些技术包括构建孔隙梯度以调控三维环境中的细胞运动，以及制备模拟基底膜的结构以调控二维环境中的细胞运动。此外，还介绍了一种基于高效液相色谱（HPLC）的方法，通过分析血液蛋白来监测植入物在体内的整合情况。

金属植入物，尤其是钛植入物，广泛应用于临床。组织向这些植入物内生长并与其整合……

本实验的总体目标是通过在多个尺度上对金属植入物进行改性，以调控细胞在体外和体内的行为。首先，通过在三维管状植入物内构建孔径梯度，并采用Biofreeze萃取法实现这一目标；第二步是利用胶原蛋白和海藻酸钠，通过逐层自组装方法构建纳米纤维状基底膜模拟结构。接下来，介绍一种通过血液血浆分析来间接监测此类植入物在植入后情况的方法。本文展示了高效液相色谱（HPLC）及后续的肽段测序技术，最终实现一种可根据需要在不同区域容纳不同类型细胞的植入物。尽管该系统可为改造金属植入物提供途径，但仍可获得某些多细胞组织。它还可应用于三维细胞培养模型系统，例如人工组织或疾病模型。我们最初是在尝试寻找一种技术以控制细胞在多孔钛植入物周围体内移动时，提出了该方法的构想。开始此操作前，需按照书面文本中所述的冷冻与提取步骤，对植入物进行清洗，并设计和制造聚四氟乙烯（Teflon）模具。通过将聚合物粉末加入有机溶剂中，制备合成聚合物PLLA在二噁烷和水二元混合体系中的溶液。使用磁力搅拌器将混合物加热至60摄氏度，以获得均一溶液。选择该温度是因为它是后续用于将溶液注入植入体的精密玻璃注射器所能耐受的最高温度。同时，根据植入物的孔隙率并考虑冷冻溶液体积的变化，计算所需聚合物溶液的体积。接下来，使用精度为 0.1 微升的精密玻璃注射器将溶液注入植入物中。聚合物浓度的下限为 3%，以确保可重复地形成 PO 浓度梯度；当浓度超过 6% 时，难以在较厚样品中获得均匀分布。将样品直接在 -80 摄氏度下冷冻，或先在室温下孵育 30 分钟后再进行冷冻。冷冻条件在一定程度上决定了孔隙的形成。因此，可根据目标孔隙率调整冷冻条件。将样品在-80°C下保存过夜。将模具在冷冻状态下分离是非常困难的一步。应小心操作，尽量减少冷冻的底部溶液与模具的接触。借助头皮刀，将植入物浸入预冷的80%乙醇中，以获得孔隙率梯度。使用预冷的手术刀除去管状植入物中除芯轴以外的所有模具部件，或除去盘状植入物中除底部以外的所有部件，并在-20摄氏度下过夜进行萃取。提取后，移除残留的模具部件并使植入物自然风干。为表征结构的整体孔隙率，需进行汞压测孔法分析。在此示例中，汞压孔隙率测量结果显示了明显的峰，分别对应于植入物两侧的孔隙以及分散分布的小孔隙。然而，更为关键的数据是管腔内表面与管腔外表面孔隙率之间的差异，该差异可通过 ImageJ 进行孔径分布分析。随后通过扫描电子显微镜观察样品的冷冻断裂横截面。由于所用植入物具有开放的多孔结构，且钛具有反射光线的能力，因此可以在多孔植入物内部对标记的细胞进行Z轴层扫成像。使用PKH26或钙黄绿素AM标记的细胞，可通过共聚焦激光显微镜观察植入物内多层结构的形成。采用浸渍机器人操作可获得最高的重复性。然而，如果没有浸渍机器人，这些步骤也可以手动完成。制备胶原溶液时，使用医用级I型胶原蛋白和海藻酸钠。在150毫摩尔浓度下，每种成分的优化浓度均为每升0.5克。在 pH 3.8 的氯化钠柠檬酸盐缓冲液中溶解胶原蛋白溶液过夜，以确保其均匀性。3.8 的酸性 pH 值对于各层的稳定形成是必需的，因为在交联前该结构本身不稳定。在中性 pH 条件下设计一种专用夹具，用于在聚电解质多层膜制备过程中配合浸渍机器人使用。将多层膜沉积在仅由钛制成的种植体表面，或沉积在如文中所述经过修饰的种植体表面。使用浸渍机器人系统，首先将种植体浸入海藻酸钠溶液中 15 分钟，然后用 pH 3.8 的 150 毫摩尔氯化钠溶液冲洗结构 5 分钟。随后将样品浸入胶原溶液中孵育15分钟。为首先稳定基底膜，需配制浓度为100毫摩尔的明胶交联溶液。在A-D-M-S-O柠檬酸盐缓冲液中，按1:4的体积比，先将明胶溶解于DMSO组分中，再加入水相组分，以避免结块。随后将样品浸入该交联溶液中，交联12至24小时。用大量 pH 3.8 的柠檬酸盐缓冲液冲洗。清洗步骤完成后，通过紫外照射 30 分钟或使用抗生素-抗真菌溶液浸泡对样品进行灭菌。决定基底膜模拟物质量的主要参数是其厚度和纤维直径。使用原子力显微镜或接触模式下获得的荧光显微镜（FM）图像计算纤维直径。使用氮气流干燥样品后，在成像前需对每张图像中至少10根纤维的厚度进行定量分析，以确定平均纤维厚度。利用Image J软件，在完成胶原-海藻酸钠24层双层胶原多层膜的干燥后，可通过划痕实验测定薄膜的厚度。首先使用荧光显微镜（FM），在光学显微镜下定位划痕区域后，用注射器针头在膜表面划痕，随后在划痕边界处对10×10平方微米的区域进行荧光显微成像。使用原子力显微镜（AFM）软件获取的轮廓图计算高度，从而得到薄膜层的厚度。按照文中所述方法将装置植入兔气管后，从其耳缘静脉采集血样，在4°C条件下以5,000 RPM离心20分钟。采用含0.1%三氟乙酸的溶液提取兔血浆后，取上清液用于分析。采用核细胞反相 305 C 18 柱，通过反相高效液相色谱法对血浆蛋白质成分进行纯化。使用文本方案中所述的溶剂体系和流速，在 214 和 280 纳米波长处记录吸光度。收集洗脱峰对应的组分，随后通过蒸发浓缩。使用真空浓缩时，需在样品完全干燥前停止操作。在植入期间的不同时间点，对所获得的峰进行比对分析。选取在植入过程中呈现一致变化趋势的纯化肽段，通过自动Edman测序进行鉴定。将样品加载至经多聚-L-赖氨酸处理的玻璃纤维滤膜，使用精密微量测序仪通过自动Edman降解法测定纯化肽段的末端序列。下一步是通过C18柱层析鉴定苯基硫代乙内酰脲氨基酸。获得序列后，可利用Blast软件结合Swiss-Prot蛋白质数据库进行比对鉴定。通过改变PLLA溶液的浓度，可以调控植入物外腔侧孔隙的大小。钛植入物的存在显著影响了孔隙的尺寸和形状。使用较低浓度时，孔隙尺寸在40至100微米之间，浓度越低，孔隙越小；而内腔侧的孔隙尺寸受限于受限萃取过程，约为9微米，小于成纤维细胞的平均尺寸。通过在室温下增加一个孵育步骤，可以获得双孔结构，其中较大孔隙的孔壁自身也具有孔隙。这一特性对于较厚的植入物非常重要，因为它将促进气体和营养物质的传输。在形成孔隙梯度后，可以在该结构的顶部添加胶原-海藻酸盐薄膜层。该薄膜层在PLLA泡沫顶部稳定存在，即使在不存在泡沫的纳米级胶原纤维结构时，也能在表面维持。随着薄膜层的生长，其生长呈指数增长。因此，可获得厚度达数百纳米的厚膜。多孔钛植入物与宿主组织整合，并在体内植入后4至6周内完全被组织填充，如 explanted 植入物的横截面所示。孔隙内的组织为成熟的结缔组织，具有良好的血管化水平。在此期间，HPLC 分析显示在植入过程中出现明显且波动的峰形变化。感兴趣的峰组分经测序确定为α和β血红蛋白半链，其变化趋势与C反应蛋白读数相似。一旦掌握，只要操作得当，该技术可在一天内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备三维多尺度PO梯度，用于金属植入物的改性及细胞培养实验。通过冷冻提取和成膜分层的方法，可简便地制备用于细胞的改性植入物或微环境。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

多尺度孔梯度，聚电解质和间接监测改性金属植入物<em&gt;在体内</em

本文详细介绍了基于微针的多重传感器的构建方法。该装置正在被开发用于对多种分析物进行原位采样和电化学分析，具有快速且选择性高的特点。我们预期这类基于微针的传感器将在临床医学和生物医学研究中得到应用。...

基于中空微针的多通道透皮电化学传感传感器

本文介绍了一种用于构建生物相容性多层基质的独特策略，该基质具有不同层之间的连续界面，适用于组织工程。此类支架可通过多种生物、化学或力学信号，为调控细胞行为提供理想的可定制环境...

密度梯度多层聚合（DGMP）：一种用于组织工程中构建多区室、可定制支架的新型技术

讨论了一种方法，通过该方法 体内 刺激响应材料的力学行为随时间变化被监测。样品进行测试 离体 使用带有环境控制的微拉伸测试仪模拟生理环境。这项工作进一步促进了对 体内...

环境可控的微拉伸测试用于力学自适应聚合物纳米复合材料的研究 离体 表征

可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在 原位...

用于三维细胞培养的自报告支架

本文介绍了一种改进的机械测试方法，用于评估骨组织与候选植入物表面之间的锚定强度。该方法可使破坏力精确地垂直或平行于植入物表面平面，并能准确地将破坏力施加于特定的种植体周围区域。...

一种改进的力学测试方法以评估骨-植入物锚定性能

通过一种包含两个步骤的方法制备了具有生物活性且机械性能可靠的金属支架：首先采用动态冷冻铸造法制备多孔钛，然后对钛支架进行涂层和致密化处理。该致密化过程简单、高效，并可适用于制备功能梯度支架。...

用于生物医学应用的可调机械性能与生物活性金属支架的制备

本研究采用熔融共混与选择性浸出相结合的方法制备了聚乳酸/聚乙二醇（PLA/PEG）支架。该方法可精确调控孔隙率和孔径，从而构建出具有三层结构的支架。同时，在生理环境中评估了其力学性能。...

一种简便且环保的制备具有梯度孔径聚乳酸支架的方法

本方案描述了一种基于溶液法的高性能柔性透明电极制备策略，该电极具有完全嵌入式厚金属网格结构。通过该工艺制备的柔性透明电极表现出目前已报道中最高的性能之一，包括极低的方块电阻、高光学透过率、弯曲条件下的机械稳定性、强基底附着力、表面平滑性以及环境稳定性。...

可扩展的溶液法加工嵌入式金属网格高性能柔性透明电极制备策略

从分离的植入物中提取细胞，并通过流式细胞术对其进行表征，可显著促进对植入物免疫应答模式的理解。本文描述了一种从分离的植入物中精确分离细胞并进行染色以用于流式细胞分析的方法。...

高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

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硅平面皮层内微电极表面处理工具

我们提出了一种在多个层次水平上评估骨再生的实验方案。该多模态方法能够实现跨不同长度尺度的结构分析，有效解决了样本制备中的挑战，并为评价生物材料促进骨再生的效果提供了可靠的分析流程。...

评估骨再生与支架性能的多模态方法

了解多尺度孔梯度改性金属植入物技术，通过冷冻萃取法制备孔径梯度，并利用层层组装技术构建胶原-海藻酸钠纳米纤维基底膜模拟物，结合HPLC血液分析实现植入物整合的间接监测。

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