具有孔隙梯度、聚电解质及其间接监测的金属植入物多尺度改性 在体

本实验的总体目标是通过在多个尺度上对金属植入物进行改性，以调控细胞在体外和体内的行为。首先，通过在三维管状植入物内构建孔径梯度，并采用Biofreeze萃取法实现这一目标；第二步是利用胶原蛋白和海藻酸钠，通过逐层自组装方法构建纳米纤维状基底膜模拟结构。

接下来，介绍一种通过血液血浆分析来间接监测此类植入物在植入后情况的方法。本文展示了高效液相色谱（HPLC）及后续的肽段测序技术，最终实现一种可根据需要在不同区域容纳不同类型细胞的植入物。尽管该系统可为改造金属植入物提供途径，但仍可获得某些多细胞组织。

它还可应用于三维细胞培养模型系统，例如人工组织或疾病模型。我们最初是在尝试寻找一种技术以控制细胞在多孔钛植入物周围体内移动时，提出了该方法的构想。开始此操作前，需按照书面文本中所述的冷冻与提取步骤，对植入物进行清洗，并设计和制造聚四氟乙烯（Teflon）模具。

通过将聚合物粉末加入有机溶剂中，制备合成聚合物PLLA在二噁烷和水二元混合体系中的溶液。使用磁力搅拌器将混合物加热至60摄氏度，以获得均一溶液。选择该温度是因为它是后续用于将溶液注入植入体的精密玻璃注射器所能耐受的最高温度。

同时，根据植入物的孔隙率并考虑冷冻溶液体积的变化，计算所需聚合物溶液的体积。接下来，使用精度为 0.1 微升的精密玻璃注射器将溶液注入植入物中。聚合物浓度的下限为 3%，以确保可重复地形成 PO 浓度梯度；当浓度超过 6% 时，难以在较厚样品中获得均匀分布。将样品直接在 -80 摄氏度下冷冻，或先在室温下孵育 30 分钟后再进行冷冻。

冷冻条件在一定程度上决定了孔隙的形成。因此，可根据目标孔隙率调整冷冻条件。将样品在-80°C下保存过夜。

将模具在冷冻状态下分离是非常困难的一步。应小心操作，尽量减少冷冻的底部溶液与模具的接触。借助头皮刀，将植入物浸入预冷的80%乙醇中，以获得孔隙率梯度。使用预冷的手术刀除去管状植入物中除芯轴以外的所有模具部件，或除去盘状植入物中除底部以外的所有部件，并在-20摄氏度下过夜进行萃取。

提取后，移除残留的模具部件并使植入物自然风干。为表征结构的整体孔隙率，需进行汞压测孔法分析。

在此示例中，汞压孔隙率测量结果显示了明显的峰，分别对应于植入物两侧的孔隙以及分散分布的小孔隙。然而，更为关键的数据是管腔内表面与管腔外表面孔隙率之间的差异，该差异可通过 ImageJ 进行孔径分布分析。随后通过扫描电子显微镜观察样品的冷冻断裂横截面。

由于所用植入物具有开放的多孔结构，且钛具有反射光线的能力，因此可以在多孔植入物内部对标记的细胞进行Z轴层扫成像。使用PKH26或钙黄绿素AM标记的细胞，可通过共聚焦激光显微镜观察植入物内多层结构的形成。采用浸渍机器人操作可获得最高的重复性。

然而，如果没有浸渍机器人，这些步骤也可以手动完成。制备胶原溶液时，使用医用级I型胶原蛋白和海藻酸钠。在150毫摩尔浓度下，每种成分的优化浓度均为每升0.5克。

在 pH 3.8 的氯化钠柠檬酸盐缓冲液中溶解胶原蛋白溶液过夜，以确保其均匀性。3.8 的酸性 pH 值对于各层的稳定形成是必需的，因为在交联前该结构本身不稳定。

在中性 pH 条件下设计一种专用夹具，用于在聚电解质多层膜制备过程中配合浸渍机器人使用。将多层膜沉积在仅由钛制成的种植体表面，或沉积在如文中所述经过修饰的种植体表面。使用浸渍机器人系统，首先将种植体浸入海藻酸钠溶液中 15 分钟，然后用 pH 3.8 的 150 毫摩尔氯化钠溶液冲洗结构 5 分钟。

随后将样品浸入胶原溶液中孵育15分钟。为首先稳定基底膜，需配制浓度为100毫摩尔的明胶交联溶液。在A-D-M-S-O柠檬酸盐缓冲液中，按1:4的体积比，先将明胶溶解于DMSO组分中，再加入水相组分，以避免结块。随后将样品浸入该交联溶液中，交联12至24小时。

用大量 pH 3.8 的柠檬酸盐缓冲液冲洗。清洗步骤完成后，通过紫外照射 30 分钟或使用抗生素-抗真菌溶液浸泡对样品进行灭菌。决定基底膜模拟物质量的主要参数是其厚度和纤维直径。使用原子力显微镜或接触模式下获得的荧光显微镜（FM）图像计算纤维直径。

使用氮气流干燥样品后，在成像前需对每张图像中至少10根纤维的厚度进行定量分析，以确定平均纤维厚度。利用Image J软件，在完成胶原-海藻酸钠24层双层胶原多层膜的干燥后，可通过划痕实验测定薄膜的厚度。首先使用荧光显微镜（FM），在光学显微镜下定位划痕区域后，用注射器针头在膜表面划痕，随后在划痕边界处对10×10平方微米的区域进行荧光显微成像。

使用原子力显微镜（AFM）软件获取的轮廓图计算高度，从而得到薄膜层的厚度。按照文中所述方法将装置植入兔气管后，从其耳缘静脉采集血样，在4°C条件下以5,000 RPM离心20分钟。采用含0.1%三氟乙酸的溶液提取兔血浆后，取上清液用于分析。

采用核细胞反相 305 C 18 柱，通过反相高效液相色谱法对血浆蛋白质成分进行纯化。使用文本方案中所述的溶剂体系和流速，在 214 和 280 纳米波长处记录吸光度。收集洗脱峰对应的组分，随后通过蒸发浓缩。

使用真空浓缩时，需在样品完全干燥前停止操作。在植入期间的不同时间点，对所获得的峰进行比对分析。选取在植入过程中呈现一致变化趋势的纯化肽段，通过自动Edman测序进行鉴定。

将样品加载至经多聚-L-赖氨酸处理的玻璃纤维滤膜，使用精密微量测序仪通过自动Edman降解法测定纯化肽段的末端序列。下一步是通过C18柱层析鉴定苯基硫代乙内酰脲氨基酸。获得序列后，可利用Blast软件结合Swiss-Prot蛋白质数据库进行比对鉴定。

通过改变PLLA溶液的浓度，可以调控植入物外腔侧孔隙的大小。钛植入物的存在显著影响了孔隙的尺寸和形状。使用较低浓度时，孔隙尺寸在40至100微米之间，浓度越低，孔隙越小；而内腔侧的孔隙尺寸受限于受限萃取过程，约为9微米，小于成纤维细胞的平均尺寸。

通过在室温下增加一个孵育步骤，可以获得双孔结构，其中较大孔隙的孔壁自身也具有孔隙。这一特性对于较厚的植入物非常重要，因为它将促进气体和营养物质的传输。在形成孔隙梯度后，可以在该结构的顶部添加胶原-海藻酸盐薄膜层。

该薄膜层在PLLA泡沫顶部稳定存在，即使在不存在泡沫的纳米级胶原纤维结构时，也能在表面维持。随着薄膜层的生长，其生长呈指数增长。因此，可获得厚度达数百纳米的厚膜。

多孔钛植入物与宿主组织整合，并在体内植入后4至6周内完全被组织填充，如 explanted 植入物的横截面所示。孔隙内的组织为成熟的结缔组织，具有良好的血管化水平。在此期间，HPLC 分析显示在植入过程中出现明显且波动的峰形变化。

感兴趣的峰组分经测序确定为α和β血红蛋白半链，其变化趋势与C反应蛋白读数相似。一旦掌握，只要操作得当，该技术可在一天内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备三维多尺度PO梯度，用于金属植入物的改性及细胞培养实验。

通过冷冻提取和成膜分层的方法，可简便地制备用于细胞的改性植入物或微环境。