斑马鱼幼虫收缩过程中的力测量以评估肌肉功能

本实验的总体目标是测量斑马鱼幼体躯干肌肉在最大收缩期间产生的力。首先制备缝合环，用于在力测量过程中固定幼体。随后，将麻醉后的幼体置于实验腔内。

就位后，记录最大单次收缩期间产生的力。最后一步是测量躯干肌肉的尺寸，以便将峰值力标准化为肌肉横截面积。最终，通过测量收缩期间的力生成情况，可反映肌肉功能及整体肌肉健康状况的变化。

尽管我们以野生型斑马鱼幼鱼为例展示该方法，但它同样适用于经过基因改造的幼鱼，或经药物或毒物处理的幼鱼。该方法可用于表征肌肉疾病模型并评估治疗方法，或用于研究肌肉发育、损伤及化学毒性。第一步是制备将用于固定幼鱼的缝合环。

进行力学测试时，使用镊子将非无菌缝线分成三股。分离后，开始在其中一股上打双单结，但在完全拉紧结之前停止，以形成一个小环。不要通过拉紧来闭合环，而是使用剪刀将线尾多余的缝线剪除。

将环置于便利贴的粘性面，以备后续使用。为每只待测幼虫制备两个缝合环。首先，将测试装置放置在体视显微镜的载物台上。

接下来，将力传感器和长度控制器的电缆连接到测试装置上。打开力传感器和长度控制器，并拨动长度控制器前面的开关，使长度控制器管路与一次性移液器相连。

用测试溶液填充实验腔室。使用镊子夹住缝合线环的一端作为抓握点。弯曲部分的环可能会使缝合线弯曲并导致其在后续步骤中断裂。

将一个环挂在力传感器管上，另一个环挂在长度控制器上。用一次性移液管将一条斑马鱼幼鱼转移到盛有测试溶液的小培养皿中。待麻醉剂起效后，轻轻触碰尾部以确认其无触碰诱发的游泳反应。接着，使用玻璃移液管配合镊子将幼鱼转移至实验腔室中。

轻轻将幼虫的前部穿过连接在力传感器管上的缝合线环，捏住缝合线环的两端。用镊子同时向后拉紧线的两端，使线环在卵黄囊或鱼鳔后方收紧。握住其中一端缝合线并拉动，使幼虫围绕管子旋转90度，直至幼虫的侧面朝上。

使用连接在长度控制器上的 X、Y、Z 定位装置，沿 x 轴方向移动长度控制器管，使其位于幼虫躯干和尾部下方。长度控制器管的两端与力传感器管之间应留出一定空间。接着，将缝合线环引导至幼虫尾部上方，并收紧缝合线环。

如先前所示，您可能需要旋转幼虫的后部，使其侧面朝上。固定位置后，剪断缝合线环的线头。使用 XY 和 Z 轴定位装置，缓慢降低管子，直至其刚好接触培养 chamber 的底部。

然后将幼虫提升至距离腔室底部适当的位置，该位置应处于后续使用的倒置显微镜物镜的工作距离范围内。最后，调节长度控制管，使幼虫的长轴与力传感器管的长轴对齐。

首先，将测试装置移至倒置显微镜的载物台上。接着，将水浴循环器的温度计和温度控制器连接到测试装置上。打开必要的组件，并将温度控制器的设定值调整至所需数值。

将刺激器的电缆连接到测试装置上。打开刺激器的电源，但此时不要对幼虫进行刺激。为确认幼虫与腔室底部平行，请观察幼虫位于管端之间的部分。

如果保持平行，必要时幼虫的两端都应处于焦点范围内。调整力传感器管，直到幼虫两端均清晰对焦且幼虫处于平行状态。打开视频肌节长度测量系统，并旋转视频摄像头，使横纹与视频画面的边框平行。

条纹间距被用作肌节长度的指标。调节显微镜以聚焦于周边的肌纤维，并记录所观察到的肌节长度。如有必要，调节长度控制器以缩短幼虫，直至肌节长度小于最佳值，以优化单收缩力。

首先，将刺激器的输出电流设置为低强度，然后编程专用软件以输出持续时间为0.2毫秒的电流脉冲。输出第一个脉冲，并使用示波器测量峰值抽搐力。

以50毫安为增量逐步增加电流，并在每个新的电流水平下测量峰值抽搐力。随着刺激电流的增加，每次抽搐之间等待30秒，以防止疲劳。峰值抽搐力通常会增加至最大值，然后逐渐下降，对应幼虫产生抽搐的电流水平。

最大拉力即为确定的最佳刺激电流。将电流强度设定为最佳刺激电流，并调整幼虫的长度，以引发最大的肌肉颤搐力。最后，诱发幼虫肌肉的一次颤搐。使用示波器记录力量反应，并保存记录以供后续分析。

为测量肌肉组织的尺寸，将测试装置移回体视显微镜下。使用图像处理标尺（IP scale），从侧面观察并测量肌肉组织的高度。在解剖学标志位置进行测量。

例如，此处用红色标记的泌尿生殖孔。然后注意不要改变幼虫的长度，利用缝合环的尾端将幼虫旋转90度，以便从底部观察幼虫。

从底部观察，测量肌肉的宽度。最后使用微型刀片切断缝合线环，使幼鱼从测试装置中释放。在健康的野生型斑马鱼幼鱼中，肌纤维应相互平行，纤维之间无明显间隙，并可见明显的横纹；不具备这些特征或出现明显损伤（如此处所示的纤维脱离）的野生型斑马鱼幼鱼应予以弃用。图中显示了单条斑马鱼幼鱼的峰值抽搐力与刺激电流的关系曲线。

最佳刺激电流通常在400至600毫安之间。此处显示的是单个幼虫在最大单收缩过程中记录到的一个代表性力学反应。不同年龄的野生型幼虫的峰值力值范围为0.9至1.7。

毫牛顿，且较年长的幼虫产生的力大于较年轻的幼虫。即使将峰值力标准化为肌肉横截面积后，较年长的幼虫产生的力仍大于较年轻的幼虫。在进行此操作时，重要的是要将缝合线环收紧到足以防止幼虫在力传感器和长度控制器管周围轻易旋转的程度。

如果缝合环过松，幼虫产生的力将无法完全传递到力传感器上，导致最大抽搐力被低估。