在收缩力测量评估肌肉功能在斑马鱼幼虫

该程序的总体目标是测量斑马鱼、幼虫、躯干肌肉最大收缩过程中产生的力。这是通过首先制作缝合环来实现的，这些缝合环将用于在力测量期间将幼虫固定到位。接下来，将麻醉的幼虫放置在实验室内。

一旦就位，在最大抽搐收缩期间记录力。最后一步是测量躯干肌肉组织的尺寸，以便将峰值力标准化为肌肉横截面积。最终，测量收缩过程中产生的力用于显示肌肉功能和整体肌肉健康的变化。

虽然我们使用野生型斑马鱼幼虫演示了这种方法，但它也可以用于转基因幼虫或用药物或毒物处理的幼虫。然后，该方法可用于表征肌肉疾病模型和评估治疗或研究肌肉发育、损伤或化学毒性。第一步是准备用于将幼虫固定到位的缝合环。

在力测试期间，使用镊子将未消毒的缝合线分成三股。分开后，开始在其中一根股线上打一个双反手结，但在完全收紧结之前停下来，形成一个小环。相反，要完成循环，请使用剪刀从尾部剪下多余的缝合线。

将 Loop 放在便签的粘性面上以备后用。为将要测试的每只幼虫制作两个缝合环。首先，将测试设备放在立体显微镜的载物台上。

接下来，将力传感器和长度控制器电缆连接到测试设备。打开力传感器和长度控制器，然后拨动长度控制器前面的开关。这使得长度控制管与一次性转移架桥。吸管。

用测试溶液填充实验室。用镊子通过其中一条尾巴夹住缝合环作为夹持。弯曲部分的环会使缝合线扭结，并导致其在后续步骤中断裂。

将一个环挂在力传感器管上，另一个挂在长度控制器上 用一次性移液管将斑马鱼幼虫转移到装满测试溶液的小培养皿中。麻醉剂生效后，轻轻轻推尾巴以验证是否缺乏触摸诱发的游泳。接下来，使用玻璃移液器用镊子将幼虫转移到实验室。

轻轻引导幼虫的前部穿过力传感器管上的缝合环，抓住缝合环的两尾。同时拉动它们，用镊子收紧橡囊或鱼鳔后面的环。握住一条缝合线尾巴并拉动，使幼虫绕管旋转 90 度，直到幼虫的侧面朝上。

使用连接到长度控制器的 X、Y、Z 定位装置，沿 x 轴移动长度控制器管，并在幼虫的躯干和尾巴下方移动。在长度控制器管和力传感器管的末端之间留出空间。接下来，将缝合环引导到幼虫的尾部并拧紧缝合环。

如前所述，您可能需要旋转幼虫的后部，使侧侧朝上。就位后，修剪缝合环尾部。使用 XY、Z 定位装置缓慢降低管子，直到它们刚好接触到腔室底部。

然后将幼虫抬高到距腔室底部适当的距离。这应该在稍后使用的倒置显微镜物镜的工作距离内。最后，调整长度控制器管，使幼虫的长轴与力传感器管的长轴对齐。

首先，将测试设备移动到倒置显微镜的载物台上。接下来，将水浴循环器、温度计和温度控制器连接到测试装置上。打开必要的组件并将温度控制器上的设置调整到所需的值。

将电缆从刺激器连接到测试设备。打开刺激器的电源，但此时不要刺激幼虫。要检查幼虫是否平行于腔室底部，请查看管两端之间的幼虫部分。

如果平行，如果需要，幼虫的两端将聚焦。调整力传感器管，直到两端都聚焦并且幼虫平行。打开视频肌节长度系统并旋转摄像机，使条纹平行于视频帧的两侧。

横纹间距用作肌节长度的指标。调整显微镜以聚焦于外周纤维并注意指示的肌节长度。如有必要，调整长度控制器以缩短幼虫，直到肌节长度小于最佳 以优化抽搐力。

首先，将刺激器上的输出电流设置为低幅度，然后对专用软件进行编程以传递电流脉冲。持续时间为 0.2 毫秒。提供第一个脉冲并使用示波器测量峰值抽搐力。

以 50 毫安的增量增加电流，并测量每个新电流水平的峰值抽搐力。在抽搐之间等待 30 秒，以防止刺激电流增加时疲劳。峰值抽搐力通常增加到最大值，然后逐渐减小幼虫产生的电流。

最大的力是最佳刺激电流，一旦确定，将电流幅度设置为最佳刺激电流并调整幼虫的长度以引起最大的抽搐力。最后，引起幼虫肌肉的抽搐。使用示波器记录力响应并保存记录以供后续分析。

要测量肌肉组织尺寸，请将测试设备移回立体显微镜。使用 IP 刻度，测量从侧面观察的肌肉组织高度。在解剖标志处进行测量。

例如，此处标记为红色的泌尿生殖器开口。然后注意不要改变幼虫的长度。使用缝合环尾部将幼虫旋转 90 度，以便从底部观察幼虫。

测量从底部观察的肌肉组织的宽度。最后，用微型刀片切开缝合环，将幼虫从测试设备中释放出来 健康的野生型斑马鱼幼虫，肌肉纤维应彼此平行，它们之间没有大的间隙，并且有证据 野生型斑马鱼幼虫不表现出这些特征或有明显损伤，例如此处看到的纤维脱落，应丢弃在这里。绘制了单个斑马鱼幼虫的峰值抽搐力与刺激电流的关系图。

最佳刺激电流通常在 400 到 600 毫安之间。此处显示了在单个幼虫的最大抽搐收缩期间收集的代表性力响应。这里。不同年龄的野生型幼虫的峰值力值范围为 0.9 至 1.7。

年长幼虫的毫牛顿比年轻的幼虫产生更大的力。即使在峰值力归一化为横截面肌肉面积后，老年幼虫也比年轻幼虫产生更大的力。在尝试此程序时，重要的是要将缝合环收紧到足够程度，以便幼虫无法轻松围绕力传感器和长度控制器管旋转。

如果缝合环太松，幼虫产生的力将无法完全传递到力传感器，并且最大抽搐力将被低估。