合成、细胞递送及 在体 树状大分子基pH传感器的应用

以下实验的总体目标是开发基于Dun鼓手（Dun drummers）的新型荧光传感器，以改善其在活细胞体外及体内pH成像中的性能。该目标通过首先将pH敏感染料与树状支架以及其他官能团（如靶向基团或pH不敏感染料）进行偶联来实现。随后进行体外测量，以生成pH校准曲线，进而用于活细胞中的pH成像。

通过电穿孔递送传感器，并利用共聚焦显微镜成像脑细胞外空间的pH值，从而生成pH图谱。在生理和病理神经活动期间，将传感器微量注射至麻醉小鼠的脑内，随后使用双光子显微镜采集荧光数据。

实验结果表明，基于荧光的传感器能够在活细胞及体内以高空间和时间分辨率成功检测pH值的变化。尽管已有多种具有pH敏感特性的荧光染料被使用，但这些染料存在若干缺陷，例如细胞内迁移性差和易发生细胞泄漏。此外，它们也无法实现快速的绝对值定量测量。

本文展示了将pH敏感性染料与D基因支架结合的方法，由于该方法能够实现高空间和时间分辨率的精确测量，因此可作为研究活细胞中由pH调控的生理与病理过程的有力工具。神经系统中pH调节的紊乱与中风、癫痫等多种疾病状态相关，而现有的pH传感器效果不佳，这促使了本研究中所述传感器的设计。尽管本方法在此处应用于pH成像，但它是一种通用策略，也可拓展至其他具有生物学意义的分子物种的检测。

通过选择这种可感应荧光的染料，结合简便且通用的合成方法，使这些操作流程变得简单直接。今天演示该实验步骤的人员为 Giovanni re、Barbara ti、Marco Brody 和 Sebastian Suli。将 pH 指示剂与 Piam Demers 进行偶联时，首先将引物溶解于无水 DMSO 中，终浓度为 50 µM。

在微量离心管中，用无水DMSO配制浓度为10微摩尔的荧光素NHS和四乙基罗丹明NHS（又称TMR）储备液。将1毫升G4季铵盐溶液与8当量（即40微升）的荧光素及8当量（即40微升）的TMR混合。混合物中的摩尔比将反映染料在聚合物上的负载量。室温下搅拌该溶液12小时。

接下来，用去离子水将混合物按1:10稀释，将反应混合物装入截留分子量为10千道尔顿的透析袋中，对去离子水进行透析，并在24小时内更换三次透析液。第二天，将溶液转移至玻璃小瓶中，在-80℃下冷冻数小时。待溶液完全冻结后，将小瓶转移至冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时。

应得到紫色粉末，呈波浪状固体，将其溶解于超纯水中，终浓度为10微摩尔。将溶液分装至1.5毫升微量离心管中，每管50微升，于-20摄氏度保存。

进行体外校准时，在石英比色皿中用2毫摩尔PBS配制500纳摩尔的D drummer溶液。使用极稀的PBS缓冲液以避免滴定过程中pH发生剧烈变化。测定荧光素和TMR的发射光谱，并优化荧光分光光度计的光学设置，以获得良好的信噪比。

接下来，通过加入少量 0.1 N 氢氧化钠和 0.1 N 盐酸进行 pH 滴定。每次加入后，摇动 Q vet 以混匀。等待一分钟使其平衡，然后使用 pH 计测量 pH 值。

每一步骤均应记录荧光素和TMR的微电极发射光谱，且不得有任何改变。在光学设置中，绘制荧光强度随pH变化的曲线。在滴定过程中，杆状结构域信号应不受pH影响。

荧光素信号应呈S形曲线，并使用单结合模型进行拟合，电穿孔的PK值为6.4。将六份10的5次方个HeLa细胞，每份72微升，转移至1.5毫升微量离心管中，用于重悬细胞。加入浓度为2微摩尔的树状聚合物水溶液，向微纯化管中加入3毫升电穿孔缓冲液。

然后使用10微升电穿孔枪头吸取细胞与引物混合物。接着，将微量移液枪插入移液器工作站，并在此处设定微电穿孔脉冲条件。脉冲电压设定为1005伏特。

脉冲宽度设置为35毫秒，脉冲次数在脉冲板后设置为两次。将20微升电穿孔后的细胞加入无抗生素的新鲜培养基的玻璃底培养皿中。电穿孔12小时后，使用针对荧光素和r domine的标准滤光片组，通过共聚焦显微镜观察细胞。

聚焦样本，调节激光功率和探测器增益，以最大化信噪比。如果电穿孔成功，细胞在两个通道中均应呈现明亮的荧光信号。定位情况取决于所用D的大小和电荷。通常如此。

由于内吞作用或共区室化，可见呈小的核周囊泡状的Sun溶酶体定位。若溶酶体定位占主导，即大部分荧光信号定位于囊泡内，而细胞质中可见孔信号，则表明存在毒性，相关测量结果应予弃用。

依次采集两个通道，采集多幅图像并进行平均以提高图像质量。为生成 pH 校准曲线，使用不同 pH 值的缓冲液使细胞内和细胞外的 pH 值保持一致。每个 pH 值下至少采集 20 个细胞的图像，并在 pH 5.5 至 pH 7.5 范围内测量至少五个数据点。

需要注意的是，pH B六对细胞具有毒性，但可短暂耐受，因此应尽可能缩短成像时间。如果观察到细胞凋亡的迹象，应弃用该批细胞并重新开始实验。成像结束后。

使用 ImageJ 或类似软件进行数据分析。首先，确定绿色与红色的比值。然后将该比值对 pH 作图，得到一条线性趋势，从而生成标准曲线，可用于在后续实验中将比值转换为 pH 值。

进行活体样本制备时，选用出生后28至70天的C57BL/6J雄性小鼠和雌性小鼠。用乌拉坦麻醉小鼠后，实施足趾挤压以确认动物已完全麻醉，并涂抹眼膏以减少皮层应激反应和脑水肿。手术期间，按每千克体重2毫克的剂量，肌肉注射地塞米松磷酸钠。

接着，使用手术剪刀剃除动物头部的毛发，然后放置手术巾，并在头皮上涂抹2.5%利多卡因凝胶。用剪刀剪开覆盖两侧半球颅骨的皮瓣。用生理盐水冲洗暴露的骨面，并用镊子轻轻去除骨膜。

这将提供更好的粘附表面。使用胶水和牙科水泥时，安装一个定制的钢制头固定装置，其中心为成像腔，并使用氰基丙烯酸酯将其粘合固定在颅骨表面，位置大致与感兴趣皮层区域平行。用白色牙科水泥将固定装置牢固固定。

固定小鼠头部，通过在目标区域钻孔，进行直径为2至3毫米的开颅手术。在钻孔过程中，需频繁使用注射器向颅骨施加新鲜的无菌人工脑脊液（aCSF），以尽量减少手术期间皮层的热损伤。开颅完成后，将动物转移至成像平台，使头部在物镜下保持静止。

将成像室旋紧至可调节支架上。连接一个自制的塑料面罩至氧气供应装置，以便在实验过程中提供富氧空气，辅助动物呼吸。

为了将传感器注入大脑皮层，使用尖端直径为四毫米的玻璃移液管，并装入氯化银电极。使用一微摩尔的drimmer ER溶液时，该电极将有助于通过微注射装置记录细胞外场电位。将移液管插入皮层，深度约为150微米。

以每平方英寸0.5磅的压力注射一到两分钟，以优化成像的光学设置。调节激光功率以最小化光漂白和光损伤。通常使用的激光功率约为20毫瓦，且光电倍增管（PMT）增益保持在667伏特恒定不变。

将激光波长设置为820纳米以激发传感器，并通过标准的FTSE和Trit滤光片同时检测荧光素和罗丹明的荧光信号。同时将采集频率设置为每秒2帧，用于背景校正。关闭激光快门采集暗场图像，以测量PMT和基底产生的平均热噪声。

最后，采集pH依赖性荧光图像并储存以供后续分析。按照之前的方法分析数据，以评估荧光素和鲁明在体外的行为。将负载后的微粒置于荧光分光光度计上，进行pH滴定实验。

该图展示了一个典型的pH传感器滴定过程。荧光素和罗丹明可分别在488纳米和550纳米处被激发，从而在两个通道之间实现最小的串扰，这一点可以清楚地观察到。荧光素表现出pH依赖性行为，而罗丹明信号在生理pH范围内无明显变化。

因此，这两个信号的比值不依赖于传感器浓度，而仅取决于pH值。为了将指示剂递送至细胞内，采用电穿孔法将Dedere传感器导入HeLa细胞，并按照本视频所述方法进行共聚焦成像。这些共聚焦图像在左侧显示的是荧光素通道的细胞，在中间显示的是R domine通道的细胞，右侧则以pH比值图的形式呈现。

观察到强烈的荧光素和红色荧光信号，二者共定位，表明传感器结构完整。通过将两幅图像逐像素相除重建出比率图，并以伪彩色标度表示。为校准传感器在细胞内的响应，采用离子载体进行pH钳定，如下所示。

指示剂对pH值变化响应迅速，其绿色与红色的比值随之改变。所得数据用于生成校准曲线，以实现精确的pH值测量。校准曲线呈现的线性趋势表明，该传感器能够响应pH值变化，且不受细胞环境干扰。

为了演示基于树状大分子的传感器如何用于活体成像，我们在注射了树状大分子的麻醉小鼠脑内进行了pH成像。使用820纳米激发光同时获取荧光素和罗丹明信号，并基于像素逐点构建比值图，方法类似于活细胞测量。值得注意的是，这些指示剂定位于细胞外空间，图像中非荧光区域对应细胞体或微小血管，可用于验证传感器对pH的响应。

我们采用了高碳酸血症方法。事实上，二氧化碳已知会改变血液和组织中碳酸盐缓冲系统的平衡，从而导致组织酸化。如本图所示，吸入30%的二氧化碳足以引发传感器产生强烈响应，且在恢复对小鼠通气后，该响应可完全逆转。

这些结果表明，基于er的传感器在揭示活细胞及体内pH的生理和病理变化方面具有潜力。A，我们的方法可与其他测量技术（如电生理记录）兼容，从而能够同时获取有关正在进行的生物学过程的互补信息。

该方法在建立后，为细胞生物学和神经生物学领域的研究人员探索培养细胞及活体中受pH调控的过程铺平了道路。