合成，细胞和交货在体内的树状为基础的pH值传感器应用

以下实验的总体目标是开发基于 Dun 鼓手的新型荧光传感器，该传感器具有改进的活细胞和体内体外 pH 成像性能。这是通过首先将 pH 敏感染料与其他基团（例如敏感染料中的靶向基团或 pH 值）偶联到树突支架上来实现的。进行体外测量以在活细胞中的 pH 值成像旁边生成 pH 校准曲线。

传感器通过电穿孔提供，并使用共聚焦显微镜生成 pH 图，以对大脑细胞外间隙的 pH 值进行成像。在生理和病理神经活动期间，传感器被微注射到麻醉小鼠的大脑中。然后使用双光子显微镜获取荧光数据。

获得的结果表明，基于 Drimmer 的传感器成功地以高空间和时间分辨率测量活细胞和体内的 pH 值变化。尽管已经采用了几种具有 pH 敏感行为的烟道染料，但存在一些缺点，例如流动性差和细胞泄漏。此外，他们不允许轻率的公制绝对测量。

在这里，我们展示了 pH 敏感染料与 D 遗传支架的结合，并且由于性能允许以特殊和时间分辨率进行准确测量，该方法可能是研究活细胞中 pH 调节的生理和病理过程的有用工具。神经系统中 pH 调节的破坏与中风和癫痫等多种疾病有关，可用的 pH 传感器被证明效果不佳，导致设计了所提出的传感器。尽管这种 met 已在此处应用 pH h 成像，但它是一种通用方法，可以应用于其他生物相关物种。

通过选择利润感应染料，简单且通用的合成方法使这些程序变得简单明了。今天演示该程序将是 Giovanni re、Barbara ti、Marco Brody 和 Sebastian Suli 将 pH 指示剂与 Piam Demers 共轭。首先将 rimer 溶解在终浓度为 50 μmol 的无水 DMSO 中。

在微量离心管中制备 10 微摩尔荧光素 NHS 和四乙基芜麦碱 NHS（也称为无水 TMR）、DMSO 的储备溶液，1 毫升 G 4 peram dederer 溶液与 8 个当量，或 40 微升荧光素和 8 个当量，或 40 微升 TMR。混合物中的摩尔比将反映 demer 上负载的染料量。在室温下搅拌溶液 12 小时。

接下来，用去离子水将混合物稀释 1 至 10，并将反应混合物装入截留分子量为 10 道尔顿的透析袋中，对去离子水进行透析，并在 24 小时内更换储液槽中的水 3 次。第二天，将溶液转移到玻璃瓶中，并在零下 80 度下冷冻几个小时。当溶液完全冷冻后，将小瓶转移到冻干机中并冷冻干燥 24 小时。

应得到紫色粉末，得到波浪状的固体，并溶于mqe水中。终浓度为 10 微摩尔。将溶液分装在 1.5 mL 微量离心管中，分装 50 微升，并在零下 20 摄氏度下储存。

对于体外校准，在石英 Q vet 中制备 500 纳摩尔的 D drummer 溶液在两毫摩尔 PBS 中。使用非常稀释的 PBS 缓冲液以避免滴定过程中 pH 值的突然变化。测量荧光素和 TMR 的发射光谱，并优化荧光计的光学设置，以实现良好的信噪比。

接下来，加入少量 0.1 正氢氧化钠和 0.1 正盐酸进行 pH 滴定。每次添加后，摇晃 Q vet 混合。等待 1 分钟以达到平衡，然后通过 pH 值测量 pH 值。

应记录每个步骤的荧光素和 TMR 的微电极发射光谱，不得有任何变化。在光学设置中，绘制荧光强度与 pH 值的关系图。对于滴定，棒状 domine 信号应不受 pH 值的影响。

荧光素信号应为 S 形曲线，并且应配备 PK 为 6.4 的单个结合模型进行电穿孔。将 72 μL 的 6 乘以 10 次转移到第 5 个 Hela 细胞中，放入 1.5 mL微量离心管中，以重悬细胞。加入浓度为 2 微摩尔的树突或水溶液，向微量纯化管中加入 3 毫升电穿孔缓冲液。

然后使用 10 μL 电穿孔尖端吸出细胞和 rimer 混合物。接下来，将微量移液器插入移液器站并在此处设置微量纯化脉冲条件。脉冲电压设置为 1005 伏。

脉冲宽度设置为 35 毫秒，脉冲数设置为脉冲板后 2。将 20 微升电穿孔细胞放在玻璃底培养皿上，加入不含抗生素的新鲜培养基。电穿孔后 12 小时，使用共聚焦显微镜使用荧光素和 R Domine 的标准滤光片组对细胞进行成像。

专注于标本并调整激光功率和探测器增益，以最大限度地提高信噪比。如果电穿孔成功，细胞在两个通道中都应该发出明亮的荧光。定位取决于所使用的 D 的大小和电荷。经常。

太阳溶酶体定位，表现为由于内吞作用或复合区室化而出现的小核周囊泡。如果溶酶体定位占主导地位，其中大部分荧光定位于囊泡内，并且在胞质溶胶中观察到孔信号。这意味着毒性，应丢弃测量结果。

依次采集两个通道，采集多张图像并平均图像以提高图像质量。要生成 pH 校准曲线，请使用具有不同 ph 值的 opfor 缓冲液，以将细胞内和细胞外 pH 值聚集在相同的值。每个 pH 值至少采集 20 张细胞图像，并在 pH 5.5 至 pH 7.5 范围内测量至少 5 个点。

它提醒 pH B 6 对细胞有毒，但可以在短时间内耐受，因此请尽可能短地获取图像。如果您看到细胞凋亡的迹象，请丢弃细胞并重新启动。收购后。

使用 image J 或类似软件进行数据分析。首先，确定绿色与红色的比率。然后绘制比率与 pH 值的关系图，以产生线性趋势，该趋势将给出校准曲线，可用于在未来的实验中将比率转换为 pH 值。

对于体内样品制备，在出生后第 28 天和第 70 天之间从 C 57 黑六 J 和雌性小鼠开始。用氨基甲酸乙酯麻醉小鼠后，进行脚趾捏捏以确保动物完全麻醉，并涂抹眼膏以减少皮质应激反应和脑水肿。手术过程中，肌肉注射每公斤体重 2 毫克地塞米松、磷酸钠。

接下来，使用手术剪刀剃掉动物的头部，然后放置手术单并将 2.5% 利多卡因凝胶涂抹在头皮上。用剪刀剪断覆盖两个半球颅骨的皮瓣。用生理盐水和镊子清洗暴露的骨头，轻轻去除骨膜。

这将提供更好的粘合表面。对于胶水和牙科水泥，应用带有中央成像室的定制钢头柱，并使用氰基丙烯酸酯，将其胶合到位，与感兴趣的皮质区域上的颅骨大致平行。用白色牙科水泥将柱子固定到位。

固定鼠标头部，通过在感兴趣区域钻孔进行直径为 2 到 3 毫米的开颅手术。在整个钻孔过程中，经常使用注射器将新鲜的无菌 A CSF 涂抹在颅骨上，以尽量减少手术过程中皮层的加热。开颅手术后，将动物转移到成像台，以保持头部在物镜下方静止。

将成像室拧到可调节柱上。应用连接到氧气的定制塑料口部。这将在实验期间提供富氧空气以帮助动物呼吸。

要将传感器注射到大脑皮层中，请加载尖端直径为 4 毫米的玻璃移液器和氯化银电极。使用单微摩尔 drimmer ER 溶液，电极将有助于通过显微注射设置记录细胞外场电位。将移液器插入皮质中约 150 微米的深度。

以每平方英寸 0.5 磅的压力注射 1 到 2 分钟，以优化成像的光学设置。调整激光功率以最大限度地减少照片漂白和照片损坏。通常，采用的激光功率约为 20 毫瓦，PMT 增益保持恒定在 667 伏。

将激光波长设置为在 820 纳米处激发传感器，并指导软件通过标准 FTSE 和 Trit 滤光片同时检测荧光素和棒状 domine 荧光。此外，将采集频率设置为 2 赫兹的帧速率以进行背景校正。在激光快门关闭的情况下获取暗框，以测量 PMT 和基座中产生的平均热噪声。

最后，获取 pH 依赖性荧光图像并将其储存起来以供后续分析。像以前一样分析数据以评估荧光素和瘤胃碱的体外行为。装样到 rimer 上，使用荧光计进行 pH 滴定。

该图显示了 pH 传感器的典型滴定。荧光素和反刍可以分别在 488 纳米和 550 纳米处分别激发，从而可以清楚地看到两个通道之间的串扰最小。荧光素表现出 pH 依赖性行为，而 R domine 信号在生理 pH 范围内没有显着变化。

因此，这两个信号的比率不取决于传感器浓度，而只取决于 pH 值。接下来，为了在细胞内提供指示剂，使用 dederer 传感器对 hela 细胞进行电穿孔，并按照本视频中的说明进行共聚焦成像。这些共聚焦图像左侧显示荧光素通道中的细胞，中间显示 R domine 通道中的细胞，右侧显示为 pH 比率度量图。

观察到强荧光素和 r domine 信号，它们共同定位，证明了传感器结构的完整性。比率度量图是通过逐像素划分两个图像来重建的，并用伪色标表示。为了校准细胞内的传感器响应，使用离子载体进行 pH 钳制，如图所示。

指示剂很容易通过绿色与红色比率的变化来响应 pH 值。所得数据用于生成校准曲线，以实现准确的 pH 测量。校准的线性趋势表明传感器能够响应 pH 值，而不会受到蜂窝环境的任何干扰。

为了演示如何将基于 dendri 的传感器用于体内成像，在 dendri 或注射麻醉小鼠的大脑中进行了 pH 成像。在 820 纳米激发下同时获得荧光素和 r domine 信号，并且比率图是在类似于活细胞测量的逐像素基础上构建的。值得注意的是，指示剂位于细胞外间隙，图像中的非荧光区域识别细胞体或小血管，以验证传感器对 pH 值的反应。

我们采用了 hypercapnea 的使用。事实上，已知二氧化碳会改变血液和组织中碳酸盐缓冲液的平衡，导致组织酸化。从该图中可以看出，吸入 30% 的二氧化碳足以引起传感器的强烈响应，该响应在鼠标转速通气时是完全可逆的。

这些结果表明，基于 ofer 的传感器具有突出活细胞和体内 pH 值的生理和病理变化的潜力。答：我们的程序与其他测量兼容，如电生理记录。这允许同时获得有关正在进行的生物过程的互补信息。

这种方法发展后，为细胞生物学和神经生物学研究人员探索培养细胞和体内的 pH 调节过程铺平了道路。