整装免疫荧光染色新生小鼠视网膜血管生成调查在体内

该程序的总体目标是研究新生小鼠视网膜中的血管生成。这是通过首先对产后眼睛成核，然后应用固定剂来实现的，第三步是小心地将产后 murn 视网膜解剖成花瓣状，最后一步是给视网膜脉管系统染色。最终，通过荧光染色和共聚焦显微镜实现小鼠视网膜脉管系统的可视化。

演示此程序的将是我实验室的博士后 Simon Tro 博士和我实验室的前成员 Kathleen Allenson。在整个过程中，默认温度为室温。首先用剪刀将一只被人道杀死的老鼠幼崽放在它的一侧。

去除覆盖眼睛的皮肤。接下来，将剪刀放在眼睛下方，剪断视神经和周围组织并取出眼睛。将去核的眼睛转移到含有固定剂的 24 孔板中，固定剂为 4% PFA，分两次。

PBS 继续解剖另一只眼睛，而一只眼睛在固定剂中。两次眼部解剖之间的交错将是半分钟。通过练习。

让每只眼睛固定 10 到 15 分钟。然后将它们转移到冰上两次 PBS 的冷中至少 5 到 10 分钟。在分离视网膜之前，使用已切割以扩大公猪的塑料牧场移液器，根据需要将尽可能多的眼睛收集到 PBS 中。

在解剖显微镜下将眼睛转移到含有两倍 PBS 的培养皿中。使用镊子和剪刀去除眼睛周围的脂肪。用锋利的剪刀刺穿角膜边缘，切开角膜和虹膜周围，丢弃这些组织。

接下来，将镊子插入视网膜和巩膜之间。去除巩膜，同时注意不要撕裂视网膜。只要没有损伤视网膜的风险，也可以去除脉络膜层。

保持脉络膜层开启不应显着影响免疫染色的质量。现在使用镊子，去除晶状体和玻璃体液。然后去除同种异体血管。

使用细镊子将它们聚集在眼睛中央。然后迅速将它们从视网膜中心拉开。要格外小心地去除所有黄蓟，因为如果你留下一些，它们会掩盖你的站立结果。

现在应将杯形视网膜转移到干净的培养皿中，并用 PBS 冲洗干净。现在进入视网膜。做四到五个径向切口，到达中心大约三分之二的位置。

使用弹簧剪刀创建这个踏板形状的 Retina。这一步需要耐心和练习才能完善。现在使用牧场移液器吸出大部分 PBS。

这将使视网膜变平。然后用一小块吸水纸去除多余的 PBS。接下来，将零下 20 度的甲醇一滴一滴地涂抹在视网膜表面，直到它大部分被淹没，然后大量加入甲醇。

视网膜会变白。此步骤有助于修复视网膜并促进渗透。将冷甲醇中的视网膜转移到一个小管中。

使用大口径塑料移液器。如果需要，让它们在冷甲醇中孵育至少 20 分钟，视网膜可以在零下 20 度的甲醇中停留数月。抗体仅在此处使用。

cine 不能在母体固定视网膜上成功使用。在这种情况下，视网膜在压平成花瓣形状后需要直接进行免疫染色。首先小心地从视网膜中吸出甲醇。

然后用一次 PBS 快速温和地冲洗视网膜。去除 PBS，用 100 微升烫发阻隔液和 5% 的适当血清覆盖视网膜。将视网膜设置为轻轻摇晃一小时。

用移液管去除烫发阻滞溶液，并用 100 微升含有一抗或之前选择素的烫发阻断溶液代替。然后将视网膜设置为在 4 摄氏度下孵育过夜，第二天早上摇动。在 PBS TX 中洗涤视网膜 4 次，每次洗涤 10 分钟。

在所有洗涤步骤中轻轻摇晃。如果一抗未偶联，则加入 100 μL 适当的荧光二抗，在 PBS tx 中稀释 1 至 200。将视网膜在 4 摄氏度下孵育过夜或在室温下孵育 4 小时，轻轻搅拌以去除二抗。

在 PBS TX 中洗涤视网膜四次，每次轻轻摇动 15 分钟。现在继续挂载。使用大口径塑料移液器将视网膜转移到载玻片上，并用纸巾去除任何多余的 P-B-S-T-X。

然后将视网膜安装在 50 微升的延长金中，并用盖玻片轻轻覆盖溶液。为了让 Gold de set 延长，请将载玻片在 4 摄氏度下冷藏过夜，第二天避光。解剖后继续对视网膜进行成像。

视网膜应看起来像一朵使用 ISO 选择素 B four Alexa 4 88 的扁平花朵。内皮细胞染色并呈绿色。使用 Antifa 平滑肌可视化支持血管肌细胞，使用五倍物镜在低倍视图中行动，允许使用不同的抗体组合来概述视网膜的血管组织。

使用抗 CD 31 免疫染色可以看到内皮细胞，支持寄生虫，使用抗 NG 2 的抗体进行可视化。或者，用抗结蛋白对支持寄生虫进行染色。抗结蛋白染色使寄生虫的手指状突起可视化，并有助于确定它们是否与内皮细胞密切相关。

相比之下，抗 NG 2 染色勾勒出每种寄生虫的细胞核，这在量化脉管系统中寄生虫细胞的数量时很有用。在尝试此程序时，请务必记住避免使用解剖工具触摸和损坏视网膜表面。按照此程序，可以进行其他方法，如 BD 染色，以研究特定细胞的增殖。