Name: 活体显微镜成像的亚细胞结构的活体小鼠表达荧光蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-01T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习活体显微镜成像技术，用于观察小鼠唾液腺中亚细胞结构的动态变化。该方法通过手术暴露腺体并使用定制固定装置稳定动物，可实时追踪分泌颗粒的胞吐过程，为研究细胞生物学提供可靠的活体成像方案。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）国家牙科与颅面研究所的院内研究项目资助。

第一部分：显微镜及成像装置的准备
<ol>
	<li>任何倒置共聚焦显微镜均适用于活体显微成像（IVM）。本研究中使用的是配备Fluoview-1000激光扫描共聚焦单元的Olympus IX81倒置显微镜。为获得最佳分辨率，建议使用高数值孔径（NA）物镜，例如水浸式UPLSAPO 60x/1.20 NA和油浸式Plan-Apo 60x/1.42 NA。油浸物镜具有更高的光收集效率，尽管需要在组织与物镜之间使用盖玻片，但在成像深度位于表面下15–20 μm范围内时可提供更优的成像质量。此外，在长时间成像过程中使用油镜可避免水蒸发问题。为维持温度与湿度，显微镜应完全封闭，并通入温热且加湿的空气；或者通过其他方式对动物、显微镜载物台和物镜进行加热。例如，可使用化学加热垫为动物和载物台保温，使用专用设计的物镜加热器为物镜加热（图1A）。物镜加热器应在实验开始前30分钟开启。注意：当使用加热垫维持动物体温时，需在加热垫与皮肤之间放置纱布，并密切监测皮肤是否出现灼伤。</li>
	<li>大多数商用共聚焦显微镜的标准载物台均设有开口，用于插入适配不同尺寸载玻片、培养皿和板的各类支架。为进行IVM，将适用于35 mm培养皿的标准载物台插入件倒置，其上覆盖一块40 mm玻璃盖片，并用高真空硅脂或遮蔽胶带固定（图1A）。也可使用3 mm厚的铝板定制加工此类插入件。随后用70%乙醇清洁玻璃表面，并用Kimwipe纸擦拭干净。</li>
	<li>制作用于下颌下腺（SGs）固定的定制化支架（稳定器）。该支架的作用是将下颌下腺稳定固定，并将其刚性耦合至载物台和盖玻片。支架可由一个60 mm塑料培养皿制成。首先将培养皿底部从侧壁分离，并切割成约15 × 10 mm的矩形片；然后使用细砂纸将边缘打磨圆润并抛光。通过移除1 ml注射器活塞的橡胶头制备四个垫片（厚度1.5–2 mm）。使用细砂纸对垫片表面及塑料片的四个角进行抛光处理。随后使用凝胶状瞬间胶将垫片粘接固定，再在平面上用细砂纸将其表面打磨平滑。注意：对于年龄较大的动物，可能需要增大支架和垫片的尺寸，以适应略大的腺体。</li>
	<li>光学耦合凝胶的制备。将100 ml超纯水加热，溶解5.47 g D-山梨醇，然后加入0.3 g Carbomer-940（表2），配制成0.3% Carbomer-940凝胶。烧杯应加盖后置于搅拌加热板上（最低加热档位）搅拌数小时，直至所有Carbomer团块完全溶解。最后在轻柔搅拌下逐滴加入三乙醇胺，直至pH值达到约7.4。凝胶储存于4 °C 13。</li>
</ol>
第2部分：动物与麻醉
<ol>
	<li>在开展任何涉及动物的实验之前，相关方案必须获得本地动物护理与伦理委员会的批准。重要的是，研究人员应接受过外科手术操作的适当培训，并在实施操作前咨询本地动物护理委员会或机构兽医。</li>
	<li>本研究使用一种小鼠模型（GFP/mTomato-小鼠），该模型通过将表达可溶性GFP的FVB小鼠（GFP-小鼠）与表达膜靶向肽融合荧光蛋白tandem-Tomato的C57B6小鼠（mTomato-小鼠）杂交获得6。注意：动物通常需要20-30分钟才能完全麻醉并准备成像。</li>
	<li>小鼠饲养于动物设施内的受控环境中，在实验前允许其适应环境一周。此步骤对观察唾液腺（SGs）至关重要，因为任何应激都会增强分泌活性12。水和食物自由供应ad libitum。成像实验使用2至5月龄的雄性小鼠（20-30 g）。</li>
	<li>麻醉前需称量动物体重，以确定麻醉剂的正确剂量。</li>
	<li>由于注射麻醉剂引起的应激可能影响唾液腺的分泌活性，因此应先通过异氟烷吸入诱导预麻醉，再注射麻醉剂。为此，将小鼠轻柔地放入汽化室，并开启氧气流（800-900 mmHg）。将异氟烷浓度设为3%，开始预麻醉诱导。</li>
	<li>动物失去意识后，向腹腔内注射含有100 mg/kg氯胺酮和20 mg/kg赛拉嗪的混合物（25 G针头）。麻醉剂需新鲜配制：将100 mg/ml的赛拉嗪用生理盐水稀释至20 mg/ml，再与氯胺酮混合。该混合液进一步以1:1比例用生理盐水稀释，并根据动物体重注射适当体积。此稀释有助于防止意外过量。注意：该混合物在20分钟后会失去效力。</li>
	<li>观察动物是否有苏醒迹象，若动物开始从麻醉中恢复，则追加麻醉混合物（首次注射后45分钟内追加约初始剂量的75%，此后每小时追加50%）。每15分钟通过轻捏脚掌并观察反应来检查麻醉深度。注意：务必使用眼用软膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>麻醉剂会引起低体温，这可能影响实验的可重复性及动物健康。因此，整个实验过程中应将小鼠置于加热灯下或加热垫上保温。注意：加热灯应距离动物至少12-18英寸，以防灼伤。</li>
	<li>必须使用配备直肠温度探针的体温计监测动物的体温。</li>
</ol>
第3部分：活体显微成像的动物手术与体位固定
<ol>
	<li>准备好所有手术器械（表1），确保其清洁且无菌。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除小鼠颈部区域的毛发。用浸有70%乙醇的纱布擦拭麻醉小鼠颈部腹侧区域，再用无尘纸巾吸干多余液体。</li>
	<li>用钝头弯镊在中线处提起一小块皮肤（约位于咬肌末端下方），并做一小切口（图1B）。</li>
	<li>将剪刀插入切口，通过张开剪刀刃将皮肤与下方组织分离。操作时应将剪刀尖朝上，紧贴皮肤内侧，以避免损伤下方的腺体组织。重复此步骤数次，直至皮肤完全与深层组织分离（图1B）。</li>
	<li>使用剪刀剪去一块约3 mm宽、10 mm长的松解皮肤。切割时应从颌下腺（SGs）基部附近开始，此处为神经、导管和血管连接腺体与身体其他部分的位置。清理创面后，最终形成的开口呈椭圆形，大小约为8 × 12 mm。切开后双侧颌下腺均应可见（图1B）。</li>
	<li>用注射器将光学耦合凝胶滴加至切口中央，并用无菌纱布向外擦拭均匀。每次擦拭均应使用新的纱布块，以防止毛发或血液进入暴露的组织。重复此步骤，直至所有血液和松散毛发被清除。</li>
	<li>使用#7镊子，从右侧颌下腺尖端上方数毫米处夹住结缔组织，沿腺体向其基部逐步分离结缔组织（本方案亦可应用于左侧颌下腺）。首先找到腺体尖端，在其上方夹住结缔组织，围绕腺体撕开结缔组织，注意勿损伤实质组织（图1B）。暴露腺体后，轻柔地将结缔组织从腺体表面剥离。若发生出血，用生理盐水冲洗清除。确保所有结缔组织均被分离，腺体完全暴露。定期涂抹光学耦合凝胶以保持腺体湿润。</li>
	<li>在将动物移至显微镜前，将一块厚纱布和一个化学加热包置于显微镜载物台上，以维持温度在38 ± 2 °C。可通过调节加热包外层切口大小来控制其内部囊袋暴露于空气的程度，从而调节温度。纱布可为加热包与金属载物台之间提供一定隔热作用。同时，在加热包顶部也覆盖一层薄纱布。</li>
	<li>将动物侧卧放置（观察右侧腺体时为右侧朝下），置于纱布上。调整动物位置，使颌下唾液腺位于盖玻片中央（图1C）。</li>
	<li>在固定腺体前，需先确保动物在此体位下稳固。用胶带将小鼠右前肢腹侧固定。用丝线缝合固定小鼠门齿（图1C，插图）。在丝线与前肢之间施加适当张力，并用胶带将两者固定于载物台上。颌下腺应自然位于盖玻片中央。头部和胸部可通过可连接至载物台的塑料楔形块进一步固定。</li>
	<li>在腺体上方放置一小块镜头清洁纸（图1C）。轻柔拉伸腺体，并在其上方放置定制的固定装置。用胶带将稳定器牢固地固定在载物台上。可通过连接至载物台的金属夹进一步增强固定效果（图1C）。应避免过度张力或锐角弯曲，以免影响血流。固定后应立即检查血流情况，可通过肉眼观察（腺体应保持粉红色）或落射荧光成像进行评估。在GFP/m-Tomato转基因小鼠中，由于血管及部分血细胞表达m-Tomato荧光蛋白，血流的明显变化可被清晰识别。</li>
	<li>用纱布和加热垫覆盖动物身体。使用配备小型柔性热电偶探头的温度计测量暴露腺体的温度，探头应直接接触暴露腺体的一侧。</li>
</ol>
第4部分：成像参数
<ol>
	<li>使用落射荧光照明，通过GFP或RFP滤光片组对腺体表面进行聚焦。找到唾液腺（SG）的表面，并评估毛细血管中的血流情况以及组织的整体形态。组织损伤的迹象包括细胞膜起泡或出现大的空泡。</li>
	<li>通过落射荧光或预先扫描选定区域来评估组织的稳定性。稳定的样本至关重要，因为大多数运动伪影在后期数据处理中无法去除或校正。如果样本不稳定，则需要进行调整。</li>
	<li>为找到合适的焦平面，以预扫描模式（1倍放大）对腺体成像，并逐渐将物镜向盖玻片移动，直至腺泡结构、分泌颗粒和质膜清晰可见（图2）。</li>
	<li>延时成像的参数取决于具体实验。为观察分泌颗粒的动力学过程，建议采用0.5–2秒/帧的扫描速度，图像分辨率为256 × 256像素，空间尺度为0.2 μm/像素（视场约为50 μm × 50 μm）。为了最佳地可视化分泌颗粒和质膜，光学切片厚度应设置在0.9–1.2 μm之间。激发GFP和tandem-Tomato时，可分别使用488 nm和561 nm波长的激光。488 nm激光的峰值功率设为约0.5 mW，561 nm激光设为约1 mW，以确保光漂白最小化。</li>
	<li>探测器设置需根据样本的亮度进行调整，以使信号保持在动态范围内。</li>
	<li>所有参数设定完成后，即可开始成像。首先获取视场的静态图像，作为后续参考。在延时成像过程中，组织可能在XY和Z方向发生漂移。可通过手动调整扫描区域和Z轴位置进行补偿。调整应逐步且小幅进行，以避免引入伪影。此外，参考图像还可用于判断是否发生光漂白。若检测到明显光漂白（荧光强度下降超过15–20%），应将激光功率降低0.1 mW。</li>
	<li>为刺激胞吐作用，皮下注射0.1 mg/kg freshly prepared的异丙肾上腺素生理盐水溶液。注射后约1分钟触发胞吐。分泌颗粒与质膜融合可通过颗粒周围GFP荧光增强以及tandem-Tomato肽扩散至其边界膜来检测（图3）。建议在同一区域连续采集3–4个延时序列，每个持续10分钟。</li>
	<li>成像结束后，在安乐死舱内通过吸入CO2处死麻醉动物（10–12 mmHg，持续10分钟）。</li>
</ol>

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</ol>

到目前为止，亚细胞结构的成像主要在 体外 (即 细胞培养）或在 离体 (即 器官培养、组织切片、腺泡制备等模型系统通常无法再现完整活体组织的特征 6在这方面，本文所介绍的方法代表了一项重大突破，因为它能够对特定膜运输步骤的动态过程进行成像即 在活体小鼠中进行的调控性胞吐作用	
	该方案相较于其他设计用于相同目的的程序，代表了重要的进步 体内 体内腔中应激颗粒或其他器官的成像 10,11,13-15在我们之前的一些研究中，实验是在大鼠身上进行的，因为与小鼠相比，大鼠对手术操作的耐受性更强，器官更大，心率更低。尽管在小鼠中建立实验操作更为困难，但其具有多项优势，包括可使用更广泛的疾病模型、转基因动物和基因敲除动物。此外，该方法成功减少了运动伪影，更好地控制了施加在暴露器官上的压力，从而降低了以下风险：i）减少血流，ii）损伤组织结构，iii）损害器官的正常功能。这一关键问题通过消除器官固定装置所产生的约束并引入稳定器而得以解决。 <su...

在过去的二十年中，活细胞显微技术的出现以及荧光蛋白的应用，推动了人们对几乎所有可想象的细胞过程取得重大突破，从而深化了我们对细胞生物学的理解 1该领域极大地受益于哺乳动物细胞培养的应用，这类培养体系作为模型系统具有极强的实验可操作性。然而，它们通常无法真实反映复杂多细胞生物体的生物学特性。 2这一问题已开始通过活体显微技术（IVM）的发展得到解决，该技术为神经生物学、免疫学和肿瘤生物学等领域的关键生物学问题研究打开了新的窗口。 3到目前为止，大多数基于活体显微成像（IVM）的研究主要在组织和单个细胞水平上进行，未能提供有关亚细胞结构动态变化的任何信息。近期，本实验室及其他研究团队已开发出能够在活体啮齿类动物中对亚细胞结构进行成像的IVM技术。 4-7, 13-15 并允许进行药理学和遗传学操作 体内该方法已被我们用于研究膜运输 体内，更具体地说，是内吞作用和调节性外排作用 6,7.
我们的实验模型系统基于暴露、固定并成像麻醉状态下啮齿类动物的下颌下唾液腺（SGs）。选择SGs作为体内显微成像（IVM）的模型器官，是因为通过实施简单的外科手术即可轻松获取这些腺体，且能够将其外置而不影响其生理功能，同时可通过固定减少由心跳和呼吸引起的运动伪影。此外，可通过唾液导管注射病毒或非病毒载体，从而对SGs进行选择性的遗传操作8,9。最后，SGs属于外分泌腺，由具有极性的上皮细胞组成，这些细胞形成腺泡和导管，同时还包括肌上皮细胞以及复杂的间质细胞群体。因此，SGs是研究胞吐作用、胞吞作用、基因递送以及肌动蛋白细胞骨架的极佳模型，正如我们在近期研究中所强调的那样10，并为研究细胞极性、细胞分裂、细胞间连接和离子通道等细胞生物学过程提供了理想平台。
本文详细描述了一种在活体小鼠唾液腺（SGs）上皮中实现亚细胞分辨率成像的方案。具体而言，我们展示了如何在受调控的胞吐过程中对唾液腺腺泡细胞内的分泌颗粒进行成像。如先前研究所示，当使用β-肾上腺素能受体激动剂刺激时，分泌颗粒会与腺泡细胞顶膜融合并逐渐塌陷，将其内容物释放到腺泡小管腔中6。我们的目标是为那些在手术操作和动物处理方面经验较少的研究人员提供基本技术工具，使其能够成功实现亚细胞分辨率的活体显微成像（IVM）。由于IVM中最困难的部分在于动物准备，本文重点描述用于暴露并固定唾液腺且不损害其功能的基本外科操作步骤。至于亚细胞结构的标记方法，已有其他文献报道了多种策略，例如系统性给予荧光探针、使用转基因动物，或联合使用这两种方法7,11。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>异氟烷（Forane）</td><td>Baxter</td><td>101936-40</td><td>在化学通风橱中操作</td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketaved）</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>57457-034-10</td><td>储存液浓度为 100 mg/ml</td></tr><tr><td>赛拉嗪（Xylazine, Anased）</td><td>Akorn, Decatur</td><td>61311-481-10</td><td>储存液浓度为 100 mg/ml</td></tr><tr><td>新霉素/多粘菌素B</td><td>Bausch and Lomb</td><td>24208-785-55</td><td>用于润滑小鼠眼睛</td></tr><tr><td>卡波姆-940</td><td>Ashland, Inc.</td><td>4607-1</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279</td><td>逐滴加入，防止溶液凝固</td></tr><tr><td>异丙肾上腺素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16504</td><td>根据需要以生理盐水新鲜配制；储存液可保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>异氟烷 V 1.9（蒸发器）</td><td>Braintree Scientific</td><td>190AF</td><td></td></tr><tr><td>配备高效微粒空气（HEPA）过滤器的便携式下排风工作台</td><td>Hazard Technology</td><td>PDDT</td><td></td></tr><tr><td>热灯，型号 HL1</td><td>Braintree Scientific</td><td>HL-1 US</td><td></td></tr><tr><td>MicroTherma 2T 温度计</td><td>Braintree Scientific</td><td>TW2</td><td></td></tr><tr><td>手术剪（11.5 cm 直头）</td><td>World Precision Instruments</td><td>5003708-12</td><td></td></tr><tr><td>#7 弯头镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>14187</td><td></td></tr><tr><td>显微剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>503365</td><td></td></tr><tr><td>黑色编织丝线缝合线 #4.0</td><td>George Tiemann Co</td><td>160-1219-4</td><td></td></tr><tr><td>纱布海绵 2&quot; x 2&quot;</td><td>Tyco Healthcare</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>镜头清洁纸</td><td>Olympus</td><td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td><td></td></tr></tbody></table>

活体小鼠中表达荧光蛋白的亚细胞结构成像的活体显微镜技术

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

本文介绍一种基于共聚焦活体显微技术对活体啮齿类动物亚细胞结构进行成像的方法。以活体小鼠的唾液腺作为模型器官，因其具有多项优势：首先，唾液腺易于暴露，便于光学设备接近，并可有效固定，从而显著减少由心跳和呼吸引起的运动伪影，有利于对微小亚细胞结构进行成像与动态追踪；其次，唾液腺的大部分细胞群体均从器官表面即可触及，使得能够应用共聚焦显微镜——其空间分辨率高于此前用于此类研究的其他成像技术 体内 成像，例如双光子显微镜。最后，唾液腺在药理学和遗传学上均易于操作，因此为在分子水平上研究生物学过程提供了一个强有力的系统。
本研究聚焦于一种用于追踪腺泡细胞中分泌颗粒胞吐动力学以及分泌颗粒在β-肾上腺素能受体刺激后融合的顶膜质膜动态变化的实验方案。具体而言，我们采用了一种转基因小鼠，该小鼠共表达胞质GFP和一种与荧光蛋白tandem-Tomato融合的膜靶向肽。然而，我们用于稳定和成像唾液腺的实验操作可推广至其他小鼠模型，并可与其他标记方法联用。 体内 细胞组分，从而实现对多种亚细胞结构（如内体、溶酶体、线粒体和肌动蛋白细胞骨架）的可视化观察。

在GFP/mTomato小鼠中，腺泡呈现为清晰可辨的结构，表达胞质GFP和膜靶向的串联-Tomato肽（图2，虚线）。在单个腺泡中，腺泡细胞由串联-Tomato肽界定。在腺泡细胞内部，细胞核中也可检测到GFP，且细胞核清晰可见（图2，箭头）。分泌颗粒中不含胞质GFP，这些分泌颗粒表现为直径约1-1.5 μm的暗色圆形囊泡（图2，插图，箭头尖）。为了观察胞吐事件，我们聚焦于富含分泌颗粒的质膜区域（图3，星号）。皮下注射0.1 mg/kg异丙肾上腺素后，我们观察到靠近质膜的一些分泌颗粒周围GFP荧光水平升高（图3，绿色箭头）。如先前研究所示，这些颗粒已与质膜融合，并募集了致密的肌动蛋白网状结构，从而保留了胞质GFP6。此外，在与质膜融合后，串联-Tomato肽扩散至分泌颗粒的限界膜中（图3，红色箭头）。30-40秒后，分泌颗粒逐渐塌陷，其限界膜整合入顶端质膜。
<p class="jove_content" f...

活体显微成像是一种强大的工具，能够对活体动物中的多种生物学过程进行成像。本文介绍了一种详细的方法，用于对活体小鼠唾液腺中分泌颗粒等亚细胞结构动态进行成像。

本文介绍一种基于共聚焦活体显微技术在活体啮齿类动物中成像亚细胞结构的实验方法。以某一模型器官为例，……

本实验的总体目标是可视化小鼠唾液腺中的亚细胞结构。首先通过外科手术暴露唾液腺，且不对其造成损伤；第二步，将麻醉后的动物固定在显微镜载物台上。接下来，需小心放置唾液腺，以确保其在最终步骤中的功能不受影响。使用定制的固定装置稳定小鼠，以最大限度减少因动物心跳或呼吸引起的各种运动伪影。最终，可通过活体显微镜成像来观察亚细胞结构的动态变化。在麻醉前，称量小鼠体重以确定合适的麻醉剂剂量。随后，通过吸入异氟烷诱导麻醉。动物失去意识后，每隔15分钟通过脚趾夹捏试验确认镇静状态，并在整个手术过程中将小鼠置于加热灯下保温。使用直肠探头温度计监测动物的体温。现在用电动剪刀剃除小鼠颈部的毛发，然后用浸有乙醇的纱布擦拭颈部腹侧，并用无尘纸擦干多余的乙醇。接下来，使用一把钝头弯镊子在咬肌下端外侧提起一小块皮肤，并做一小切口。将剪刀插入切口，刀尖朝上，朝向皮肤下方，反复张开刀片数次，直至皮肤与下方组织分离。然后从唾液腺基部附近开始，此处神经导管和血管将腺体与身体其余部分相连。用剪刀剪下一条已松解的皮肤条，宽3毫米，长10毫米。清洁伤口区域后，形成的切口呈椭圆形，大小约为 8 毫米 × 12 毫米。两侧的唾液腺均可见。使用注射器将光学耦合凝胶涂抹于切口中央，然后用新的无菌纱布将凝胶向外擦拭，直至清除所有血液和松散毛发。现在使用一对7号镊子找到右侧唾液腺的尖端，在腺体顶端上方几毫米处的结缔组织上进行夹持。然后撕除腺体周围的结缔组织，注意不要损伤实质组织。一旦唾液腺暴露，轻柔地将结缔组织从腺体上分离，并用生理盐水冲洗掉任何出血。确保所有结缔组织均已分离，腺体完全暴露。在将动物置于显微镜下之前，先在显微镜载物台上放置一块厚纱布和一个加热包，并在加热包顶部再覆盖一层薄纱布。将盖玻片置于载物台中央。然后将小鼠右侧朝上放置在纱布上，用一片医用胶带固定其右前肢腹侧，并用丝线缝合线钩住门齿。在缝线与前肢之间施加一定张力，并将其固定于载物台上。使用更多医用胶带，使唾液腺自然放置。在盖玻片中央。使用连接到显微镜载物台的塑料楔块进一步固定小鼠的头部和胸廓。然后将一小块镜头清洁纸放在腺体上方。轻轻拉伸腺体，并将定制的固定器置于腺体上方。然后使用金属夹和医用胶带将稳定器牢固地固定在载物台上。用纱布和加热垫覆盖动物，并使用配备柔性热电偶探针的温度计实时监测暴露腺体的温度。动物稳定后，立即采用落射荧光照明，聚焦于腺体表面。评估毛细血管中的血流情况以及组织的整体形态。使用 488 纳米激光激发 GFP 基因。将峰值功率设为 0.5 毫瓦，以避免对 tandem tomato 蛋白造成光漂白。使用561纳米激光，将峰值功率设置为1毫瓦。现在通过预扫描选定区域来评估组织的稳定性。如果样本不稳定，需相应调整动物位置，以找到合适的焦平面。在预扫描模式下，逐渐移动物镜靠近盖玻片，直至分泌颗粒、分泌颗粒结构和质膜清晰可见。随后，为观察分泌颗粒的动态变化，采用每帧0.5至2秒的扫描速度，图像分辨率为256 × 256像素，空间尺度为0.2微米/像素。为了最佳地观察颗粒和质膜，将光学厚度设置在0.9至1.2微米之间。接着，记录视野图像作为参考点。最后，通过皮下注射0.1毫克/千克新鲜配制的异丙肾上腺素和生理盐水，刺激胞吐作用。注射后一分钟。分泌颗粒与质膜的融合将通过颗粒周围GFP荧光的增强以及串联番茄肽在其限制膜中的扩散而被检测到。在GFPM番茄小鼠中，这些颗粒呈现为清晰可辨的结构，表达胞质GFP和膜定位的串联番茄肽，如虚线所示。在单个胰岛δ细胞中，由串联的番茄肽标记出细胞边界，如箭头所示。同时可在胰岛δ细胞内清晰可见的细胞核中检测到GFP。胞质中的GFP（由箭头指示）被排除在分泌颗粒之外，这些分泌颗粒呈现为直径约1至1.5微米的圆形暗泡状囊泡。为观察外排事件，在异丙肾上腺素注射后，显示了一个由星号标示的富含分泌颗粒的质膜代表性区域。可见靠近质膜的一些分泌颗粒周围绿色荧光蛋白（GFP）荧光水平升高，以绿色箭头指示。此外，分泌颗粒与质膜融合后，串联番茄肽扩散至分泌颗粒的限界膜中，如红色箭头所示。30至40秒后，分泌颗粒逐渐崩解，其边界膜被整合到顶膜质膜中。本文所介绍的方法代表了细胞生物学领域的一项重大突破，因为它能够在活体小鼠中对特定的膜运输过程动态进行成像。

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