活体显微镜成像的亚细胞结构的活体小鼠表达荧光蛋白

该程序的总体目标是可视化小鼠唾液腺中的亚细胞结构。这是通过首先手术暴露唾液腺而不损坏它们来实现的。在第二步中，将麻醉的动物固定在显微镜载物台上。

接下来，仔细定位唾液腺，以免在最后一步影响其功能。鼠标使用定制支架进行稳定，以最大限度地减少由于动物的心跳或呼吸而导致的任何运动伪影。最终，亚细胞结构的动力学可以通过活体显微镜成像。

麻醉前，给小鼠称重以确定麻醉剂的适当剂量。接下来，通过吸入 isof 氟诱导预麻醉。一旦动物失去知觉，每 15 分钟通过弹出捏确认镇静，并在手术期间将小鼠置于加热灯下。

用直肠探针温度计监测动物的体温。现在用一把电动剪刀剃掉鼠标的脖子，然后用浸有乙醇的纱布海绵擦拭脖子的腹侧，用 kim 湿巾擦干多余的酒精。接下来，用一对钝弯曲的镊子抬起按摩器肌肉下侧的一小块皮肤，做一个小切口。

将剪刀插入切口，将尖端向上指向皮肤下侧，然后打开刀片数次，直到皮肤与皮下组织分离。然后从唾液腺底部附近开始，神经导管和血管将腺体与身体其他部位连接起来。用剪刀剪下一条 3 毫米宽、10 毫米长的松弛皮肤。

清洁伤口区域后，所得开口将呈椭圆形，尺寸约为 8 x 12 毫米。两个唾液腺都将可见。使用注射器将光学耦合凝胶涂抹到伤口中间，然后用新鲜的无菌纱布将凝胶向开口外侧擦拭，直到去除所有血液和松散的毛发。

现在，用一对 7 号镊子找到右侧唾液腺的尖端，抓住唾液腺顶部上方几毫米的结缔组织。然后在不伤害实质的情况下撕裂腺体周围的结缔组织。腺体暴露后，轻轻地将结缔组织与腺体分开，用生理盐水洗去任何出血。

确保所有结缔组织都已分离并且腺体完全暴露在外。在将动物带到显微镜前之前，将一块厚纱布和热袋放在显微镜载物台上，也用一块薄纱布覆盖热袋的顶部。将盖玻片放在舞台中央。

然后将鼠标右侧放在纱布顶部，用右前爪腹侧的一条遮蔽胶带和钩在门牙上的丝缝线固定动物。在线和爪子之间产生一些张力，然后将它们连接到舞台上。使用更多的遮蔽胶带，唾液腺应该自然休息。

在盖玻片的中间。使用与显微镜载物台耦合的塑料楔子进一步稳定小鼠的头部和胸部。接下来，将一小块镜片清洁纸放在腺体上。

稍微伸展压盖，并在压盖上放置一个定制的支架。然后，用金属夹和遮蔽胶带将稳定器紧紧地连接到载物台上。用纱布和加热垫覆盖动物，并使用配备柔性热耦合探头的温度计监测暴露的腺体温度稳定动物后，立即使用 epi 荧光照明聚焦在腺体表面。

评估毛细血管中的血流和组织的整体形态。要激发 GFP 基因，请使用 488 纳米激光器。将峰值功率设置为 0.5 毫瓦，以避免串联番茄蛋白发生光漂白。

使用 561 纳米激光器，将峰值功率设置为 1 毫瓦。现在通过预扫描所选区域来评估组织的稳定性。如果准备工作不稳定，请相应地调整动物以找到合适的焦平面。

在 pre 模式中。逐渐将物镜移向盖玻片，直到 aser 结构、分泌颗粒和质膜变得清晰可见。然后，要对分泌颗粒的动力学进行成像，请使用每帧 0.5 到 2 秒的扫描速度和 256 x 256 像素和每像素 0.2 微米的空间比例尺。

为了最好地观察颗粒和质膜，请将光学厚度设置在 0.9 至 1.2 微米之间。接下来，记录要用作参考点的视野图像。最后，通过皮下注射每公斤新鲜制备的异丙肾上腺素和生理盐水 0.1 毫克来刺激胞吐作用。

注射后 1 分钟。分泌颗粒与质膜的融合将通过颗粒周围 GFP 荧光的增加和串联番茄肽扩散到其限制膜中来检测。在 GFPM 番茄小鼠中，asinine 表现为表达胞质 GFP 和膜靶向串联番茄肽的明显不同的结构，如虚线所示。

在单个 asinine aser 细胞中，如箭头所示，由串联番茄肽描绘。在 Aser 细胞内清晰可见的细胞核中也检测到 GFP。箭头指示的胞质 GFP 被排除在分泌颗粒之外，分泌颗粒表现为直径约为 1 至 1.5 μm 的深色圆形囊泡。

为了可视化外生事件，在注射异丙肾上腺素后，显示了富含分泌颗粒的质膜的代表性区域，如星号所示。可以观察到 GFP 荧光水平的增加，由靠近质膜的一些分泌颗粒周围的绿色箭头表示。此外，与质膜融合后，串联番茄肽扩散到分泌颗粒的极限膜中，如红色箭头突出显示的那样。

30 至 40 秒后，秘书颗粒逐渐塌陷，其限制膜整合到根尖质膜中。这里介绍的方法代表了细胞生物学的重大突破，因为它能够对活小鼠中特定膜运输过程的动力学进行成像。