Name: 一个台式生物反应器的操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-12T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 学习台式生物反应器的组装、校准和操作方法，用于大规模培养生物工程细胞。本视频演示了pH探头和氧气探头的校准、灭菌处理以及通过软件监控培养条件的完整流程，帮助研究人员掌握细胞培养管理的关键技术。

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本项目部分由约翰斯·霍普金斯大学教务长办公室通过“门户科学计划”（Gateway Science Initiative）提供资助。

<ol>
	<li>开始操作前进行反应器安装。标准发酵罐包含以下需安装的组件（图1）：
	<ol>
		<li>pH探针——用于实时监测培养液的pH值。安装前需校准探针，并随反应器一同灭菌。将探针安装在顶板上。</li>
		<li>pO2探针——用于在发酵过程中测量反应器内溶解氧含量。将其安装在顶板上。</li>
		<li>收获管——用于取样培养液。将此可调节高度的组件安装在顶板上。</li>
		<li>气体分布器——位于反应器底部，用于向培养液中通入气体。将分布器连接至发酵罐的气源，并固定在顶板上。</li>
		<li>搅拌轴和搅拌桨——搅拌桨用于搅拌培养液，对维持反应器内培养体系的均匀性至关重要。</li>
		<li>尾气冷凝器——通过冷却排气路径，减少反应器内的蒸发损失。</li>
		<li>pH控制或补料用的试剂泵管路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用肥皂和水清洁反应器及顶板。建议使用软毛刷刷洗反应器和顶板。禁止使用漂白剂或含氯清洁剂清洗反应器。</li>
	<li>若培养基对热稳定，可将其加入洁净的反应器中。仅加至最大工作体积即可。本例中，5 L总容积的反应器最大工作体积为3.3 L。</li>
	<li>安装反应器顶板，确保O型密封圈正确就位。</li>
	<li>安装尾气冷凝器。</li>
	<li>将消泡探针安装至其10 mm接口中。</li>
	<li>将收获管安装至其10 mm接口中。在管口上方连接一段软管并夹紧。</li>
	<li>在气体分布入口处安装软管和0.20 μm滤器，然后夹紧。</li>
	<li>校准pH探针：
	<ol>
		<li>准备两份标准缓冲液置于小烧杯中，另备一个洗瓶和一个用于冲洗的空烧杯。</li>
		<li>将pH探针连接至发酵罐，并开启发酵罐电源。</li>
		<li>滚动菜单至pH参数，通过菜单按钮选择“Cal”选项，按“Enter”键。</li>
		<li>选择“2”进行两点校准。</li>
		<li>冲洗探针尖端，将其浸入低pH标准缓冲液中。发酵罐显示值将趋于稳定。使用“+”和“-”键调整显示值，使其与缓冲液标称值一致。待数值停止闪烁后，按“Enter”键确认。</li>
		<li>再次冲洗探针，将其插入第二份标准缓冲液中。待数值稳定后，使用数字键调整显示值以匹配高pH缓冲液的数值。按“Enter”键确认。</li>
		<li>冲洗探针尖端，断开其与发酵罐的连接。在接口处盖上保护帽，并将其安装至顶板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开pO2探针尖端，检查电解液是否足以覆盖探针尖部。若不足，向储液腔添加适量电解液后重新密封。</li>
	<li>将pO2探针安装至顶板，并确保盖上灭菌保护帽，以保护其电连接部分。灭菌后将进行校准。</li>
	<li>准备一个带浸入管和空气滤器的补料试剂瓶。将泵管连接至浸入管接口，另一端连接至发酵罐的进液口。</li>
	<li>在所有未使用的接口上安装软管，并用夹子夹紧。</li>
	<li>在尾气冷凝器上安装0.45 μm滤器。该滤器可防止反应器在高压灭菌过程中升压。</li>
	<li>检查所有低于培养基液面的管路是否均已夹紧，以防止培养基泄漏。</li>
	<li>将反应器放入高压灭菌锅，在121 °C下进行液体灭菌程序，持续25–30分钟。注意：灭菌完成后反应器温度极高。</li>
	<li>将灭菌后的反应器安装至发酵罐底座上。</li>
	<li>连接pH探针电缆。</li>
	<li>连接pO2探针电缆。</li>
	<li>将气体分布器连接至气体流量计（rotameter）。</li>
	<li>无菌条件下向带浸入管的试剂瓶中加入1 M NaOH试剂，并将泵头安装至底座泵头主轴上。</li>
	<li>将温度传感器插入顶板上的测温套管中，确保其完全插入至底部。</li>
	<li>将搅拌臂下降至反应器搅拌桨耦合器上。</li>
	<li>确保发酵罐已开启。</li>
	<li>检查发酵罐是否有供水。</li>
	<li>开启发酵罐的空气供应。</li>
	<li>滚动至温度参数，设定温度为37 °C。按“Enter”键启动温度控制。反应器将在15分钟或更短时间内升温。</li>
	<li>调节气体流速至每分钟1个体积培养基或更低。本实验设置中，气体流速为3 L/min。底部应可见气泡产生。</li>
	<li>滚动至搅拌参数，设定转速为300 rpm。按“Enter”键启动搅拌。</li>
	<li>当温度达到37 °C后，滚动至pH参数，设定pH为6.8。按“Enter”键启动pH控制。</li>
	<li>将搅拌转速设定为运行期间的最大值1,000 rpm。</li>
	<li>确保pO2探针已充分极化，以显示准确数值。2小时后，滚动至pO2参数，使用“Menu”按钮选择“Calibrate Function”，并选择单点校准。</li>
	<li>15分钟后，使用光标将数值设为100，按“Enter”键确认。此操作完成pO2校准。</li>
	<li>滚动至搅拌参数，设定转速为300 rpm。</li>
	<li>使用“Menu”按钮，在搅拌菜单中将“Cascade”设为“on”。此设置将在细胞生长需氧量增加时，自动提高搅拌速度，以破碎气泡并促进更多氧气溶入培养液。</li>
	<li>滚动至pO2参数，设定数值为30。按“Enter”键启动pO2控制。</li>
	<li>启动PC上的控制软件包。</li>
	<li>当所有探针完成校准，搅拌稳定在300 rpm，温度达到37 °C，且pH接近6.8时，即可进行接种。使用酒精对拟用于接种的接口进行灭菌。</li>
	<li>将接种物吸入注射器，通过已灭菌的接口注入反应器。接种后关闭接口。</li>
	<li>在实验记录本中标记接种时间。</li>
	<li>在灭菌完成后也应取样一次。使用酒精对收获管末端进行灭菌。</li>
	<li>打开收获管接口的夹子，用注射器抽取样品。首次样品通常弃去，因其可能已在管路中滞留。</li>
	<li>使用另一支注射器抽取第二次样品。</li>
	<li>用第三支注射器向管路中推入空气，以尽可能清除管路中的死体积，随后夹紧管路。</li>
	<li>测定细胞密度和pH值，并记录数据。对于微生物培养，建议每小时记录一次数值。具体间隔依培养体系而定。</li>
	<li>收获方法取决于培养结束后对菌体的用途。本例中，在培养终点最后一次取样，以获取细胞密度及可能的pH值或湿菌体重的终末数据。打开顶板，将内容物排入指定的&#34;灭活罐&#34;，并用漂白剂或其他抗菌剂处理。</li>
</ol>

<ol><li>Shuler, M., Kargi, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShuler%2C+M+%22Bioprocess+Engineering+Basic+Concepts%22">Bioprocess Engineering Basic Concepts</a>. , 2nd, Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2002).</li>
<li>Hambor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Wave [Internet]. , GE Life Sciences. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave">http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave</a> (2012).</li>
<li>Xcellerex [Internet]. , GE Life Sciences. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm">http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm</a> (2012).</li>
<li>Julien, C., Whitford, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor%2C+Monitoring%2C+Modeling+and+Simulation%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation.</a> BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).</li>
<li>Fike, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+Supplementation+Strategies+for+Biopharmaceutical+Production.+Part+1%3A+Identifying+a+Formulation%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation.</a> BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).</li>
<li>Jana, S., Deb, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+efficient+production+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E.+coli+K5+fermentation+and+the+preparation+of+heparosan%2C+a+bioengineered+heparin+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd, ASM Press. Washington DC. (2010).</li>
<li>Bioreactors [Internet]. , Applied Technical Resources. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf">http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf</a> (2012).</li>
<li>Infors, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInfors%2C+HT+%22Minifors+operating+Manual+and+user+guide%22">Minifors operating Manual and user guide</a>. , Bottmingen, Switzerland. Forthcoming.</li>
</ol>

作者 A. Magno 是 ATR Biotech 的员工，该公司生产本文所用的试剂和仪器。

搅拌罐式生物反应器是生物技术行业的标准设备，已使用超过40年 1小型搅拌罐在放大、缩小、菌株优化、表征及工艺开发中具有重要作用，也可能在个体化医学的发展中发挥关键作用。 2小型生物反应器最类似于 原位 细胞生长的条件，因为它可以在整个运行过程中进行监测和优化。通常，初始实验使用摇瓶进行，但小规模生物反应器中的条件与摇瓶存在显著差异。在一项实验中，我们发现细胞最佳生长所需的条件在 E. coli 在摇瓶中绿色荧光蛋白（GFP）的表达与生产结果无法在搅拌罐中重现（未发表数据）。
大规模培养细胞的其他方法包括转瓶、一次性摇床式生物反应器3，以及工作体积为50至5,000 L的一次性大型生物反应器。每种方法在放大生产过程中均面临一定挑战，但已在生产中得到应用。一次性摇床式生物反应器类似于搅拌罐式反应器，可提供受控的培养环境。其与搅拌罐式反应器的区别在于，混合通过摇动运动产生波浪，以防止细胞沉降并实现供氧。该方法的流体动力学特性与搅拌罐不同，最大体积受限于1,000 L。这些差异可能影响细胞生长和产物生成。其他一次性系统将搅拌罐与一次性反应器相结合，可在基础设施和相关运营成本最小化的同时，提供高通量生物加工的能力4。
初次使用台式生物反应器的用户可能难以确定 pH、pO2 和温度的初始设定值；但可参考已发表的研究文献获取相关信息5, 6, 7, 8, 9。对于细菌培养，建议搅拌速度和温度设定值均与摇瓶培养时相同。此前摇瓶实验中的培养 pH 值也可作为初始参考。pO2 值的设定较为困难，通常需通过实验经验确定，但建议以 50% pO2 作为起始设定值。

基础发酵技术是摇瓶培养方法的延伸，源于对活体培养物生长环境进行更全面、更精确控制的需求。批次培养的摇瓶通常受限于温度控制不精确。在恒温摇床或温控室中，温度均匀性差异很大，有时会偏离设定值达5 °C以上。由于摇瓶通常以固定转速振荡，氧气摄取和气体交换受到限制。一旦环境中可用的氧气耗尽，大多数培养物便无法良好生长。摇瓶中没有pH控制。在许多情况下，如果培养物不受底物限制，培养液会酸化至对细胞有害的程度，导致呼吸作用显著减慢。大多数摇瓶培养也以“批次”方式进行，即仅在接种初期或接近初期一次性添加营养。当初始碳源被消耗后，培养物即停止生长。在某些情况下，其代谢可能转向并开始消耗培养基中的其他代谢产物，有时会改变最终生物质或蛋白的特性。此外，在较高温度的培养环境中，摇瓶通常还会发生培养基蒸发损失，在37 °C时通常每24小时损失约10%体积。这种损失会改变培养物的密度，并限制系统的长期运行。最后，振荡后培养基可能产生泡沫。培养液上方顶空区域出现泡沫将限制气体交换，进一步抑制生长。
基本发酵系统旨在解决上述所有局限性。通过使用搅拌桨和加热夹套，可在发酵容器中实现精确的温度控制。将传感器插入容器中，并对夹套进行加热和冷却的反馈控制，通常可使温度在设定值附近控制在±0.1 °C范围内。台式发酵罐通常通过泵将液体试剂加入，以实现pH控制。pH值被持续监测，以努力维持细胞生长的最佳环境。适当的通气通过上述搅拌桨或直接向培养物中通入空气或加氧气体来维持。对于剪切力敏感的培养物，加氧气体是维持培养物中氧含量的主要机制。溶液中氧气的测量通常通过极谱探针实现，而这种探针通常无法用于摇瓶。还可以连续或定期向容器中添加补料，以维持细胞线性或指数式生长。出口气体冷凝器为排气气流中的蒸汽提供冷表面使其冷凝，从而保持培养液体积和密度。通过培养液中的电导率探头触发周期性添加消泡表面活性剂，以减少液面泡沫，确保气体交换。
将所有探头、管件、搅拌桨、收获管和管路安装到反应器中，并在标准高压灭菌器中进行灭菌。在完成探头的最终校准并使系统稳定至工作环境后，将培养物接入反应器。随后可利用该系统对培养过程进行表征，其定量程度和精确性均优于摇瓶法。对温度、pH、溶氧含量、补料消耗、液体蒸发量和泡沫水平的严格控制，共同促进了更高的生物量积累和更优的蛋白表达产量。

<table><tbody><tr><td>LB肉汤</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A1593-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>消泡剂204</td><td>Sigma</td><td>A8311</td><td></td></tr><tr><td>1 M 氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>38215-1EA-R</td><td></td></tr><tr><td>参考缓冲液，pH 4.00</td><td>Sigma</td><td>B5020</td><td></td></tr><tr><td>参考缓冲液，pH 7.00</td><td>Sigma</td><td>B4770</td><td></td></tr><tr><td>pO₂探头电解液</td><td>Broadley James</td><td>AS-3140-C30-0025</td><td></td></tr><tr><td>0.45 微米滤膜</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-02915-22</td><td></td></tr><tr><td>0.22 微米滤膜</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-29950-40</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁扣注射器，10 mL</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07940-12</td><td></td></tr><tr><td>Minifors 生物反应器</td><td>Infors HT</td><td>B-Pack 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Air Admiral 空气泵</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-79202-00</td><td></td></tr><tr><td>1175 PD 冷却循环器</td><td>VWR</td><td>13721-204</td><td></td></tr></tbody></table>

台式生物反应器的操作

Operation of a Benchtop Bioreactor

发酵系统可用于为多种不同类型的细胞培养提供最佳生长环境。发酵罐能够精确控制温度、pH值以及溶解氧浓度，这使其在高效的大规模细胞生长和发酵产物表达中至关重要。本视频将简要介绍发酵罐相较于摇瓶培养的优势，识别典型台式发酵系统的关键组件，并提供反应器安装及其探针校准的基本操作指导。观众将了解灭菌流程，并学习如何将培养物接种至反应器中的培养基内。此外，还将演示操作、取样和收获的基本概念，同时讨论简单的数据分析与系统清洁步骤。

生物反应器可以使用或不使用IRIS软件运行，但为了采集数据，最好使用该软件。在接种细菌之前，必须对pH和氧气传感器进行校准，并设定搅拌速度和温度。在图2中展示了生物反应器运行过程中的数据输出结果。温度设定为30 °C，搅拌器转速设定为200 rpm。不同实验的参数可能有所不同，但在接种细菌前，系统应已达到稳态。在图3中显示了加入菌液后氧气浓度的变化情况。本实验的设定值为：37 °C、搅拌速度200 rpm、O2为70%。在19:20时，进料泵将OD值为0.1的种子菌液注入反应器，导致O2水平立即下降。生物反应器通过增加通气量和搅拌速度来响应O2水平的变化。这些增加的设定值在级联控制中预先设定（步骤35）。反应器的pH值被实时监测，pH值随时间先下降后上升，如pH曲线的波动所示（图4）。整个运行过程可被分析，并用于调整后续实验的参数。
<img alt="发酵过程生物反应器示意图，包含探针、加热夹套、控制面板。" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 带有所有标注部件并已连接的台式生物反应器。 该图显示了运行开始时的搅拌式反应釜。反应器的各个部件均已标注，包括传感器、搅拌桨、温度计、补料与取样瓶、排气口、空气压力表、加热夹套、冷凝塔以及控制面板。
<img alt="静态平衡图；控制系统数据分析；随时间变化的压力、温度曲线图。" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 运行开始时生物反应器软件的屏幕图像。在搅拌罐运行开始时，温度设定为 30 °C（黄色线），搅拌桨转速为 200 rpm（红色线），pH 值为 6.5（绿色线），pO2 为 57.2%（蓝色线）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="软件中的过程控制图；数据监测；温度、压力趋势；系统分析。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 培养过程中生物反应器软件的屏幕图像，显示氧气浓度下降。当细胞处于活跃生长期时，会消耗氧气，导致反应器中氧气含量降低（蓝线）。通过提高搅拌桨转速，可向培养物中补充更多氧气（红线）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="数据分析图表；化学过程监测，带时间序列数据趋势的图形输出。" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 生物反应器软件的屏幕图像，显示 pH 随时间的变化。 培养液的 pH 值被连续监测，随着时间推移，由于乳酸的产生，pH 值下降（蓝色线），随后因向生物反应器中添加碱液而上升。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。

发酵罐用于提高基因工程细胞的培养产量和生产效率。在摇瓶中筛选多种微生物或动物细胞培养候选株后，下一步合理操作是利用发酵罐增加所选培养物的生物量。本视频演示了典型台式生物反应器系统的安装与操作过程。

发酵系统用于为多种不同类型的细胞培养提供最佳生长环境。发酵罐所提供的能力……

本实验的总体目标是建立一个生物反应器，为大规模培养生物工程细胞提供受控环境。首先组装反应容器，校准pH探头，并对组装好的容器进行高压灭菌。第二步是将灭菌后的容器连接到发酵罐底座上，并设定搅拌速度、温度、pH值和氧饱和度等参数。接下来，启动生物反应器运行，在对溶氧探头进行手动校准后，达到设定的搅拌速度、温度设定值和溶氧饱和度。最后一步是将细菌培养物接种至生物反应器中，并通过计算机软件监测生物反应器的运行条件。最终，可分析培养物的生长特性，并对培养物进行处理，以提取和纯化目标产物。在本视频中，我们演示用于细菌发酵的生物反应器的安装与操作。该方法的可视化展示具有实用价值，因为对于不熟悉此项技术的人员而言，生物反应器的组装、校准与监控可能是一项具有挑战性的任务。好了，让我们开始吧。首先，将不耐热的细菌培养基加入洁净的容器中，仅加至达到最大工作体积即可，对于总体积为5升的容器，最大工作体积为3.3升。安装容器的顶板，确保O形圈密封圈正确就位。安装排气冷凝器。将采收管安装到其10毫米端口上，在其上方放置一段软管，连接至采样瓶，并用夹子夹紧软管。在鼓泡进气口安装管路和0.2微米滤器，然后用夹子夹紧。为校准pH探针，准备两个装有标准缓冲液的小烧杯、一个洗瓶和一个清洗用烧杯。将pH探针连接至发酵罐并开启。滚动至 pH 参数，然后使用菜单按钮滚动至 cow 选项并按回车键。选择二点校准。清洗 pH 探头尖端，并将其浸入低值参考缓冲液中。使用加号和减号键，使发酵罐上的数值稳定。调节显示值，使其与pH参比缓冲液的数值一致。当数值停止闪烁后，按“Enter”键，然后按“Next”。用去离子水冲洗探头上的低参比缓冲液，然后将探头插入第二种参比缓冲液中。待读数稳定后，使用键盘调整显示值，使其与高参比缓冲液的数值一致。按回车键确认。清洗探针尖端，并将其从发酵罐上断开。将保护帽盖在连接处，并将其安装到顶板上。打开氧探针尖端，检查确保有足够的电解液覆盖尖端。将氧气探头安装到顶板上。确保装上灭菌盖以保护其电气连接部分，因为探头在校准前需要进行灭菌处理。接着，准备一个带有浸管和空气过滤器的试剂加料瓶。将泵管连接到浸入管端口，并将另一端连接到发酵罐的进液端口。在所有未使用的端口上安装管路，然后用夹子夹紧管路。在排气冷凝器上安装一个0.45微米的过滤器。该过滤器可确保容器在高压灭菌器中不会产生压力。检查所有位于培养基液面以下的管路是否已夹紧，以防止培养基泄漏。将容器放入高压灭菌锅中，在121摄氏度下采用液体循环模式灭菌25至30分钟。待高压灭菌锅容器冷却后，下一步是将其安装到发酵罐底座上。然后连接 pH 探针电缆。安装溶氧探针电缆，并将鼓泡器连接至气体添加装置。保持无菌条件，启动发酵罐。将一摩尔氢氧化钠试剂加入带有导管的瓶子中，并将泵头安装在基座泵头的转轴上。将温度传感器插入头板上的测温孔中，确保其完全到达测温孔底部。将振荡臂稳妥地降至反应罐的搅拌桨耦合器上。确保发酵罐已开启，并检查发酵罐是否有供水。打开发酵罐的空气供应。滚动至温度参数，将温度设定为 37 摄氏度。按下回车按钮以启动温度控制。容器将在15分钟或更短时间内升温。将气体流量调节至每分钟不超过一个容器体积的培养基。在此设置中，气体流量为每分钟3升。底部应出现气泡。滚动至搅拌参数并设置为 300 RPM。按回车键启动搅拌。当温度达到 37 摄氏度后，滚动至 pH 参数并将其设置为 6.8。通过按下回车按钮开启 pH 控制。将振荡速度设置为运行期间的最高转速 1000 RPM。确保氧气探针正确极化，以便两小时后显示准确数值。滚动至氧气参数。使用菜单按钮选择校准功能，并选择单点校准。15 分钟后，使用光标将数值设置为 100，然后按回车键。这将完成氧饱和度的校准。滚动至搅拌设置并设定为 300 RPM。使用菜单按钮，在搅拌菜单中将级联功能打开。这将提高搅拌速度，以破碎气泡并随着生长导致的需氧量增加，促使更多氧气进入溶液。滚动至氧气参数，将其值设置为 30。按下回车按钮。在电脑上启动控制软件包。探针校准完成后，搅拌速度稳定在 300 RPM，温度为 37 摄氏度，pH 接近 6.8。此时可使用酒精进行接种。对接种所用端口进行灭菌。用注射器吸取接种物，加入已灭菌的端口内。关闭端口，标记接种时间并记录于计算机日志中。在接种时取样也非常重要。打开夹子并盖住收获口后，推动注射器活塞以排空管路，然后回拉注射器活塞。取样时，先拧开瓶盖并弃去第一份样品，因为该样品一直停留在管道中。重新装上瓶子，使用同一注射器活塞抽取另一份样品。取下瓶子，将内容物倒入离心管中。测试时，使用注射器将空气反向推过管道，并关闭取样口管路上的夹子。测定细胞密度和pH值，并记录数据。对于微生物培养物，建议每小时记录一次数值，但取样间隔应根据具体培养物而定。收获方法将取决于培养完成后对培养物的用途。在此情况下，最后一次取样培养物，以获得细胞密度以及可能的pH值或湿细胞重量的终末数值。最后，打开顶板，收获培养物，然后将容器内容物弃置到指定的含漂白剂或其他抗菌剂的灭活罐中。在本视频中，演示了典型台式生物反应器系统的安装与操作。该图显示了运行开始时的生物反应器，所有部件均已标注并连接。本图展示了代表性生物反应器运行过程中的数据输出结果。在搅拌罐运行开始时，温度设定为30摄氏度，搅拌桨转速为200转/分钟，pH值为6.5，溶氧量为57.2%。不同实验的参数可能有所不同，但在加入细菌之前，系统应达到稳态。在下一张图中，蓝色线条显示了加入细菌培养物后氧气浓度的变化。进料泵以光密度（OD）为0.1的浓度输送细菌种子培养物，导致光密度立即下降。在溶氧水平方面，生物反应器通过提高搅拌桨转速来响应变化的溶氧水平。生物反应器软件的最后这一屏幕图像显示了随时间变化的pH值，其中深蓝色线条代表pH值的变化。培养物的pH值被持续监测，随时间推移逐渐降低，乳酸随之生成并不断积累。可对整个实验过程进行分析，并为后续实验调整相关参数。观看本视频后，您应能够充分理解如何设置和监控生物反应器以表达重组蛋白。发酵系统可用于为多种类型的放大培养提供最佳生长环境。发酵罐能够精确控制温度、pH值和溶解氧浓度，这一能力使其成为高效、大规模生长及表达发酵产物所必需的关键设备。感谢观看本视频，祝您的实验顺利成功。

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