强大的3D直接标记的探针DNA鱼

以下实验的总体目标是以稳健的方式研究单个细胞中特定基因组位点的空间组织。这是通过首先生成荧光标记的探针以最终结合并突出显示感兴趣的基因组区域来实现的。下一步是在载玻片上粘附、固定和渗透感兴趣的细胞，以允许探针进入。

然后，同时对探针和细胞 DNA 进行热变性，然后进行过夜探针杂交洗涤步骤，以去除非特异性结合的探针并用 dpi 反立。为了可视化细胞核，使用荧光显微镜获得的结果最终将揭示特定基因组区域占据的细胞核位置。这种方法可以帮助回答核组织领域的关键问题，例如确定基因之间的功能相互作用。

这种特定 DNA FISH 方案的主要优点是快速、稳健且用途广泛。虽然我们使用 E Es 细胞演示了这种方法，但它也可以应用于许多其他细胞类型，由 100 到 250 个背面制成的直接标记探针。如果需要更小的探针，千碱基可以始终产生明亮的信号。

使用 40 至 50 kb 的 smid，甚至含有 5 至 10 kb 插入片段的质粒。使用集成或 UCSC 基因组浏览器识别与特定基因对应的 back 或 smid 克隆。为了制备高质量的背 DNA，使用重复沉淀或市售试剂盒，制备的清洁度与所需探针的体积成正比。

分两步进行标注。首先，使用 NIC 翻译引入氨基等位基因 DUTP。其次，使用化学偶联连接 AM 即反应性染料。

值得花时间制作明亮的探针，因为这些探针对于强烈的鱼信号至关重要。该程序可以与细胞处理同时进行，并且不必在一天开始时进行。首先将 10 至 20 ng 直接标记的探针与 6 μL CO 1D NA 混合，制备 6 μg。

然后加入 1 微升来自鲑鱼睾丸的单链 DNA，浓度为 9.7 微克。用水将混合物的体积调整至 100 微升。接下来，加入 10 微升三摩尔乙酸钠和 275 微升乙醇，涡旋混合。

让混合物在零下 20 摄氏度下沉淀至少一小时。接下来，在 4 摄氏度下以最大速度在微量离心机中旋转沉淀物 30 分钟。然后用 70% 乙醇洗涤沉淀，并在 4 摄氏度下再次旋转 5 分钟。

接下来风干颗粒。然后复苏。将其悬浮在 5 微升去离子形式中。

酰胺在 37 摄氏度时以 1000 RPM 的速度摇晃，您可以箔纸以保护其避光。30 分钟后，加入 5 微升硫酸糊精混合物，并在搅拌下继续孵育。再放置 10 分钟，细胞粘附在 Slide 上的倾向会因细胞类型而异。

对于每种细胞类型，根据经验确定最佳沉降时间和细胞密度。为了获得一致的结果，细胞应采用单细胞悬液 将小鼠 ES 细胞粘附在载玻片上。首先在载玻片上将发现细胞的区域圈出。

使用疏水笔，在普通培养基中制备每 80 至 100 微升 20 至 50， 000 个细胞的悬液，将细胞悬液加入圆圈中，让细胞在加湿培养箱中附着约三个小时。贴膜玻片后，将玻片轻轻浸入 4% PFA 中 10 分钟，以固定细胞。载玻片应平放在托盘中，如小费盒。

在 coplan 罐中使用室温试剂。首先用 tris chloride 淬灭细胞 10 分钟。其次，使用 sapin 和 triton X 100 混合物对细胞进行渗透 10 分钟。

现在在 PBS 中洗涤细胞两次，每次洗涤 5 分钟。洗涤后，将细胞在 20% 甘油中孵育至少 20 分钟。此时，载玻片可以在零下 20 摄氏度的 50% 甘油中储存数周。

存放一天或更长时间应该会增加信号强度。在继续之前，请务必在 PBS 中的 20% 甘油中将细胞平衡至室温。现在，使用液氮冷冻并解冻载玻片 3 次。

当噼啪声停止时，一次滑一次。几秒钟后，将玻片取下到纸巾上解冻，等待不透明的冷冻甘油消失，然后再再次冷冻玻片，最多可以舒适地旋转 15 个玻片进行三个冻融循环。现在在 PBS 中洗涤玻片两次，每次洗涤 5 分钟。

然后将玻片在 0.1 摩尔盐酸中孵育 30 分钟。盐酸处理后，在 PBS 中再洗涤 5 分钟。现在用更强的 sapin 和 Triton X 100 混合物再次渗透细胞 30 分钟以洗掉载玻片上的表面活性剂，使用两次 5 分钟的 PBS 洗涤。

玻片现在可以在 50% 的酰胺中平衡成 XSSC。这应该持续至少 10 分钟，同时平衡，取回探针，上下移液几次，然后将每个细胞点 10 μL 转移到适当大小的盖玻片中。从酰胺中取出载玻片，用纸巾擦干细胞周围多余的液体，但不要让细胞斑点变干。

现在倒置盖子。滑到细胞上方的载玻片上。用橡胶水泥将盖玻片密封到载玻片上。

让粘接剂完全干燥，并保持载玻片避光。接下来，在热板上将载玻片加热至 78 摄氏度正好两分钟。这对于正确执行至关重要。

此步骤中，必须保护细胞免受光线照射，以尽可能保持细胞核形态。关键是不要让电池变干并确保加热位置具有合适的温度。接下来，将载玻片放入一个带有湿纸巾的轻巧盒子中以提供湿度，并在 37 摄氏度下孵育过夜。

盖玻片周围剥下橡胶水泥。然后将每张玻片放入 X 个多余的 SC 中，直到盖子滑落、松动并滑落。接下来，在 45 摄氏度下，用 50% 形式的酰胺和 2 x 过量的 SC 洗涤玻片 15 分钟。

在水浴上盖上盖子以保护它们避光。然后在 0.2 °C 下用 63 XSSC 洗涤玻片 15 分钟。然后在 45 摄氏度下放置两个 XSSC 5 分钟，最后在室温下放置过量的 SE 5 分钟。

其余步骤均在室温下进行，从 5 分钟洗涤开始，PBS 现在用 dappy 染色玻片 2 分钟，然后用 PBS 将玻片保留 5 分钟。要安装盖玻片，请将每个细胞点 10 μL 的封固剂涂抹在正确尺寸的盖玻片上。然后从细胞斑点周围干燥多余的 PBS，不要让细胞变干。

倒置盖子，滑到载玻片上，并使用鱼探针制备方案用指甲油密封。NIC 翻译后，应该可以看到一条 DNA 弥散条带，大部分片段在 150 到 700 个碱基对之间。化学偶联后，可以通过探针通过的光谱分析来测量荧光染料的掺入。

使用这种探针来判断探针质量的这些质量控制步骤至关重要。使用落射荧光显微镜进行自动成像是可行的。这需要清晰、易于识别且背景很小的鱼信号。

这是原始视野图像。下图表示已自动识别和分析的细胞核。各种等位基因间和基因座间距离显示在右上角和每个细胞核下方的两侧。

在这个放大中，白色点代表每个视场中识别出的细胞核。这些直方图显示了上方绿色信号和下方红色信号之间的最大等位基因间距离。所有数据均来自 P 20 生殖细胞，探针位于覆盖 HBB 和 HBA 基因以及组蛋白簇的不同染色体上。

这些是用覆盖 mic 和 KC 和 Q1 基因的反向探针染色的胎儿肝核的例子。从这些图像中，可以获得鱼类信号的核坐标，并可以计算基因组区域的空间关系。等位基因间距离绘制为细胞核半径的分数。

在该数据中，红色探针比绿色探针靠得更近。需要更强信号的共聚焦显微镜也是可行的。图像堆栈用于对鱼的染色体区域内的信号进行 3D 建模。

这两个探针（红色和白色）靠近小鼠 7 号染色体的两端，整个染色体的油漆以绿色显示。看完这个视频，你应该对如何进行 DNA fish 以研究单个细胞中特定基因组位点的空间定位有一个很好的了解。在尝试此程序时，重要的是要记住所有治疗都可能影响核结构，并且重要的是要包括适当的遵循此程序。

可以执行免疫鱼等其他方法来回答其他问题，例如基因和蛋白质之间的空间关系。