Name: 遗传操纵Δku80株功能基因组分析弓形虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习在弓形虫Δku80株中进行靶向基因替换的高效方法，利用同源重组和HXGPRT筛选标记实现基因敲除与标记。该技术为寄生虫功能基因组学研究提供可靠工具，加速疫苗株开发与药物靶点发现。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）向 DJB 提供的资助（项目编号：AI041930、AI073142、AI075931 和 AI091461）。

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<li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3%2C+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li>
<li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li>
<li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li>
<li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Pathog%22%5BJournal%5D)">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007(2011).</li>
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<li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+tagging%2C+cloning%2C+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii%3A+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li>
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<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文提供了一种在Δku80寄生虫株中进行高效基因靶向操作的实验方案，可用于高效获得经过遗传修饰的子代虫株，实现基因的靶向敲除、基因替换和/或基因标记。依次实施这些方法可为分离含有单个或多个靶向遗传修饰的寄生虫突变体提供一种可靠途径1-3。尽管靶向基因敲除的效率受多种因素影响，但结合Δku80菌株与本方案所描述的策略和操作流程，可显著提高构建精确突变型T. gondii菌株的效率和便捷性，从而促进功能基因组学研究。
T. gondii 在无性阶段的基因组为单倍体。因此，在计划敲除某个基因时需要考虑的是，该基因在体外（in vitro）不能是必需的。尽管如此，在 Δku80 菌株中进行基因敲除的靶向效率极高，这使得能够分离出复制能力显著受损的突变菌株。如果靶向基因是必需的，寄生虫通常会在筛选过程中停止复制。靶向遗传操作的另一个关键因素是，必须具有至少 620 bp 的基因组靶向侧翼序列的完全同源性，才能获得可检测的靶向整合2。更长的同源区域可提高靶向效率，使用约 1,000 bp 的靶向DNA侧翼序列是一种可靠且高效的方法1-4。因此，非常重要的一点是，基因组靶向侧翼序列应来源于与待进行遗传操作的菌株（RH、Pru）相同的 T. gondii 菌株。同源性不足常常会导致一个基因组靶向侧翼序列发生靶向整合，而另一个则不能。不完全整合或未能获得基因敲除也可能源于附加体的持续存在。转染后立即出现的所有靶向分子均为非整合型附加体，有时这些靶向分子可作为附加体持续存在多代。使用约 1 Kbp 的靶向DNA侧翼序列，并在重新亚克隆前持续在筛选压力下传代寄生虫，通常可解决与附加体持续存在相关的问题。
一旦敲除得到验证且HXGPRT标记被移除后，可对第二个目的基因（GOI）重复使用基因靶向策略，从而在单个寄生虫株系中实现多个基因的连续敲除1-3。通过使用不同的可筛选标记（如bleomycin、CAT、对乙胺嘧啶耐药的DHFR等），也可实现基因的删除、替换或标记。尽管目前CAT可筛选标记仍存在于II型Δku80 Pru基因组中1，但该标记可通过本文所述的HXGPRT筛选方案予以移除。在我们的实验经验中，HXGPRT筛选是最安全且最高效的标记系统，具有最高的靶向效率，仅需单拷贝的靶向插入即可在MPA + X培养基中实现稳定的筛选效果。HXGPRT还提供了目前唯一有效的靶向删除可筛选标记的方法（图3），即利用6-巯基黄嘌呤（6TX）进行筛选2,3。因此，本实验方案是目前唯一可用于构建携带多个靶向遗传修饰的明确突变株系的方法。
该方案为Δ中的靶向遗传操作提供了一种有价值且高效的方法ku80 菌株的 弓形虫（Toxoplasma gondii） 适用于单个基因、基因家族或全基因组功能基因组学研究。在Δ可获取之前ku80 菌株1,2，这些方法由于效率低下而未能广泛应用。因此，本方案可广泛适用于靶向基因操作 弓形虫（Toxoplasma gondii） 并且向所有对寄生虫生物学、宿主反应及功能基因组学等领域研究问题感兴趣的科研人员开放使用。

弓形虫（Toxoplasma gondii） 是一种常见的专性细胞内原虫寄生虫，可频繁且慢性地感染多种动物和人类5据估计，目前全球有超过10亿人长期慢性感染该病原体。除了该病原体所致疾病的重要性外 T. gondii 感染，实验工具的日益普及，强大的基因组学资源6，简便性 体外 生长和优秀的小鼠模型使得 T. gondii 研究真核细胞内病原体及其他重要顶复门寄生虫的领先模式系统，这些寄生虫可引起疟疾等严重疾病（疟原虫 sp.) 和隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）隐孢子虫)5,7一个显著的局限性是 弓形虫（Toxoplasma gondii） 作为一种模式生物，其面临的主要问题是携带特定基因操作的后代回收效率低下。这一基因靶向难题源于同源重组的频率较低，而相对于野生型菌株中极高的非同源重组频率而言尤为突出。 T. gondii 即使在遗传学研究中使用的DNA靶标分子提供了广泛的DNA同源性时2.
我们最近在I型和II型毒株中通过基因手段阻断了非同源重组的主要通路 刚地弓形虫 通过删除编码KU80蛋白的基因1,2. 所得的I型和II型Δku80 菌株在生长速率、大小和行为方面均表现正常 在 体外 和 体内 速殖子和缓殖子阶段期间 体外 和 体内然而，这些菌株几乎表现出100%的同源重组频率，该表型使获得目标基因操作所需后代的几率提高数百至数千倍1,2,4近期在群体范围内对I型和II型Δ的使用ku80 菌株显著加快了靶向遗传学方法的研究速度、拓展了研究种类，并提高了成功率 T. gondii1-4,8-13. 本文中，我们描述了一种在Δ菌株中进行靶向基因敲除、基因替换和基因标记的综合性实验方案。ku80 菌株 T. gondii. 我们展示了如何在 Δ 中针对特定基因或遗传位点设计并可靠地实施基因操作ku80 菌株的 弓形虫（Toxoplasma gondii）

<table><tbody><tr><td>重叠引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>4 nmole Ultramer DNA 寡核苷酸</td></tr><tr><td>验证引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>100 nmole DNA 寡核苷酸</td></tr><tr><td>酵母菌株 #90845</td><td>ATCC</td><td></td><td>编号 FY834</td></tr><tr><td>穿梭载体 pRS416</td><td>ATCC</td><td>87521</td><td></td></tr><tr><td>DH10B &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>12033-015</td><td>试剂盒中的 SOC 肉汤，含 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>重悬缓冲液</td><td>Qiagen</td><td></td><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒中的 Buffer P1</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-BG05</td><td>0.5 mm 酸洗处理</td></tr><tr><td>Qiacube 自动化机器人工作站</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>2 mm 间隙</td></tr><tr><td>BTX600 电穿孔仪</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td>QIAprep Spin Maxiprep 试剂盒</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 倾斜颈插口密封烧瓶</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 倾斜颈插口密封烧瓶</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>人包皮成纤维细胞（HFF 细胞）</td><td>ATCC</td><td>SCRC1041</td><td></td></tr><tr><td>Swin-lok 滤器支架</td><td>Whatman</td><td>420200</td><td>直径 25 mm</td></tr><tr><td>滤膜</td><td>Whatman</td><td>110612</td><td>Nucleopore 轨迹蚀刻膜，孔径 3 mm，直径 25 mm</td></tr><tr><td>霉酚酸（MPA）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黄嘌呤（X）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔组织培养板</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle 培养基</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>12-611F</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti）</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>离心柱</td><td>Primm Labs</td><td>PAE-100</td><td>Easy Clean DNA 提取离心柱试剂盒</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-硫代黄嘌呤</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织 DNA 小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>QIAamp DNA Blood Mini 试剂盒</td></tr><tr><td>细胞培养冻存/复苏培养基</td><td>Gibco</td><td>126-48-010</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>不含钙，不含镁</td></tr></tbody></table>

基因操作在 Δku80 功能基因组学分析菌株 弓形虫（toxoplasma gondii）

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

利用同源重组进行靶向遗传操作是功能基因组学分析的首选方法，可深入解析基因功能及表型。构建带有靶向基因缺失、靶向突变、基因功能互补和/或基因标记的突变菌株，为研究基因功能提供了强有力的策略，特别是当这些遗传操作能够通过双交换同源重组介导的整合，高效地靶向至目标基因位点时。
由于非同源重组频率极高，功能基因组学分析 弓形虫（Toxoplasma gondii） 由于缺乏将基因缺失和基因替换高效靶向特定遗传位点的方法，此前的研究受到限制。最近，我们消除了I型和II型菌株中非同源重组的主要途径 T. gondii 通过删除编码KU80蛋白的基因1,2。该 Δku80 毒力株在速殖子（急性）和缓殖子（慢性）阶段表现正常 体外 和 体内 且表现出近乎100%的同源重组频率。Δku80 菌株使得在单基因水平以及基因组水平上进行功能基因组学研究成为可能1-4.
本文报道了利用I型和II型Δku80Δhxgprt菌株在T. gondii中改进基因靶向技术的方法。我们概述了通过靶向插入或删除次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）可筛选标记，高效实现基因敲除、基因替换和基因标记的方法。所述基因靶向方案可在Δku80菌株中以多种方式应用，以促进寄生虫基因组的功能分析，并构建携带多个靶向遗传操作的单一菌株。该遗传学方法及其后续表型分析将揭示T. gondii以及相关重要人类病原体（如引起疟疾的Plasmodium sp.和引起隐孢子虫病的Cryptosporidium）生物学的基本且独特的特征。

提供了一个详细的模板，用于构建靶向质粒以删除基因，包括限制性内切酶位点的设置、用于促进基因靶向及验证基因靶向的引物设计，以及用于后续单步删除HXGPRT的质粒构建（图1A-C、图2A、图3A）。展示了靶向基因敲除的通用示意图（图2A），用于验证基因敲除的引物对（例如I型rop18）（图2B），以及PCR验证的代表性结果（图2C）。展示该代表性结果旨在说明在相对难以靶向的基因位点可能获得的结果范围。成功的靶向基因敲除将表现为：目的基因PCR产物缺失（PCR1），3'基因组靶向侧翼序列存在（PCR2），以及在定义基因缺失区域的5'和3'基因组靶向侧翼之间正确整合的HXGPRT筛选标记存在（PCR3和PCR4）。克隆3、4、5、6、8、9和11为经验证的靶向基因敲除（knockouts），其中HXGPRT已取代目标基因（GOI）（图2C）。
不含基因缺失的克隆可能表现出多种条带模式。通常，无基因缺失的克隆会呈现与亲本菌株相同的条带模式（即“亲本模式”），在PCR1和PCR2中可观察到条带，但在PCR3和PCR4中无条带，如克隆1和2所示（图2C）。这种“亲本模式”可能由几种潜在机制导致。偶尔，MPA抗性筛选出的寄生虫携带未整合的持续性附加体质粒（pΔGOI靶向质粒），值得注意的是，持续筛选通常会促使这些附加体质粒发生整合。我们还在I型Δku80菌株中观察到一些罕见的背景信号，这是由于pΔGOI靶向质粒意外整合所致；该质粒含有通过DHFR 5'和3'启动子元件表达的HXGPRT cDNA，可能整合至DHFR位点或部分缺失的HXGPRT位点14。尽管这种罕见事件属于靶向整合，但并非预期的整合方式，因此在设计任何基因替换策略时需特别注意。若pΔGOI靶向质粒携带超过120 bp的DNA同源序列，则在Δku80菌株中可能提供其他重组位点2，从而导致非预期的背景信号。在II型Pru Δku80菌株中，由于HXGPRT筛选标记基于I型序列，而该序列与II型DNA之间存在核苷酸多态性，因此该背景信号相较于I型显著减少甚至不存在，这极大降低了使用II型Pru Δku80菌株实验中的罕见背景干扰1。如果目标基因位点为必需基因（无法被删除），或该位点的基因靶向频率极低，或持续存在的[未整合]附加体质粒难以通过培养和筛选清除，则MPA抗性克隆中将主要表现为亲本模式。另一种情况是，靶向DNA分子有时仅在基因组5'或3'靶向侧翼发生整合，此时PCR3或PCR4中仅有一个出现条带，同时PCR1和PCR2也出现条带，如克隆10（5'端整合）和克隆7（3'端整合）所示（图2C）。这些模式提示靶向质粒在该位点发生了罕见的单交换整合，导致HXGPRT被整合，但目标基因并未被删除。该模式（图2C中第7和10泳道）强调了报告PCR数据的重要性，以确认发生了预期的靶向整合，而非仅发生一次同源单交换以及靶向分子的第二次非同源整合。极少数情况下，我们观察到由克隆12所示的遗传混合模式（图2C），其同时表现出亲本模式和靶向缺失模式。这种模式很可能源于克隆孔中同一位置共存的两种不同基因型的寄生虫。
去除的通用示意图 HXGPRT 从 Δku80Δgoi::HXGPRT 删除 HXGPRT 来自该菌株的结果如图所示（图 3A）。用于验证移除效果的引物对 HXGPRT 来自 Δku80Δgra2::HXGPRT (图3B） 在PCR5中扩增出一条独特的约1.2 Kbp条带，如克隆4、7、9、11和12所示（图3C）。如果 HXGPRT 未从位点移除时，可观察到一条约 3.4 Kbp 的条带（克隆 1、2、3、6、8、10 及亲本对照）。多种机制共同作用以实现移除 HXGPRT （6TX筛选）比整合更加困难且效率更低 HXGPRT （MPA + X 筛选）。MPA 筛选比 6TX 筛选更高效14,16此外，较高水平的 HXGPRT 6TX 筛选所需的表达量比 MPA 筛选更高16,24因此，可能降低 HXGPRT 酶活性、突变或表观遗传改变导致表达水平降低 HXGPRT 在基因位点处的突变可能会完全消除6TX筛选的有效性。尽管存在这些6TX筛选的挑战，6TX筛选在Δ中的成功率仍然ku80 首次尝试时，菌株的成功率超过90%1-3.
一种用于对蛋白质编码基因进行C端直接标记的通用方案如图4所示（图4）。该方案通过同源重组在标记基因的3'端发生双交换，直接整合HXGPRT，并采用与上述类似的验证策略。当怀疑某一基因为必需基因时，可通过使用独立分离的靶向DNA质粒进行第二次转染来验证。此外，也可采用其他方法（如基因表达调控方案）进一步验证某基因是否为必需基因25。
<img alt="带有pRS416质粒、HxGPRT基因、引物和PCR分析序列表格的基因编辑示意图。" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 靶向DNA质粒设计概览。A. 设计重叠引物的示意图，用于通过PCR扩增5'和3'靶向侧翼序列，其两端分别含有33 bp的重叠序列，可与pRS416穿梭载体和HXGPRT微型基因盒连接。图中所示引物用于生成pΔROP1810. 的5'和3'靶向侧翼序列。B. 靶向DNA分子设计的整体策略。pΔGOI的骨架为pRS416穿梭载体，含有尿嘧啶（URA）和氨苄青霉素（AMP）筛选标记。插入pRS416中的包括：一段约1 Kbp的5' DNA靶向侧翼序列，通过F1和R1引物从基因组DNA中扩增而来，其两端含有与HXGPRT微型基因盒和pRS416匹配的重叠序列；一段约1 Kbp的3' DNA靶向侧翼序列，通过F2和R2引物从基因组DNA中扩增而来，其两端也含有与HXGPRT微型基因盒和pRS416匹配的重叠序列；以及HXGPRT微型基因盒。以下独特的限制性内切酶识别位点被添加至引物中：F1引物中加入RE.X（限制性内切酶X识别位点），用于在5' DNA靶向侧翼序列的5'端切割质粒；R2引物中加入RE.Y，用于在3' DNA靶向侧翼序列的3'端切割质粒；R1和F2引物中加入RE.Z，用于切除HXGPRT微型基因盒。C. 用于构建敲除rop18靶向载体的引物序列。加粗区域对应T. gondii基因组序列，非加粗区域对应限制性内切酶位点以及与pRS416和HXGPRT微型基因盒重叠的序列。HX_F和HX_R引物对用于扩增HXGPRT微型基因盒14。所有引物序列按5'至3'方向书写。表格改编自Fentress et al10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="使用 PCR 过程、引物和凝胶电泳结果进行 DNA 分析的基因编辑示意图。" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用 HXGPRT 删除基因的实验流程概览。A. 在 Δku80Δhxgprt 菌株中，通过同源双交换重组事件，利用质粒 pΔGOI 上约 1 Kbp 的 5' DNA 目标侧翼区和约 1 Kbp 的 3' DNA 目标侧翼区实现目的基因（GOI）的破坏。图中展示了 PCR 验证策略（未按比例），使用 PCR1、PCR2、PCR3 和 PCR4 引物组合，用于基因型验证，以确认 HXGPRT 的靶向整合及 GOI 位点的缺失。 B. 用于验证 rop18 基因缺失的代表性引物对。ROP18_DF 和 ROP18_DR 扩增 PCR1，ROP18_ExF 和 ROP18_CxR 扩增 PCR2，ROP18_CxF 和 DHFR_CxR 扩增 PCR3，DHFR_CxF 和 ROP18_CxR 扩增 PCR4（参见 图 2A）。所有引物序列方向均为 5' 至 3'。表格改编自 Fentress et al10。 C. 使用 HXGPRT 验证靶向基因缺失（rop18）的代表性结果。将质粒 pΔROP18 转染至 Δku80Δhxgprt 菌株，并在 MPA+X 培养基中筛选获得抗性克隆后，对其进行 rop18 缺失检测。亲本菌株对照显示 PCR1（约 400 bp）和 PCR2（约 650 bp）扩增产物为阳性，而 PCR3（约 1,200 bp）和 PCR4（约 1,300 bp）扩增产物为阴性。靶向基因敲除成功的克隆表现为 PCR2、PCR3 和 PCR4 产物阳性，而 PCR1 产物为阴性（参见 图 2A）。图中显示了 PCR1 和 PCR2（上图）、PCR3（中图）和 PCR4（下图）的代表性电泳结果。克隆 3、4、5、6、8、9 和 11 显示出正确的 PCR1、PCR2、PCR3 和 PCR4 条带模式，表明该克隆中发生了靶向基因缺失事件。克隆 1、2、7、10 和 12 并非基因缺失，代表其他可能的非特异性结果。（C = 亲本对照菌株 Δku80Δhxgprt，M = 分子量标记）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="PCR、侧翼序列和凝胶电泳结果的基因修饰过程示意图。" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 将目标基因重新靶向以删除HXGPRT的实验方案概览。A. 利用约1 Kbp的5' DNA靶向侧翼序列和约1 Kbp的3' DNA靶向侧翼序列，在菌株Δku80Δgoi::HXGPRT中通过双交换同源重组事件移除HXGPRT可筛选标记的策略，该侧翼序列位于质粒pΔGOIc上。图中展示了用于基因型验证的PCR策略，使用一对引物扩增跨越缺失区域的PCR产物（PCR5）（未按比例绘制）。B. 设计用于验证从菌株Δku80Δgra2::HXGPRT的gra2位点移除HXGPRT可筛选标记的一对代表性引物。引物GRA2_CLF和GRA2_CxR用于扩增PCR5。引物序列方向为5'至3'。C. 将质粒pΔGOIc转染至Δku80Δgoi::HXGPRT菌株并在6TX中筛选后，可能获得的6TX抗性克隆的代表性电泳图。克隆4、7、9、11和12显示出正确的PCR5条带模式，对应于HXGPRT标记的靶向缺失（约1.2 Kbp的扩增产物，跨越3'侧翼并轻微重叠5'侧翼，且位于3'侧翼外侧）。克隆1、2、3、6、8和10（该条带较弱）显示出约3.4 Kbp的预期条带模式，对应于亲本克隆的基因型，尽管这些克隆表现出一定程度的6TX抗性从而被筛选出来（这种表型偶尔会自发出现，原因是HXGPRT表达被关闭（参见 实验方案2.1（步骤8）及代表性结果部分的注释）。（C = 亲本对照菌株Δku80Δgoi::HXGPRT，M = 分子量标记）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="使用 HXGPRT 和 MPA 筛选策略进行 GOI 整合的基因编辑过程示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 用于标记蛋白C末端的靶向DNA分子设计。 该策略基于 HXGPRT 标记物同时可作为3'下游调控区的功能。pΔGOItag的骨架为pRS416穿梭载体，含有尿嘧啶（URA）和氨苄青霉素（AMP）筛选标记。插入pRS416的是一个约1 Kbp的5' DNA靶向侧翼片段，该片段通过Fgoi和Rtag引物从基因组DNA中扩增而来，并具有与HXGPRT微型基因盒和pRS416重叠的序列；另一个约1 Kbp的3' DNA靶向侧翼片段通过F2和R2引物从基因组DNA中扩增而来，同样具有与HXGPRT微型基因盒和pRS416重叠的序列，以及HXGPRT微型基因盒。5' DNA靶向侧翼片段将终止密码子替换为标签（HA、Myc、His等），随后接一个新的终止密码子。MPA + X筛选可实现C末端标签和下游HXGPRT的整合，并将3'非翻译区（UTR）移至HXGPRT标记物之后的位置。以下独特的限制性内切酶切割位点被添加至引物中：在Fgoi引物中加入RE.X（限制性内切酶X切割位点），用于在5' DNA靶向侧翼片段的5'端切割质粒；在R2引物中加入RE.Y，用于在3' DNA靶向侧翼片段的3'端切割质粒；在Rtag和F2引物中加入RE.Z，用于切除HXGPRT微型基因盒，以便在质粒构建中重新靶向已标记的基因位点，从而删除HXGPRT标记物，恢复3' UTR的原有位置。

本文报道了一种利用Toxoplasma gondii的I型和II型Δku80菌株高效构建靶向基因敲除和基因替换的方法，用于功能基因组学分析。

基因操作在 Δku80 功能基因组学分析菌株 弓形虫（Toxoplasma gondii）

使用同源重组进行靶向基因操作是功能基因组学分析的首选方法，可获得基因的详细视图……

本实验的总体目标是利用弓形虫 ndii 的 I 型和 II 型 delta two 80 菌株，实现高效且可靠的基因替换。该目标首先通过构建一个靶向 DNA 分子来实现，该分子在不同的 5' 和 3' 基因靶向 DNA 侧翼序列之间，以正向方向融合 HX GPRT 可筛选标记。实验的第二步是将该靶向 DNA 分子转染至 I 型或 II 型弓形虫 DYI 菌株中。第三步是耐心筛选发生双交换同源重组的事件，并分离单个克隆。最后一步是验证分离得到的突变克隆中是否存在基因靶向事件。最终，通过多种下游应用对靶向基因敲除、基因替换和标签基因进行分析，该实验结果可揭示寄生虫基因的功能。与使用该寄生虫野生型菌株的现有方法相比，本技术的主要优势在于，I 型和 II 型 delta 280 寄生虫背景现在能够极为可靠地筛选出靶向双交换同源重组事件，从而产生基因组精确界定的菌株。该技术将显著加快抗毒素血浆药物治疗新靶点的发现，以及安全有效减毒疫苗菌株的开发，特别是与在线基因组资源 toxodb.org 中精心设计的数据库相结合时。通常，初次接触该方法的研究人员可能在针对弓形虫（Toxoplasma gondii）构建靶向 DNA 分子或进行基因操作方面遇到困难。然而，患者的实践以及可靠靶向分子的设计将确保成功。首先从基因组DNA中通过PCR扩增目的基因的5'端和3'端基因组靶向侧翼序列。然后从HX GPRT CD NA微型基因盒中，利用其5'端和3'端的DHFR侧翼序列，通过PCR扩增HX GPRT可筛选标记。利用酵母同源重组或类似方法，将3D NA分子以正确的5'至3'方向与质粒PRS four 16连接，从而构建用于靶向目标基因缺失的质粒p delta GOI。接下来，在接种一个25 cm²的汇合HFF细胞培养瓶后68至72小时，准备含有15至30微克线性化靶向质粒的100微升样品，用于转染。通过显微观察确认新鲜裂解的寄生虫的存在，确保90%至95%的HFF细胞已被裂解；具有活性的寄生虫对于基因靶向至关重要。通过剧烈振荡密闭的烧瓶，将有活力的寄生虫充分混入溶液中，注意避免液体溅到瓶盖内侧或烧瓶颈部。从烧瓶中收集寄生虫，并按照文本方案中的描述进行转染前处理。将靶向质粒电穿孔转入delta CO 80弓形虫株。将电穿孔后的混合物转移至含有融合HFF细胞和30毫升感染培养基的150厘米培养瓶中。转染后约20小时，在37°C下将感染的细胞培养物孵育过夜。用MPA加X选择培养基替换原培养基。现在将寄生虫在37摄氏度下静置孵育约八天。待空斑可见后，轻轻振荡培养瓶，使细胞外的寄生虫从单层细胞上脱落，形成寄生虫悬液。取约0.5毫升该寄生虫悬液，转移至含有5毫升MPA加X选择培养基的新25平方厘米的汇合HFF细胞培养瓶中。大约三天后，将此培养物标记为 PAs 一代 A。从原培养瓶中取半毫升寄生虫溶液，转移到另一瓶含有相同筛选培养基的 HFF 细胞培养瓶中，重复该传代操作。在接下来的五天内，将此培养物标记为 PAs 一代 B。监测空斑形成单位（pfu）时，选择传代A或传代B中感染病灶数量充足（大于25个）的一组用于亚克隆。每当寄生虫裂解HFF细胞后，在转染后三周，将培养物传代至含选择培养基的新25 cm²培养瓶中的汇合HFF细胞中。通过将寄生虫稀释至MPA加X培养基中的适当浓度，制备新鲜感染的寄生虫，并将寄生虫悬液均匀分配至含有汇合HFF细胞的96孔板中，进行亚克隆。准备一个培养板，每孔浓度为一个寄生虫，另准备一个培养板，每孔浓度为两个寄生虫。在初始转染日期后，将两个培养板均于37摄氏度孵育。对于第一型寄生虫，在第20天之前不要进行亚克隆；对于第二型寄生虫，在第25天之前不要进行亚克隆。按照在线文本所述，每周定期传代25厘米培养瓶，直至敲除菌株得到验证。约一周后，在40至60倍放大镜下对96孔板进行观察评分，使用移液器（设定为50微升）仅挑选含有单个空斑形成单位（PFU）的孔，该单位应表现为单一的感染区域。通过引导液体流过 PFU 以分散孔中的寄生虫，混匀这些孔中的内容物。混匀选定孔后四到五天，挑选出含有裂解细胞的十几个克隆。用移液器吸头在孔底部刮擦并吸取 6 µL，将 12 个克隆从 96 孔板转移至 24 孔板的 12 个孔中。将溶液转移至含有汇合HFF细胞的24孔板的一个孔中，加入1毫升MPA加X选择培养基。将24孔板置于37摄氏度培养箱中孵育，并监测HFF细胞的裂解情况。每周定期将24孔板中发生裂解孔内的寄生虫进行传代。采用划线接种法，将两微升寄生虫溶液转移至含有 MPA 和 X 选择剂的新培养板中。传代后，从原始的 24 孔板中收集寄生虫，并转移至小管中用于 DNA 提取。最后，使用 PCR 检测目的基因的缺失，以验证五端和三端靶向侧翼序列的整合情况，并检测 HX GPRT 筛选标记的存在。该方案用于从经过修饰的 delta Q 80 菌株中移除 HX GPRT 筛选标记，具体步骤详见在线文本。通过使用六种TX培养基进行负向筛选，P delta GOYC靶向去除寄生虫中的HX GPRT。随后通过PCR确认HX GPRT的缺失情况：若HX GPRT未从基因座中被移除，则会出现一条1.2千碱基对的条带；而成功敲除后则出现一条3.4千碱基对的条带。该方案的最后部分，即蛋白质C端标记，在线文本中也有详细描述。在按照既定方案完成靶向基因敲除后，采用PCR验证了I型R 18基因敲除的缺失情况，R 18属于通常较难靶向的低拷贝基因。PCR 1显示R 18基因的PCR产物缺失。PCR 2 显示三端 R 18 基因组靶向侧翼的存在，PCR 3 和 PCR 4 显示筛选标记正确整合于五端和三端基因组靶向侧翼之间，从而界定 R 18 的缺失。为了在菌株中重复利用该筛选标记以进行后续的缺失操作，必须首先从基因座中移除原始的 HX GPRT。按照上述方案操作后即可实现。在菌株delta two 80 delta GRA two HX.G-P-R-T-P-C-R中，HX GPRT从被删除的GRA双位点中移除。通过PCR确认HX GPRT的缺失，结果显示为1.2 KILOBASE的条带。当HX GPRT未被移除时，在初始基因靶向步骤后会出现3.4 kilobase的条带。可应用其他基因靶向方法在同一I型或II型菌株中构建多个基因敲除，或对突变菌株进行标记或互补，以回答其他问题，例如：该蛋白在细胞中的定位位置？或者，该蛋白质或通路中解释其生物学功能的关键结构域或活性是什么？该技术为相关领域的研究人员深入探索模式生物AP复合物及弓形虫寄生虫中基因功能提供了途径。Gandhi eye。请注意，操作弓形虫可能存在危险，整个实验过程中应始终遵守生物安全二级（BSL-2）的所有指导准则并采取相应预防措施。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

遗传操纵<em&gt;Δku80</em&gt;株功能基因组分析<em&gt;弓形虫</em

正向遗传学是一种强大的方法，可用于揭示Toxoplasma从宿主细胞中逸出的分子机制。本文提供了化学诱变寄生虫、富集诱导逸出缺陷突变体以及验证克隆突变体表型的实验方案。...

分离Toxoplasma gondii宿主细胞逸出突变体的遗传筛选方法

细胞生物学的一个基本研究目标是阐明构成真核细胞的细胞器身份特征背后的机制。本文提出一种利用荧光显微镜和下一代测序技术鉴定植物细胞器形态与功能完整性的相关基因的方法。...

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系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

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多基因座测序用于弓形虫（Toxoplasma gondii）菌株分型

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