基因操作在 Δku80 功能基因组学分析菌株 弓形虫（Toxoplasma gondii）

本实验的总体目标是利用弓形虫 ndii 的 I 型和 II 型 delta two 80 菌株，实现高效且可靠的基因替换。该目标首先通过构建一个靶向 DNA 分子来实现，该分子在不同的 5' 和 3' 基因靶向 DNA 侧翼序列之间，以正向方向融合 HX GPRT 可筛选标记。实验的第二步是将该靶向 DNA 分子转染至 I 型或 II 型弓形虫 DYI 菌株中。

第三步是耐心筛选发生双交换同源重组的事件，并分离单个克隆。最后一步是验证分离得到的突变克隆中是否存在基因靶向事件。最终，通过多种下游应用对靶向基因敲除、基因替换和标签基因进行分析，该实验结果可揭示寄生虫基因的功能。

与使用该寄生虫野生型菌株的现有方法相比，本技术的主要优势在于，I 型和 II 型 delta 280 寄生虫背景现在能够极为可靠地筛选出靶向双交换同源重组事件，从而产生基因组精确界定的菌株。该技术将显著加快抗毒素血浆药物治疗新靶点的发现，以及安全有效减毒疫苗菌株的开发，特别是与在线基因组资源 toxodb.org 中精心设计的数据库相结合时。通常，初次接触该方法的研究人员可能在针对弓形虫（Toxoplasma gondii）构建靶向 DNA 分子或进行基因操作方面遇到困难。

然而，患者的实践以及可靠靶向分子的设计将确保成功。首先从基因组DNA中通过PCR扩增目的基因的5'端和3'端基因组靶向侧翼序列。然后从HX GPRT CD NA微型基因盒中，利用其5'端和3'端的DHFR侧翼序列，通过PCR扩增HX GPRT可筛选标记。

利用酵母同源重组或类似方法，将3D NA分子以正确的5'至3'方向与质粒PRS four 16连接，从而构建用于靶向目标基因缺失的质粒p delta GOI。接下来，在接种一个25 cm²的汇合HFF细胞培养瓶后68至72小时，准备含有15至30微克线性化靶向质粒的100微升样品，用于转染。通过显微观察确认新鲜裂解的寄生虫的存在，确保90%至95%的HFF细胞已被裂解；具有活性的寄生虫对于基因靶向至关重要。

通过剧烈振荡密闭的烧瓶，将有活力的寄生虫充分混入溶液中，注意避免液体溅到瓶盖内侧或烧瓶颈部。从烧瓶中收集寄生虫，并按照文本方案中的描述进行转染前处理。将靶向质粒电穿孔转入delta CO 80弓形虫株。

将电穿孔后的混合物转移至含有融合HFF细胞和30毫升感染培养基的150厘米培养瓶中。转染后约20小时，在37°C下将感染的细胞培养物孵育过夜。用MPA加X选择培养基替换原培养基。

现在将寄生虫在37摄氏度下静置孵育约八天。待空斑可见后，轻轻振荡培养瓶，使细胞外的寄生虫从单层细胞上脱落，形成寄生虫悬液。取约0.5毫升该寄生虫悬液，转移至含有5毫升MPA加X选择培养基的新25平方厘米的汇合HFF细胞培养瓶中。

大约三天后，将此培养物标记为 PAs 一代 A。从原培养瓶中取半毫升寄生虫溶液，转移到另一瓶含有相同筛选培养基的 HFF 细胞培养瓶中，重复该传代操作。在接下来的五天内，将此培养物标记为 PAs 一代 B。

监测空斑形成单位（pfu）时，选择传代A或传代B中感染病灶数量充足（大于25个）的一组用于亚克隆。每当寄生虫裂解HFF细胞后，在转染后三周，将培养物传代至含选择培养基的新25 cm²培养瓶中的汇合HFF细胞中。通过将寄生虫稀释至MPA加X培养基中的适当浓度，制备新鲜感染的寄生虫，并将寄生虫悬液均匀分配至含有汇合HFF细胞的96孔板中，进行亚克隆。

准备一个培养板，每孔浓度为一个寄生虫，另准备一个培养板，每孔浓度为两个寄生虫。在初始转染日期后，将两个培养板均于37摄氏度孵育。对于第一型寄生虫，在第20天之前不要进行亚克隆；对于第二型寄生虫，在第25天之前不要进行亚克隆。

按照在线文本所述，每周定期传代25厘米培养瓶，直至敲除菌株得到验证。约一周后，在40至60倍放大镜下对96孔板进行观察评分，使用移液器（设定为50微升）仅挑选含有单个空斑形成单位（PFU）的孔，该单位应表现为单一的感染区域。

通过引导液体流过 PFU 以分散孔中的寄生虫，混匀这些孔中的内容物。混匀选定孔后四到五天，挑选出含有裂解细胞的十几个克隆。用移液器吸头在孔底部刮擦并吸取 6 µL，将 12 个克隆从 96 孔板转移至 24 孔板的 12 个孔中。

将溶液转移至含有汇合HFF细胞的24孔板的一个孔中，加入1毫升MPA加X选择培养基。将24孔板置于37摄氏度培养箱中孵育，并监测HFF细胞的裂解情况。每周定期将24孔板中发生裂解孔内的寄生虫进行传代。

采用划线接种法，将两微升寄生虫溶液转移至含有 MPA 和 X 选择剂的新培养板中。传代后，从原始的 24 孔板中收集寄生虫，并转移至小管中用于 DNA 提取。

最后，使用 PCR 检测目的基因的缺失，以验证五端和三端靶向侧翼序列的整合情况，并检测 HX GPRT 筛选标记的存在。该方案用于从经过修饰的 delta Q 80 菌株中移除 HX GPRT 筛选标记，具体步骤详见在线文本。

通过使用六种TX培养基进行负向筛选，P delta GOYC靶向去除寄生虫中的HX GPRT。随后通过PCR确认HX GPRT的缺失情况：若HX GPRT未从基因座中被移除，则会出现一条1.2千碱基对的条带；而成功敲除后则出现一条3.4千碱基对的条带。

该方案的最后部分，即蛋白质C端标记，在线文本中也有详细描述。在按照既定方案完成靶向基因敲除后，采用PCR验证了I型R 18基因敲除的缺失情况，R 18属于通常较难靶向的低拷贝基因。PCR 1显示R 18基因的PCR产物缺失。

PCR 2 显示三端 R 18 基因组靶向侧翼的存在，PCR 3 和 PCR 4 显示筛选标记正确整合于五端和三端基因组靶向侧翼之间，从而界定 R 18 的缺失。为了在菌株中重复利用该筛选标记以进行后续的缺失操作，必须首先从基因座中移除原始的 HX GPRT。按照上述方案操作后即可实现。

在菌株delta two 80 delta GRA two HX.G-P-R-T-P-C-R中，HX GPRT从被删除的GRA双位点中移除。通过PCR确认HX GPRT的缺失，结果显示为1.2 KILOBASE的条带。当HX GPRT未被移除时，在初始基因靶向步骤后会出现3.4 kilobase的条带。可应用其他基因靶向方法在同一I型或II型菌株中构建多个基因敲除，或对突变菌株进行标记或互补，以回答其他问题，例如：该蛋白在细胞中的定位位置？

或者，该蛋白质或通路中解释其生物学功能的关键结构域或活性是什么？该技术为相关领域的研究人员深入探索模式生物AP复合物及弓形虫寄生虫中基因功能提供了途径。Gandhi eye。

请注意，操作弓形虫可能存在危险，整个实验过程中应始终遵守生物安全二级（BSL-2）的所有指导准则并采取相应预防措施。