Name: 无创性气管内插管，以研究小鼠肺的病理生理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-08T22:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: 学习无创性气管内插管技术，利用BioLite照明系统定位小鼠气管并精准递送实验药物，通过绿色染料可视化药物在肺部的均匀分布，为研究肺部病理生理及开发治疗方案提供可重复的动物模型方法。

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本工作由国家癌症研究所癌症研究中心的院内研究计划资助。

以下方案描述了一种非侵入性、简单且快速向小鼠肺部递送目标物质的方法。该实验程序已获得国家癌症研究所动物护理和使用委员会的批准。
1. 麻醉
<ol>
	<li>首先，使用氯胺酮和赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉（剂量分别为100 mg/kg体重和10 mg/kg体重）。此为ACUC推荐的麻醉方案及剂量。在此剂量下，小鼠至少会保持无意识状态约20分钟。</li>
	<li>为防止小鼠在麻醉期间眼睛干涩，需在其眼部涂抹眼用软膏。</li>
	<li>数分钟后，轻捏小鼠足部以检查其意识状态。确认无意识后，将小鼠置于&#160;将插管支架倾斜约60°，并将其上颌切牙钩挂在支架顶部的小橡胶圈上以固定位置。</li>
</ol>
2. 气管内插管
<ol>
	<li>使用棉签轻轻将小鼠的舌头向一侧牵拉。</li>
	<li>使用 BioLITE 插管照明系统时，小心插入插管装置，借助光纤导光束观察到喉部结构。</li>
	<li>一旦观察到会厌和杓状软骨，将光纤经会厌上方插入至杓状软骨之间，并继续推进，直至导管插入至合适长度。</li>
</ol>
注意：为了确定需要插入的导管合适长度，应预先使用一只体型相似的练习小鼠测量从口腔到支气管分叉点的长度（图1）。该长度在很大程度上取决于小鼠的体型。导管插入应停止在分叉点上方（对于体重约25 g的小鼠，约为1.5 cm）。这可确保灌注物质进入所有肺叶。操作者需至少对50只练习小鼠进行训练，才能熟练掌握插管技术（熟练的定义为插管成功率超过95%）。
<ol start="4">
	<li>插入导管后，迅速将光纤导光束从导管中取出，以使动物能够正常呼吸。当不使用插管照明系统时，按上述方法直接插入导管。</li>
	<li>将含有待研究物质的溶液加入导管中。确保加入后溶液立即被吸入肺部。通常情况下，每约25 g小鼠体重使用50 µL。</li>
</ol>
3. 动物恢复
<ol>
	<li>一旦溶液被吸入肺部，立即将小鼠从支架上取下，并放回原来的笼子中。</li>
	<li>观察小鼠，直至其开始活动。</li>
	<li>确认小鼠状态良好后，将笼子放回饲养架。</li>
</ol>

<ol><li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> J. Vis. Exp. (73), e50318(2013).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+murine+intranasal+dosing+efficiency+using+luminescent+Francisella+tularensis%3A+effect+of+instillation+volume+and+form+of+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia.</a> PLoS One. 7, e31359(2012).</li>
<li>Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (51), e2702(2011).</li>
<li>Riesenfeld, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+salmeterol+and%2For+fluticasone+alters+structure%2Ffunction+in+a+murine+model+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease.</a> Respir. Res. 11, 22(2010).</li>
<li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).</li>
<li>Bonniaud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+transforming+growth+factor+beta1-induced+lung+fibrosis+is+blocked+by+an+orally+active+ALK5+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Res.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor.</a> Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).</li>
<li>Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+pulmonary+aerosol+delivery+in+mice+by+the+endotracheal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).</li>
<li>Haegens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+deficiency+attenuates+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+inflammation+and+subsequent+cytokine+and+chemokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production.</a> J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).</li>
<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+pregnant+mice+to+carbon+black+by+intratracheal+instillation%3A+toxicogenomic+effects+in+dams+and+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring.</a> Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).</li>
<li>Bodewes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Influenza+A%2FH5N1+virus+infection+in+ferrets+differs+between+intranasal+and+intratracheal+routes+of+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation.</a> Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).</li>
<li>Winslow, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+lung+adenocarcinoma+progression+by+Nkx2-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1.</a> Nature. 473, 101-104 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

本文所述的气管内插管是一种简单且高效的非侵入性方法，可将目标物质均匀递送至小鼠肺部。该方法可用于研究给予物质对肺生理和/或病理过程的影响和/或作用。所给予的物质可以是内源性分子（如细胞因子），也可以是外源性物质（如异生物质化学物/药物、致癌物、污染物、过敏原或病毒），这些物质可导致多种肺部状况，可能作为研究各种人类疾病的模型6-10。该技术还可与重组腺病毒或慢病毒联合使用，以在气道上皮细胞中实现目的基因的过表达或缺失，从而研究这些基因在肺稳态、生理、病理和/或致癌过程中的作用。通过在上皮细胞中瞬时表达Cre重组酶，可实现对上皮细胞中特定floxed基因的敲除11。
导管容易误插入与气管相邻的食管。本文所述的方法中，插管照明系统可为导管应插入的正确位置提供引导5。该系统由一根光纤组成，该光纤稳定连接至光源，并配备一种特殊设计的微型光学透镜系统，可使光线聚焦于光纤上。光纤的输送端可插入一次性静脉导管内，该导管用作经气管插管。该系统可直接照亮口咽部，使插管过程中能够清晰观察喉部结构。一旦操作者熟练掌握使用该照明系统的技术后...

肺是一个常被诊断出多种严重疾病的器官。其中，肺癌在男性和女性中均为第二常见的癌症类型，也是癌症死亡的最常见原因。慢性阻塞性肺疾病，又称肺气肿和慢性支气管炎，是一种非常严重的疾病，是美国第三大死因。据2011年估计，约有2590万美国人患有哮喘，其中包括710万18岁以下儿童。哮喘是15岁以下儿童住院的第三大原因（美国肺脏协会，<a href="http://www.lung.org" target="_blank">http://www.lung.org</a>）。为了研究这些严重疾病的病理生理学和/或病因学及其潜在机制，建立精确的模型至关重要，同时需要便捷且无创地向肺部递送各种感兴趣的物质。由于基因敲除小鼠和转基因小鼠的可获得性不断提高，以及大量可用的遗传信息，小鼠成为研究肺部疾病病理学和生理学背后分子机制的最佳模型之一。
已有多种方法被不同研究者在不同实验条件下用于将目标物质递送至小鼠肺部，包括吸入法、经鼻滴注、气管内滴注和气管插管法1-4。其中，气管插管法尚未被常规使用，因其被认为操作难度较高。本文所述的气管插管技术是一种非侵入性、简便且快速的方法，可用于将目标物质递送至小鼠肺部，以研究递送物质对肺组织基因表达模式、病理学和/或生理学的影响5。该技术可确保外源性物质递送至整个肺部，且不涉及任何存活手术&#160;，因此很可能获得各机构动物护理与使用委员会的批准。

<table><tbody><tr><td>KetaVed</td><td>Vedco</td><td></td><td>氯胺酮</td></tr><tr><td>AnaSed 注射液 20 mg</td><td>LLOYD</td><td></td><td>赛拉嗪</td></tr><tr><td>BioLite 支架</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS100</td><td>适用于小鼠</td></tr><tr><td>BioLite 气管插管照明系统</td><td>Braintree Scientific</td><td>BIO MI-KIT</td><td>适用于小鼠</td></tr><tr><td>22 G，1 英寸静脉导管</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225CA</td><td>适用于体重&lt;strong&gt;低于&lt;/strong&gt;30 g 的小鼠。&amp;nbsp;仅在未使用气管插管照明系统时使用该导管。</td></tr><tr><td>20 G，1 英寸静脉导管</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2025CA</td><td>适用于体重&lt;strong&gt;超过&lt;/strong&gt;30 g 的小鼠。&amp;nbsp;仅在未使用气管插管照明系统时使用该导管。</td></tr></tbody></table>

无创气管插管法研究小鼠肺部病理与生理

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

使用模拟人类肺部疾病状况的模型，对于研究特定疾病的病理生理学和/或病因学以及开发治疗干预措施至关重要。随着基因敲除和转基因小鼠品系的日益可及，以及大量遗传信息的积累，小鼠成为研究肺部疾病病理学和生理学分子机制的最佳模型之一。吸入法、鼻内滴注法、气管内滴注法和气管插管法是目前研究者广泛采用的将目标物质递送至小鼠肺部的主要技术。每种技术均有其优缺点，具体选择取决于研究目的。本文介绍一种可直接将外源性物质递送至小鼠肺部的非侵入性气管插管方法。该技术已应用于将博来霉素递送至小鼠肺部，以建立肺纤维化研究模型。

最初，使用绿色染料溶液对小鼠进行插管练习。插管后立即切除肺组织，以观察染料在肺内的分布均匀程度（图2）。该技术被应用于研究博来霉素诱导的肺纤维化，实验采用C57BL/6小鼠。当小鼠经气管插管给予1.2 U/kg博来霉素或等量生理盐水作为对照，并在3周后处死进行尸检时，小鼠全肺均出现由博来霉素诱导的纤维化，组织学检查及羟脯氨酸含量升高均支持这一结果（图3）。通过20倍物镜获取的肺组织图像和一个包含121个点的网格系统评估损伤区域。统计落在纤维化区域上的交点（点数），并以占总点数（121个）的百分比表示。由此计算出的损伤区域百分比与所给予的博来霉素剂量呈正比（图4）。
<img alt="大鼠解剖示意图；咽部、喉部结构标注；用于生物学教学" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50601/50601fig1highres.jpg" src="/fil...

使用模拟人类肺部疾病状况的模型对于研究特定疾病的病理生理学和/或病因学以及开发治疗干预措施至关重要。本文介绍了一种可将外源性物质直接递送至小鼠肺部的无创经气管插管方法。

使用模拟人类肺部疾病状况的模型对于研究特定疾病的病理生理学和/或病因学至关重要……

本实验的总体目标是通过气管内插管，研究实验处理对小鼠对侧肺生理学和病理学的影响。首先测量一只与实验小鼠体型相近的对照小鼠，从口腔至肺部支气管分叉点的距离。随后，使用 BioLite 插管照明系统定位气管。插入后，迅速移除光纤，使导管保留在原位。最后一步，通过导管将含有实验处理物质的溶液注入肺部。最终，通过伴随使用的绿色染料，可在整个肺组织中观察到目标分子的均匀分布。与其他插管方法相比，该技术的主要优势在于，采用我们的方法时，光纤消除系统有助于定位三叉以及导管的放置，确保将目标物质最佳地递送至肺部。演示该操作的将是来自我实验室的一名博士后研究人员。在开始操作前，使用一只体型相似的练习小鼠测量从口腔至支气管点的长度，以确定插管过程中应插入的导管合适长度。然后将兽用眼膏涂抹于麻醉实验动物的双眼。数分钟后，轻捏小鼠足部以确认其已进入镇静状态，然后将动物置于插管架上，呈约60度角站立。将小鼠上切牙钩住支架顶部的小橡胶圈以固定动物位置，随后使用棉签轻轻将小鼠舌头向一侧牵拉。该操作中最困难的部分是清晰地定位气管，气管与食管是分离的，导管应插入气管中。为了确保成功，必须保证喉部被光纤充分照亮，并明确导管应插入的方向。小心插入插管系统，直至在光纤引导的帮助下观察到喉部结构。当观察到会厌和舌骨软骨后，将光纤从会厌上方穿过，并置于舌骨软骨之间，推进装置，直至已插入预定长度的导管。导管就位后，迅速撤出类似导丝的光纤，使动物能够正常呼吸，随后将目标溶液经导管注入。成功的插管可使溶液立即经导管被吸入肺部。一旦溶液被吸入肺部，立即将小鼠从支架上取下并放回原来的笼子中。观察小鼠直至其开始活动。确认动物健康状况良好后，将笼子放回饲养架。在初步实验中，使用绿色染料溶液对小鼠进行插管练习。插管后立即切除肺组织，以检查染料分布的均匀程度。观察到染料存在于肺的大部分区域，表明插管成功。随后，该技术被应用于研究博来霉素诱导的肺纤维化，实验采用C57BL/6小鼠，在经气管插管给予博来霉素或生理盐水（对照组）三周后进行分析。通过组织学分析检测博来霉素诱导纤维化的发展情况。在生理盐水处理的小鼠肺组织中，无论低倍还是高倍镜下均未观察到纤维化现象。相比之下，经气管插管给予博来霉素的小鼠在整个肺部均出现纤维化，这在低倍和高倍显微图像中均清晰可见。与生理盐水处理的小鼠肺组织相比，博来霉素处理小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量更高，进一步证明了博来霉素处理可诱导小鼠发生肺纤维化。随后在损伤区域上覆盖一个121点的格栅，计数落在纤维化区域上的交点或点的数量，并以121个总点数的百分比表示；由此计数得到的损伤区域百分比与给予的博来霉素剂量成正比。务必提前确定导管应插入气管的深度，并在加入溶液后立即确认其通过导管被吸入肺内。

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小鼠肺内气管移植：肺移植后闭塞性气道疾病研究模型

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