Name: 自我报告的支架3维细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 学习利用荧光纳米传感器与PLGA电纺支架构建自报告三维细胞培养系统，实现实时原位监测微环境pH变化，为组织工程与再生医学研究提供非侵入性动态分析工具。

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感谢英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）的资助（资助编号 BB H011293/1）。

概述
第1节描述了pH响应型纳米传感器的制备，以及利用荧光光谱法表征纳米传感器对pH的响应，并通过扫描电镜（SEM）表征其尺寸。
第2节描述了静电纺丝聚合物支架的制备，以及利用扫描电子显微镜（SEM）对其形貌和尺寸进行表征。第2节还介绍了自报告支架的制备，即在静电纺丝支架中引入pH响应型纳米传感器所形成的支架。通过SEM对所得的自报告支架进行表征，以评估静电纺丝纤维是否发生任何形态学变化。通过共聚焦显微镜评估由所掺入纳米传感器产生的自报告支架的荧光信号。
第3节描述了在电纺支架和自报告支架上进行细胞培养的方法。首先对支架进行灭菌处理，以备细胞培养使用；随后评估支架，以确定灭菌过程以及细胞培养是否会影响自报告支架的荧光性能。该方案还介绍了将纳米传感器递送至生长在电纺支架上的细胞的方法。使用溶酶体示踪染料（Lysotracker dye）确认纳米传感器未被摄入细胞的酸性区室中。
1. pH 响应性溶胶-凝胶纳米传感器的制备与分析
1.1 pH 响应性溶胶-凝胶纳米传感器的制备
注意：该步骤应在通风橱中进行。
<ol>
	<li>在圆底烧瓶中，将5-(和-6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（FAM-SE）（1.5 mg）溶于二甲基甲酰胺（DMF）（1 mL）；在另一圆底烧瓶中，将6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯（TAMRA-SE）（1.5 mg）溶于DMF（1 mL）。向每个烧瓶中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）（1.5 mL），于干燥氮气氛围下避光搅拌反应24小时（21 °C）。 即 用铝箔包裹样品。</li>
	<li>将上述两种染料（250 µl）加入含乙醇（6 ml）和氨水（30 wt %，4 ml）的圆底烧瓶中，搅拌反应1小时（21 °C）。</li>
	<li>缓慢加入四乙氧基硅烷（TEOS）（0.5 ml）至混合物中，继续搅拌2小时。混合物将变为浑浊。通过旋转蒸发收集纳米传感器。纳米传感器可储存于4℃的玻璃小瓶中 oC 以供将来使用。 警告：以干燥形式进一步处理纳米传感器时，应在通风橱中进行；若需称重，应将天平置于密闭容器内，例如 Weighsafe 中。</li>
</ol>
1.2 纳米传感器对 pH 的响应
<ol>
	<li>通过混合不同比例的磷酸二氢钠（0.2 M）和磷酸氢二钠（0.2 M）储备液，配制pH值范围为5.5–8.0的Sørensen磷酸盐缓冲液。使用pH计检测最终pH值，并用氢氧化钠（NaOH）（4 M）或盐酸（HCl）（2 M）进行微调。</li>
	<li>将pH纳米传感器悬浮于pH缓冲液（5 mg/ml）中，首先将装有纳米传感器溶液的容器在涡旋振荡器上振荡3分钟，然后将容器置于超声波清洗仪中处理，直至溶液变浑浊（约5分钟）。重复上述步骤，以确保纳米传感器在溶液中充分悬浮。</li>
	<li>将第一份溶液放入光学比色皿中，使用488 nm激发5-（和-6）-羧基荧光素（FAM），568 nm激发6-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）。利用荧光光谱仪在500–530 nm范围内收集FAM的发射波长，在558–580 nm范围内收集TAMRA的发射波长。</li>
	<li>更换光学比色皿中的溶液，以观察不同pH条件下的信号变化，并持续收集发射光谱。</li>
	<li>计算在每个pH值下产生的发射峰强度比值，绘制校准曲线。</li>
</ol>
1.3 纳米传感器的扫描电镜观察
<ol>
	<li>将纳米传感器样品置于碳涂层电子显微镜载片上，在氩气环境中溅射镀金5分钟。</li>
	<li>通过扫描电子显微镜（SEM）进行观察。成像过程中调节工作距离、电压和放大倍数，以尽量减少电子荷积（图1）。</li>
</ol>
2. PLGA支架的制备与分析
2.1 静电纺丝制备PLGA支架
<ol>
	<li>在通风橱中，将聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）溶于二氯甲烷（DCM）（20% (w/w)）中，并加入甲酸吡啶盐（PF）（1% (w/w)）。将该溶液加入一支10 ml&#160;注射器中，使用18 G钝头填充针头，并牢固安装至注射泵上。</li>
	<li>将针头尖端与一块20 cm × 15 cm的铝制收集板保持20 cm的距离。</li>
	<li>将高压电源的电极连接至注射器针头尖端，接地线连接至铝制收集板。
	 注意：操作时需谨慎，因涉及高电压，i.e. 在接触静电纺丝设备前，务必先关闭电源。</li>
	<li>以3.5 ml/h的恒定流速，在12 kV电压下持续纺丝2小时。在此条件下进行静电纺丝可获得厚度约为60 µm的支架材料。</li>
	<li>将支架材料置于通风橱中静置24小时，以使残留溶剂充分挥发。</li>
</ol>
2.2 静电纺丝制备pH响应性PLGA支架
<ol>
	<li>制备含有pH响应型纳米传感器的支架，具体步骤如第2.1节所述，但需进行如下修改：将纳米传感器加入聚合物溶液（5 mg/mL）中。在将溶液装入10 mL注射器之前，通过超声处理（约5分钟）使纳米传感器均匀分散于PLGA溶液中。</li>
</ol>
2.3 PLGA支架与pH响应性支架的扫描电镜观察
<ol>
	<li>将 PLGA 支架或 pH 响应性支架样品置于碳涂层电子显微镜载片上，并按照纳米传感器扫描电镜分析所述步骤进行操作（图 1）。</li>
</ol>
2.4 pH 响应支架的校准
<ol>
	<li>将pH响应性支架样品放入35 mm的培养皿中，并浸入适当的缓冲溶液中。</li>
	<li>在共聚焦显微镜上，使用488 nm氩激光激发纳米传感器中的FAM，使用568 nm氪激光激发TAMRA。观察pH响应性支架在500-530 nm（FAM）和558-580 nm（TAMRA）范围内的荧光发射。（图2）。采用逐帧扫描模式，以避免收集到激发光波长。</li>
</ol>
3. 在PLGA支架和pH响应性PLGA支架上进行细胞培养
注意：以下操作应在细胞培养柜中进行。
3.1 细胞培养用PLGA支架的制备
<ol>
	<li>将 PLGA 或 pH 响应性 PLGA 支架切割成 2 cm2 的小片。</li>
	<li>通过紫外光（UV）照射对支架进行灭菌，距离为 8 cm，每面照射 15 分钟。</li>
	<li>将支架转移至 12 孔细胞培养板中，并在其上方放置一个钢环。在钢环内外加入含青霉素/链霉素（5% v/v）的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。注：该钢环由诺丁汉大学制造，尺寸如下：外径 2 cm，内径 1 cm，深度 1 cm。</li>
	<li>移除灭菌溶液，并用 PBS 洗涤。</li>
	<li>在钢环内（500 µl）和外（500 µl）加入细胞培养基，将培养板置于培养箱中（37 °C，5% CO2），同时制备细胞悬液。</li>
	<li>制备细胞悬液，并使用台盼蓝排斥法进行细胞计数。</li>
	<li>配制细胞悬液，使细胞浓度达到 1 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>移除钢环内外的培养基。</li>
	<li>在钢环外侧加入预热的细胞培养基（1 ml）。</li>
	<li>在钢环内侧加入 300 µl 细胞悬液——轻轻前后摇动培养板以均匀分布细胞。</li>
	<li>将细胞培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2）中培养——细胞应在 24 小时内完成贴壁，但应根据实验需要继续培养，并每 2–3 天更换一次培养基。</li>
</ol>
3.2 纳米传感器递送至培养在PLGA支架上的细胞
<ol>
	<li>按照第3.1节所述方法将细胞接种到PLGA支架上。本研究使用空白PLGA支架（不含纳米传感器），以避免成像时荧光发射重叠。</li>
	<li>将接种细胞的支架置于培养箱中（37 °C，5% CO2）培养72小时，使细胞在纳米传感器递送前充分生长并迁移至支架内部。</li>
	<li>在递送纳米传感器前，用PBS洗涤细胞，并将培养基从标准培养基更换为不含抗生素和血清的培养基，于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。注：3T3细胞的标准培养基为添加胎牛血清（10% (v/v)）、L-谷氨酰胺溶液（2 mM）和青霉素/链霉素（1% (v/v)）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。</li>
	<li>在孵育期间，通过短暂超声处理纳米传感器（5 mg）与Opti-MEM（50 µl）配制溶液A。</li>
	<li>将Lipofectamine 2000（5 µl）加入Opti-MEM（45 µl）中制备溶液B，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将溶液A加入溶液B中，室温孵育20分钟，形成溶液C，即纳米传感器-脂质体复合物。</li>
	<li>将溶液C（100 µl）加入细胞中，于37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。</li>
	<li>从培养箱中取出接种细胞的支架，吸除培养基，用PBS洗涤两次，然后加入PBS（1 ml），以便通过共聚焦显微镜观察活细胞。注：本实验方案使用PBS，以避免细胞培养基中的酚红指示剂产生自发荧光，同时也因需在不同pH条件下进行校准。然而，若需对细胞培养进行长期分析，可使用不含酚红的培养基。</li>
	<li>将接种细胞的支架浸入不同pH的缓冲液中，监测与细胞相关的纳米传感器的响应。</li>
	<li>通过共聚焦显微镜观察FAM和TAMRA的荧光强度比值，测定细胞内pH（图3）。</li>
</ol>
3.3 纳米传感器在哺乳动物细胞内的定位
<ol>
	<li>按照第3.2节所述，用仅含有FAM染料的纳米传感器孵育细胞（这是因为TAMRA的荧光发射光谱与LysoTracker Red处于相同的光谱区域）。按照第1.1节所述方法制备这些纳米传感器，但省略TAMRA的制备和添加步骤。</li>
	<li>在纳米传感器递送期结束后，将LysoTracker Red储存液稀释至50 nM。</li>
	<li>向培养在PLGA支架上的细胞中加入稀释后的溶液一份（2 µl）。</li>
	<li>用LysoTracker Red孵育细胞1小时（37 °C，5% CO2）。</li>
	<li>孵育结束后，移除培养基，并用PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次，然后更换为PBS（pH 7.4）（2 ml），以准备共聚焦显微镜观察。注意：可使用不含酚红的培养基代替PBS。</li>
	<li>向PBS中加入核染料Draq5，使其终浓度为5 µM，并与细胞孵育3分钟（37 °C，5% CO2）。Draq5孵育后无需更换溶液。</li>
	<li>使用488 nm氩激光激发仅含FAM的纳米传感器，使用568 nm氪激光激发LysoTracker Red，使用633 nm氦/氖激光激发Draq5发色团，并分别在500-530 nm、580-600 nm和650-750 nm波段检测荧光信号（图3）。采用逐帧扫描模式以避免激发波长的串扰。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

组织工程旨在创造可用于替代的生物替代物，既可作为 体内 像 体外 组织模型及在组织替代疗法中用于修复、替换、维持或增强特定组织或器官的功能。多年来，人们一直使用合成替代物来替代或辅助修复受损组织，但这些材料常因与宿主组织整合不良和/或发生感染而失败，最终导致排斥反应或需要再次手术。在植入前于实验室中构建活体组织，可能有助于实现完全整合，并减少再次手术的需求。然而，要实现这一目标，必须具备适当的 体外 在三维结构中细胞的扩增与操控应与组织的适当物理刺激相结合 体外这可以通过多种方式实现，其中之一是继续深入研究相关的基本生物学问题，同时开展针对合成替代物生产过程中所涉及的工程与制造问题的研究。本方案旨在为后一问题的解决做出贡献。
所述PLGA支架的预期用途是为哺乳动物细胞提供临时支撑，以协助其生长形成具有生物学意义的结构。将分析物响应型纳米传感器整合入PLGA支架中，可在组织生长过程中实时监测三维结构内局部分析物的浓度变化。采用pH响应型支架可判断支架降解和细胞生长过程中产生的酸性副产物是否被有效清除出三维结构内部...

组织工程中的一个关键策略是使用生物相容性材料制备支架，其形态需类似于待替换的组织，并能够支持细胞的生长和功能1,2。支架通过促进细胞黏附和增殖提供机械支撑，同时允许细胞在三维细胞结构的孔隙中迁移。支架还必须允许细胞营养物质的质量传递，并不妨碍代谢废物的排出3。
静电纺丝已成为一种有前景的聚合物支架制备方法，能够支持细胞生长4-6。所生成的无纺静电纺丝纤维适合细胞生长，因其通常具有多孔结构，可促进细胞间相互作用以及细胞在三维细胞构建体间隙中的迁移7。在培养期间监测细胞活力，并确保整个三维构建体中细胞活力得以维持，具有重要意义。例如，氧浓度和pH等培养条件需严格控制，因为在三维构建体内可能存在分析物浓度梯度。可采用生物反应器或灌注系统来模拟in&#160;vivo的间质流条件，从而增强营养物质传递和代谢废物清除8。通过实时评估细胞微环境，可回答此类系统是否能够确保稳定的微环境条件这一问题。
可实时监测的关键微环境参数包括：温度、细胞培养基的化学成分、溶解氧和二氧化碳浓度、pH 值以及湿度。在这些参数中，温度最易于通过in situ探针进行监测。对于其余所列参数的监测方法通常需要取出部分样品，因而会干扰细胞培养并增加污染风险。目前正致力于开发连续、实时的监测方法。现有的监测手段通常依赖于物理探针直接插入细胞结构中，例如pH监测仪或氧探针。然而，这类侵入性方法可能损伤细胞结构并干扰正在进行的实验。对三维结构内分析物浓度的非侵入式监测，有望实现对营养物质消耗等环境因素的实时监控9。这将有助于评估营养物质向结构深层区域的输送情况，并判断代谢废物是否被有效清除10,11。为解决侵入性问题而设计的系统通常采用灌流培养室，使培养基流经培养容器和外部传感器，以监测pH、氧和葡萄糖水平12。目前，人们越来越关注开发可直接集成到培养容器中的传感器，这类传感器无需取样即可实现in&#160;situ监测。
为解决微环境条件的原位（in&#160;situ）和无创监测中存在的上述不足，我们已将分析物响应型纳米传感器整合到电纺支架中，以制备出自报告支架13。此前已有研究制备了通过监测荧光活性来发挥传感功能的支架，其中传感元件或是通过静电纺丝形成的聚合物支架本身，或是将分析物响应性染料在支架成型前掺入聚合物中实现14,15。然而，这些传感装置可能因其他分析物的干扰而产生错误的光学输出信号。采用如本方案所述的比率型传感装置，有望消除这些潜在的不利影响，并提供针对目标分析物的特异性响应。
本文所展示的静电纺丝支架由合成共聚物聚（乳酸-共-乙醇酸）制备而成) （PLGA），因其具有美国食品药品监督管理局（FDA）批准的资质，且具备可生物降解性和生物相容性，并有支持多种细胞类型生长与功能的既往记录而被选用16-18制备的比率型分析物响应纳米传感器对 pH 具有响应性。该纳米传感器将两种荧光染料包埋于生物相容性溶胶-凝胶基质中，其中一种染料 FAM 对 pH 响应，另一种染料 TAMRA 因不受 pH 影响而作为内参标准。此外，由于 FAM 与 TAMRA 的荧光发射光谱无明显重叠，可对两者的荧光信号进行独立检测。通过测定两种染料在特定波长下的荧光发射强度比值，可获得不受其他环境因素干扰的 pH 响应信号。这种自报告支架可实现对 pH 的重复性评估

关键词：比率型纳米传感器，pH 响应，FAM，TAMRA，溶胶-凝胶基质，荧光染料，内参标准，自报告支架 原位 并且能够实时进行，而不会破坏已构建的3D模型。我们已证明，这些支架能够支持细胞的黏附与增殖，并对目标分析物保持响应性。工程化构建体中酸性代谢产物的动力学特性目前仍研究不足，因此，采用pH响应性支架将有望显著推动此类研究。19此外，将自报告支架用于组织工程应用，为全面理解、监测和优化三维模型组织构建物的生长提供了可能 体外 无创且实时地。
pH 响应型纳米传感器还被递送至培养在电纺 PLGA 支架上的成纤维细胞的细胞内环境。通过检测染料荧光发射的比值来监测细胞内 pH（pHi），并将其与整合了 pH 纳米传感器的自报告支架进行比较。将纳米传感器递送至三维环境中培养的细胞，可实现对构建物深部分析物浓度的无损监测。因此，纳米传感器可能成为一种可行的成像工具，用于对三维构建物中细胞行为进行无损、长期的分析。对三维构建物内单个细胞的分析物浓度进行筛查，可确保细胞获得充足的营养物质和氧气浓度。对过程参数的监测有助于建立标准化技术，以有效促进氧气和营养物质的质量传递。将纳米传感器递送至细胞内环境，并将其整合到聚合物支架中，这两种方法可结合使用，从而在组织生长过程中同时评估细胞活力以及支架在三维构建物中的性能。这可能增进对这类构建物的理解，并推动具有生物学相关性的组织替代物的制备进程。

<table><tbody><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>无水二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Sigma</td><td>270547</td><td></td></tr><tr><td>50%（v/v）氨水溶液</td><td>Alfa Aesar</td><td>35574</td><td>用纯水稀释至30%（v/v）</td></tr><tr><td>TEOS</td><td>Sigma</td><td>13190-3</td><td></td></tr><tr><td>3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）</td><td>Sigma</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>5-（和6-）羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（FAM-SE）</td><td>Invitrogen</td><td>C1311</td><td></td></tr><tr><td>6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯（TAMRA-SE）</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠（0.2 M）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（0.2 M）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Source Bioscience</td><td>Batch-213-101992</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>OptiMem</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus Ltd</td><td>DR50050</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷（DCM）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica TCS-SP</td><td></td><td>配备氩离子和氪离子激光器以及63X 0.9NA水浸物镜</td></tr><tr><td>紫外光源</td><td>UVLS28 UVP, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>SB161-3 Jencons-PLS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Jenway model 3510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Buchi Rotary Evaporator R200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机（纳米传感器用）</td><td>Hermle Z300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机（细胞培养用）</td><td>Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Whirlimixer Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>FB11021 Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>诺丁汉大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm细胞培养皿</td><td>Iwaki</td><td>3000035</td><td></td></tr><tr><td>10 ml注射器</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3成纤维细胞</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Lakeshore Biomaterials</td><td>7525 DLG 7E</td><td></td></tr><tr><td>甲酸吡啶鎓</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8535</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr></tbody></table>

用于三维细胞培养的自报告支架

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

在合适的支架上以三维形式培养细胞被认为能更好地模拟 体内 微环境并增强细胞间相互作用。所形成的三维细胞结构在研究分子事件和细胞间相互作用方面，通常比二维条件下的类似实验更具相关性。为了在整个支架中实现具有高细胞活力的有效三维培养，必须严格控制培养条件（如氧气和pH），因为在三维结构内部可能存在分析物浓度梯度。本文描述了制备生物相容性pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器的方法，及其与聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架的整合过程，以及后续用于哺乳动物细胞培养的准备步骤。这种pH响应型支架可作为工具，用于测定三维细胞结构内的微环境pH值。此外，我们详细介绍了将pH响应型纳米传感器递送至由电纺PLGA支架支持生长的哺乳动物细胞胞内环境的方法。这些位于细胞质中的pH响应型纳米传感器可用于在实验过程中实时监测细胞内pH（pHi）。

所制备的pH响应型纳米传感器的粒径分布通过扫描电镜（SEM）进行表征，对成像的纳米传感器群体进行测量，发现其纳米尺寸范围为240–470 nm图1A）。获得较窄且相对较小的直径与采用Stöber法制备纳米颗粒的结果一致。研究发现，在纳米颗粒合成过程中使用碱性pH环境 即 采用Stöber法制备的纳米颗粒可较好地控制粒径，而在酸性条件下制备则导致粒径分布较宽。采用所述方法制备的PLGA电纺纤维的代表性扫描电镜（SEM）显微照片如图所示 图1B 表明所制备的PLGA支架由无纺纤维构成，纤维呈纳米级尺寸，且极少出现串珠状结构或断裂。 图1C 证明在PLGA溶液中以5 mg/mL的浓度添加纳米传感器后，所得纤维与对照样品相当 图1B扫描电镜显微照片提供了纳米传感器与纤维表面结合的证据，但纳米传感器也可能被包埋在支架纤维内部。可结合扫描电镜和/或共聚焦显微镜对这些支架/纳米传感器复合支架进行降解研究，以确定其对纳米传感器性能的影响。
通过共...

可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在&#160;原位 在支架上进行细胞培养时对微环境条件进行监测。这种方法的优势在于，可在不干扰实验的情况下对三维细胞结构进行实时监测。

在适当的支架上进行细胞的三维培养被认为能更好地模拟体内微环境，并增强细胞间的相互作用。由此产生的……

以下实验的总体目标是制备可响应 pH 的纳米传感器和自报告支架，这些传感器和支架可实现实时、原位监测，从而有助于深入了解影响细胞生长的条件。该目标首先通过制备可响应分析物的生物相容性纳米传感器来实现，这些传感器可通过荧光信号输出监测 pH 值；其次，将可响应 pH 的纳米传感器整合到聚合物电纺支架中，形成可供细胞培养和监测的三维环境。接下来，将哺乳动物细胞接种于电纺支架上，同时将纳米传感器递送至细胞内环境，以监测细胞内pH值。实验过程中获得的结果表明，基于共聚焦显微镜获取的荧光比值，细胞内纳米传感器与自报告支架能够有效监测组织工程环境中的pH变化。该技术相较于现有方法（如使用电子pH探针）的主要优势在于，可在不干扰细胞生长的情况下，原位、实时地进行测量。首先，将1.5毫克FAM SE溶解于1毫升二甲基甲酰胺（DMF）中，置于一个圆底烧瓶内。另取一个烧瓶，将1.5毫克TAMRA SE溶解于1毫升DMF中。然后，向每个烧瓶中各加入1.5毫升3-氨基丙基三乙氧基硅烷，于21 °C下在干燥氮气氛围中避光持续搅拌反应24小时。接下来，将250微升的两种染料溶液加入一个含有6毫升乙醇和4毫升氢氧化铵的混合液中，该混合液置于圆底烧瓶内。在21摄氏度下搅拌此新混合液1小时后，缓慢加入0.5毫升正硅酸四乙酯，继续搅拌2小时。在此期间，混合物会变浑浊，随后通过旋转蒸发收集纳米传感器，并将其储存在玻璃小瓶中，于4°C下保存以备后续使用。接下来，将干燥的pH纳米传感器以每毫升5毫克的浓度加入Sorenson磷酸盐缓冲液中，缓冲液pH范围从5.5至7.5，以0.5为增量。通过涡旋振荡样品3分钟使纳米传感器重新悬浮，然后超声处理5分钟，或直至溶液变浑浊。通过在488纳米（FAM）和568纳米（Tamara）的激发波长下测量样品来收集校准数据。对于Tamara，分别在500至530纳米（FAM）和558至580纳米（Tamara）范围内收集发射信号，并计算在每个pH值下产生的发射峰最大值的比值。随后，将纳米传感器样品置于碳涂层电子显微镜样品台上，在氩气氛围下对颗粒进行5分钟的溅射镀金处理，以制备用于扫描电镜（SEM）成像的样品。包被完成后，将样品放入电子显微镜中，在通风橱内调节工作距离、电压和放大倍数，以尽量减少电子荷积并获得最佳图像。用二氯甲烷配制含1%对苯二甲酸的20%PLGA溶液。将该溶液装入带有18号钝头填充针头的10毫升注射器中，并牢固地安装到注射泵上。该溶液将用于制备对照 PLGA 支架，将针尖与一块 20 厘米 × 15 厘米的铝制收集板保持 20 厘米的距离，并将高压电源的电极连接至注射器针头，将导线接地至铝制收集板。接着，打开电源并将电压调节至 12 千伏。然后启动注射泵，以每小时 3.5 毫升的恒定流速输送溶液，持续两小时。这将产生约60微米的支架厚度。完成后，关闭设备并将支架置于通风橱中24小时，以使溶剂残留完全挥发。为制备掺入pH响应型纳米传感器的支架，按前述方法制备PLGA溶液，但此次需同时加入5毫克/毫升的纳米传感器。然后使用与之前相同的参数对pH响应性材料进行电纺。接下来，通过将含有纳米传感器的干燥支架小样品置于35毫米的培养皿中，并将其浸入2毫升Sorensen磷酸盐缓冲液（pH值从5.5至7.5，以0.5为增量）中，在共聚焦显微镜下校准支架的pH响应性。使用488纳米氩激光激发FAM，使用568纳米氪激光激发纳米传感器中的Tamara。在FAM为500至530纳米、Tamara为558至580纳米的发射波长范围内进行观察，然后计算在每个pH值下产生的发射峰最大值的比值。首先，将支架置于八厘米距离的紫外光源下，每侧照射15分钟，以对支架表面进行灭菌。随后，在无菌条件下将支架转移至12孔细胞培养板中，并将一个内径为一厘米、外径为两厘米的钢环置于支架上方。接下来，将含有5%青霉素-链霉素的PBS加入钢环的内侧和外侧，并将样品在其中孵育过夜。第二天，移除含5%青霉素-链霉素的PBS，并用PBS洗涤支架。然后向钢环的内侧和外侧各加入 500 µL 细胞培养基，并将培养板放入培养箱中预热。接着，收集目标细胞并制备浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/毫升的细胞悬液。当细胞准备就绪后，吸出孔中的培养基，并在钢环外侧加入 1 mL 新鲜培养基。然后将 300 µL 细胞悬液加入钢环内侧，轻轻摇动培养板以均匀分布细胞。将培养板放入含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中，根据需要孵育细胞。每两到三天更换一次培养基，按照前一节所述方法将细胞接种至支架上，并使其连续生长 72 小时。然后用 PBS 清洗细胞，在环外加入 500 µL 无血清培养基，环内加入 300 µL。将培养板在 37 °C 条件下孵育 1 小时。孵育期间，通过将 5 mg 纳米传感器与 50 µL Opti-MEM 混合并短暂涡旋，制备溶液 A。然后通过将5 µL的lipectomy 2000加入45 µL的Optum中配制溶液B，并将混合物在室温下孵育5分钟。接着，将溶液A加入溶液B的混合物中，再于室温孵育20分钟，形成溶液C，即纳米传感器脂质体复合物。从孵育器中取出培养板，将100 µL该复合溶液加入钢环内侧。然后将培养板放回培养箱，继续孵育细胞，使细胞与脂质体试剂复合物共孵育三小时。孵育结束后，吸除培养基，用预热的PBS洗涤细胞两次，再将带有细胞的支架浸入不同pH的缓冲液中，以监测纳米传感器的响应。随后在细胞内利用荧光共聚焦显微镜对细胞成像，追踪纳米传感器在哺乳动物细胞内的定位。首先，将仅含有纳米传感器的病毒颗粒（fam）制备并递送至接种在PLGA支架上的细胞。然后，在300微升培养基中加入两微升50纳摩尔的Lyo Tracker Red，于37摄氏度孵育一小时。孵育结束后，移除培养基，并用PBS洗涤细胞两次。然后加入2 µL的PBS或其他不含酚红的培养基，以覆盖共聚焦成像过程中的细胞。接着，在PBS中加入5 µmol的细胞核染料Drac 5，与细胞在37°C下孵育3分钟。3分钟后，将培养板从孵箱中取出，并置于共聚焦显微镜载物台上进行成像，利用不同激发和发射波长对纳米传感器、酸性细胞器及细胞核进行成像，具体参数详见配套文本方案，同时采用顺序扫描模式以避免激发波长的串扰。所制备的pH响应型纳米传感器的粒径分布通过扫描电镜（SEM）进行表征，对所观测的纳米传感器群体进行测量，结果显示其粒径尺寸在240至470纳米范围内。左侧显示的是电纺 PLGA 纤维的图像，右侧是带有纳米传感器的电纺 PLGA 纤维。纤维的扫描电镜显微照片提供了纳米传感器与纤维表面结合的证据。然而，纳米传感器也可能被包埋在支架纤维内部。静电纺丝完成后，这些纳米传感器仍保持光学和化学活性，如图所示与支架纤维结合。左侧为绿色显示的fam染料，右侧为红色显示的Tamara染料。荧光强度比例如图生成校准曲线。单独评估的纳米传感器与掺入电纺PLGA支架后的纳米传感器表现一致，表明纳米传感器在掺入支架后仍保持其光学活性。掺入后的纳米传感器对pH值变化也表现出良好的可逆响应，当缓冲液在pH 5.5和pH 7.5之间交替时，FAM/Tamra比值每次均按预期发生相应变化。以下是通过转染试剂将纳米传感器递送至细胞内后的成纤维细胞的共聚焦图像。FAM 和 Tamara 染料的点状共定位表明，这些染料仍被包裹在纳米传感器基质中。通过测定将细胞置于不同缓冲液中后的 FAM/Tamara 比值，可验证纳米传感器的细胞内递送效果。如您在此处所见，测量支架基纳米传感器时，该比值会升高，而测量细胞内传感器时则保持稳定。该技术开发后，组织工程领域的研究人员将能够对三维细胞构建物内的细胞内微环境 pH 变化进行原位、实时监测，且不会干扰正在进行的实验。

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科研

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Bioengineering

生物工程

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用于三维细胞培养的自报告支架

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