用于三维细胞培养的自报告支架

以下实验的总体目标是制备可响应 pH 的纳米传感器和自报告支架，这些传感器和支架可实现实时、原位监测，从而有助于深入了解影响细胞生长的条件。该目标首先通过制备可响应分析物的生物相容性纳米传感器来实现，这些传感器可通过荧光信号输出监测 pH 值；其次，将可响应 pH 的纳米传感器整合到聚合物电纺支架中，形成可供细胞培养和监测的三维环境。

接下来，将哺乳动物细胞接种于电纺支架上，同时将纳米传感器递送至细胞内环境，以监测细胞内pH值。实验过程中获得的结果表明，基于共聚焦显微镜获取的荧光比值，细胞内纳米传感器与自报告支架能够有效监测组织工程环境中的pH变化。该技术相较于现有方法（如使用电子pH探针）的主要优势在于，可在不干扰细胞生长的情况下，原位、实时地进行测量。

首先，将1.5毫克FAM SE溶解于1毫升二甲基甲酰胺（DMF）中，置于一个圆底烧瓶内。另取一个烧瓶，将1.5毫克TAMRA SE溶解于1毫升DMF中。然后，向每个烧瓶中各加入1.5毫升3-氨基丙基三乙氧基硅烷，于21 °C下在干燥氮气氛围中避光持续搅拌反应24小时。

接下来，将250微升的两种染料溶液加入一个含有6毫升乙醇和4毫升氢氧化铵的混合液中，该混合液置于圆底烧瓶内。在21摄氏度下搅拌此新混合液1小时后，缓慢加入0.5毫升正硅酸四乙酯，继续搅拌2小时。

在此期间，混合物会变浑浊，随后通过旋转蒸发收集纳米传感器，并将其储存在玻璃小瓶中，于4°C下保存以备后续使用。接下来，将干燥的pH纳米传感器以每毫升5毫克的浓度加入Sorenson磷酸盐缓冲液中，缓冲液pH范围从5.5至7.5，以0.5为增量。通过涡旋振荡样品3分钟使纳米传感器重新悬浮，然后超声处理5分钟，或直至溶液变浑浊。

通过在488纳米（FAM）和568纳米（Tamara）的激发波长下测量样品来收集校准数据。对于Tamara，分别在500至530纳米（FAM）和558至580纳米（Tamara）范围内收集发射信号，并计算在每个pH值下产生的发射峰最大值的比值。随后，将纳米传感器样品置于碳涂层电子显微镜样品台上，在氩气氛围下对颗粒进行5分钟的溅射镀金处理，以制备用于扫描电镜（SEM）成像的样品。

包被完成后，将样品放入电子显微镜中，在通风橱内调节工作距离、电压和放大倍数，以尽量减少电子荷积并获得最佳图像。用二氯甲烷配制含1%对苯二甲酸的20%PLGA溶液。将该溶液装入带有18号钝头填充针头的10毫升注射器中，并牢固地安装到注射泵上。

该溶液将用于制备对照 PLGA 支架，将针尖与一块 20 厘米 × 15 厘米的铝制收集板保持 20 厘米的距离，并将高压电源的电极连接至注射器针头，将导线接地至铝制收集板。接着，打开电源并将电压调节至 12 千伏。然后启动注射泵，以每小时 3.5 毫升的恒定流速输送溶液，持续两小时。

这将产生约60微米的支架厚度。完成后，关闭设备并将支架置于通风橱中24小时，以使溶剂残留完全挥发。为制备掺入pH响应型纳米传感器的支架，按前述方法制备PLGA溶液，但此次需同时加入5毫克/毫升的纳米传感器。

然后使用与之前相同的参数对pH响应性材料进行电纺。接下来，通过将含有纳米传感器的干燥支架小样品置于35毫米的培养皿中，并将其浸入2毫升Sorensen磷酸盐缓冲液（pH值从5.5至7.5，以0.5为增量）中，在共聚焦显微镜下校准支架的pH响应性。使用488纳米氩激光激发FAM，使用568纳米氪激光激发纳米传感器中的Tamara。

在FAM为500至530纳米、Tamara为558至580纳米的发射波长范围内进行观察，然后计算在每个pH值下产生的发射峰最大值的比值。首先，将支架置于八厘米距离的紫外光源下，每侧照射15分钟，以对支架表面进行灭菌。随后，在无菌条件下将支架转移至12孔细胞培养板中，并将一个内径为一厘米、外径为两厘米的钢环置于支架上方。

接下来，将含有5%青霉素-链霉素的PBS加入钢环的内侧和外侧，并将样品在其中孵育过夜。第二天，移除含5%青霉素-链霉素的PBS，并用PBS洗涤支架。

然后向钢环的内侧和外侧各加入 500 µL 细胞培养基，并将培养板放入培养箱中预热。接着，收集目标细胞并制备浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/毫升的细胞悬液。当细胞准备就绪后，吸出孔中的培养基，并在钢环外侧加入 1 mL 新鲜培养基。

然后将 300 µL 细胞悬液加入钢环内侧，轻轻摇动培养板以均匀分布细胞。将培养板放入含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中，根据需要孵育细胞。每两到三天更换一次培养基，按照前一节所述方法将细胞接种至支架上，并使其连续生长 72 小时。

然后用 PBS 清洗细胞，在环外加入 500 µL 无血清培养基，环内加入 300 µL。将培养板在 37 °C 条件下孵育 1 小时。孵育期间，通过将 5 mg 纳米传感器与 50 µL Opti-MEM 混合并短暂涡旋，制备溶液 A。

然后通过将5 µL的lipectomy 2000加入45 µL的Optum中配制溶液B，并将混合物在室温下孵育5分钟。接着，将溶液A加入溶液B的混合物中，再于室温孵育20分钟，形成溶液C，即纳米传感器脂质体复合物。从孵育器中取出培养板，将100 µL该复合溶液加入钢环内侧。

然后将培养板放回培养箱，继续孵育细胞，使细胞与脂质体试剂复合物共孵育三小时。孵育结束后，吸除培养基，用预热的PBS洗涤细胞两次，再将带有细胞的支架浸入不同pH的缓冲液中，以监测纳米传感器的响应。随后在细胞内利用荧光共聚焦显微镜对细胞成像，追踪纳米传感器在哺乳动物细胞内的定位。

首先，将仅含有纳米传感器的病毒颗粒（fam）制备并递送至接种在PLGA支架上的细胞。然后，在300微升培养基中加入两微升50纳摩尔的Lyo Tracker Red，于37摄氏度孵育一小时。孵育结束后，移除培养基，并用PBS洗涤细胞两次。

然后加入2 µL的PBS或其他不含酚红的培养基，以覆盖共聚焦成像过程中的细胞。接着，在PBS中加入5 µmol的细胞核染料Drac 5，与细胞在37°C下孵育3分钟。3分钟后，将培养板从孵箱中取出，并置于共聚焦显微镜载物台上进行成像，利用不同激发和发射波长对纳米传感器、酸性细胞器及细胞核进行成像，具体参数详见配套文本方案，同时采用顺序扫描模式以避免激发波长的串扰。所制备的pH响应型纳米传感器的粒径分布通过扫描电镜（SEM）进行表征，对所观测的纳米传感器群体进行测量，结果显示其粒径尺寸在240至470纳米范围内。

左侧显示的是电纺 PLGA 纤维的图像，右侧是带有纳米传感器的电纺 PLGA 纤维。纤维的扫描电镜显微照片提供了纳米传感器与纤维表面结合的证据。然而，纳米传感器也可能被包埋在支架纤维内部。

静电纺丝完成后，这些纳米传感器仍保持光学和化学活性，如图所示与支架纤维结合。左侧为绿色显示的fam染料，右侧为红色显示的Tamara染料。荧光强度比例如图生成校准曲线。

单独评估的纳米传感器与掺入电纺PLGA支架后的纳米传感器表现一致，表明纳米传感器在掺入支架后仍保持其光学活性。掺入后的纳米传感器对pH值变化也表现出良好的可逆响应，当缓冲液在pH 5.5和pH 7.5之间交替时，FAM/Tamra比值每次均按预期发生相应变化。

以下是通过转染试剂将纳米传感器递送至细胞内后的成纤维细胞的共聚焦图像。FAM 和 Tamara 染料的点状共定位表明，这些染料仍被包裹在纳米传感器基质中。通过测定将细胞置于不同缓冲液中后的 FAM/Tamara 比值，可验证纳米传感器的细胞内递送效果。

如您在此处所见，测量支架基纳米传感器时，该比值会升高，而测量细胞内传感器时则保持稳定。该技术开发后，组织工程领域的研究人员将能够对三维细胞构建物内的细胞内微环境 pH 变化进行原位、实时监测，且不会干扰正在进行的实验。