Name: 细胞内记录，感官字段映射，并在水蛭养殖鉴定神经元，医用水蛭 /i (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学习医用水蛭神经节细胞内记录技术，用于神经科学和电生理学研究。该方法可培养神经元并绘制感觉野图谱，为理解神经回路和细胞功能提供重要实验基础。

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1. 电极和生理盐水溶液的制备
<ol>
	<li>在解剖动物之前，准备好生理盐水和电极。水蛭林格氏溶液的成分为：115.3 mM NaCl、1.8 mM CaCl2、4.0 mM KCl、10 mM Tris/马来酸或HEPES。将pH值调节至7.4。</li>
	<li>通过将清洁的银丝浸入少量漂白剂中20分钟&#160;或直至银丝表面形成均匀的深灰色涂层，来制备氯化银（Ag-Cl）导线。使用前用蒸馏水冲洗导线。然后将导线插入连接放大器的微电极夹持器中。&#160;</li>
	<li>使用拉管仪制备尖端锋利的硼硅酸盐玻璃微电极。电极电阻应在20 MΩ左右。</li>
	<li>用3 M醋酸钾溶液从后端填充微电极，并将其插入微电极夹持器中。</li>
	<li>对于细胞外电极，按上述方法制备尖锐的玻璃微电极&#160;，通过在另一根尖锐微电极的锐边附近轻轻摩擦使尖端回折断裂，然后对尖端进行火焰抛光，以避免撕裂神经连索。只要电极与神经之间接触良好，也可使用塑料制成的细胞外电极。</li>
	<li>将细胞外记录电极插入配有橡胶管和注射器（用于施加负压）的微电极夹持器（内含Ag-Cl导线）中。使用注射器将生理盐水吸入电极内，液面至少达到银丝的高度。</li>
	<li>根据所用信号记录设备的说明书，设置硬件（放大器和刺激隔离器）和软件的记录参数。参见Leksrisawat et al.22 了解下文所述实验所用设备的详细信息。&#160; &#160;</li>
</ol>
2. 腹神经节解剖
<ol>
	<li>在盛有蛭 Ringer 液的大号硅胶弹性体衬里培养皿中解剖蛭。若将动物纵向拉伸，则更易于取出腹神经索（见图 1A）。</li>
	<li>使用 #10 或 #11 手术刀，在腹侧中线处以极浅的切口做纵向切开。腹侧切口的中间约 2/3 部分如图 1B所示。尽量不要切穿黑色“袜状”结构（即腹侧血窦），直至动物完全打开且血窦被拉直无扭曲。该血窦沿动物腹侧中线全长分布，腹神经索（VNC）即位于此血管内部。</li>
	<li>当皮肤已沿全长切开后，使用精细虹膜剪在血窦上做小切口（图 2）。将虹膜剪的一侧刀片轻轻插入血窦下方，并略微抬起刀片，使其与神经组织分离。沿腹神经索全长剪开血窦时，应避免损伤神经根、节段神经或神经节之间的连索。</li>
	<li>接下来，通过在血管与神经根连接处的远端切断神经根，移除部分腹神经索。沿腹神经索全长对每个神经节重复此操作。</li>
	<li>将包含一个或两个神经节的节段转移至较小的培养皿中。神经节或单个神经节需用针固定，保持适度张力并留有轻微松弛。</li>
	<li>固定连索和神经根，使神经节的胶质鞘轻微拉伸，以防止在穿刺胶质鞘并进入目标神经元时神经元胞体移动。固定针应穿过神经根处的黑色血窦，并置于两个连索中间位置，以最大限度减少轴突损伤（图 3）。</li>
	<li>将装有标本的培养皿置于显微镜下，并用蜡固定于皿底，防止移动。</li>
	<li>使用反光镜和聚光器仔细调节光束，以便观察神经元，如图 4A所示（示意图见图 4B）。注意神经节中央两个较大的 Retzius 细胞。</li>
	<li>为记录 Rz、T、P 和 N 神经元的细胞内电位，需将电极尖端小心置于目标细胞上方，缓慢下放直至在胶质鞘表面观察到微小凹陷。</li>
	<li>轻敲电极夹持器或操纵器（需极为小心），使电极尖端“弹入”目标细胞内。</li>
	<li>向细胞内注入短促电流脉冲（30–40 毫秒），施加正向电流（1–10 nA），以诱发动作电位。</li>
</ol>
3. 从腹神经节制备物中培养神经元
<ol>
	<li>将神经节腹侧朝上固定在含有L-15培养基和胎牛血清（FCS）的洁净培养皿中（图3）。固定神经根，使神经节轻微拉伸，方法同前述细胞内记录实验。用精细剪刀在一端切开胶质囊，将剪刀的一侧刀片插入胶质囊下方，然后按图5A所示方式剪开胶质囊。</li>
	<li>向培养皿中加入100 µl胶原酶/中性蛋白酶（Collagenase/Dispase）溶液，置于摇床上孵育15分钟。通过移动培养液观察暴露的细胞体。将样品重新放回摇床继续孵育15分钟或更长时间，直至细胞可被轻微抽吸即可脱离组织。</li>
	<li>使用连接注射器的移液管轻柔地从神经节中提取细胞。将移液管尖端进行火焰抛光，使其直径略大于细胞体。对于成年医用水蛭（leech）中的Rz细胞，移液管尖端直径应约为50 µm。</li>
	<li>准备多种不同直径且不含纤维丝的移液管，以减少细胞黏附在管内的可能性。将移液管存放于底部垫有棉球以保护尖端免受损伤的瓶中，并加入80%乙醇（EtOH）保存。注意在吸取细胞前需用培养基彻底冲洗移液管中的乙醇。</li>
	<li>酶处理后，用含FCS的L-15培养基清洗两次，去除含酶的培养液。识别目标细胞，通过拉动注射器将细胞轻柔吸入移液管中（图6A）。将吸出的细胞排入另一含有L-15（含FCS）的培养皿中。</li>
	<li>此前所有操作均为非无菌操作。后续步骤需在无菌操作台中进行。在无菌培养皿内不同位置放置3–4个较大的无菌L-15（含FCS）液滴。</li>
	<li>将细胞移入前述液滴之一，在液滴中轻轻吹打以洗涤细胞。依次在3至4个新鲜培养基液滴中重复此洗涤过程。</li>
	<li>将洗涤后的细胞转移至盛有L-15（含FCS）的洁净培养皿中。</li>
	<li>在室温下孵育细胞1–24小时。此后即可进行细胞接种。若将细胞静置数小时或过夜，可使细胞外基质更易脱落。若需促进细胞形成较长突起，应立即接种细胞。</li>
	<li>使用无菌基质包被微孔培养皿，并在进行培养实验前使其完全干燥（过夜）。</li>
	<li>包被完成后，先用无菌水轻轻冲洗培养皿，再用少量L-15培养基冲洗。注意使用不含FCS的L-15溶液，以利于细胞贴附于培养皿表面。待细胞贴壁后，可轻柔更换为含FCS的L-15培养基。若细胞在接种后数小时内即使用，则无需更换为含FCS的培养基。</li>
	<li>接种时将细胞彼此靠近放置，以促进快速突触形成（图6B）。24小时后，检测成对神经元之间的生理活性。</li>
	<li>采用细胞内电生理技术记录培养中成对细胞的静息电位（RP）或突触反应（通过一根细胞内电极刺激一个神经元，并用第二根细胞内电极记录配对细胞的反应）。</li>
</ol>
4. 神经节体壁制备
<ol>
	<li>如上所述，将蛭类背侧朝下固定在衬有弹性材料的培养皿中。</li>
	<li>将皮肤一侧固定，使切断的神经节另一侧保留根部（图7A，放大见图7B）；或在蛭体腹侧神经节上方制作一个窗口，保留通向体壁的所有神经根完整（图7C）。</li>
	<li>在某一感觉细胞（T、P、N细胞）中获得稳定的细胞内记录后，使用经火焰抛光的小玻璃棒轻轻触碰同一体节的皮肤。若记录的是N细胞，则需对皮肤施加更大的压力。大多数情况下，只有用镊子夹捏皮肤时N细胞才会产生反应。因此，应最后尝试记录这些细胞，以免因过度操作而损伤皮肤或导致细胞内记录电极移位。</li>
	<li>应能够快速绘制出皮肤与神经节的示意图，详细标注刺激位置，以便确定特定神经元的感受野。在尽可能记录完一个神经节两侧的T细胞和P细胞后，再尝试记录N细胞。</li>
	<li>为检验感觉神经元的突起是否通过神经连索以头端或尾端方向延伸，并经相邻体节的神经根到达皮肤，可切断神经节之间的连索，重新检测感受野的分布范围。主要目的是观察感受野是否出现缺失。</li>
</ol>
5. 注射荧光染料
<ol>
	<li>按照上述方法制备蛭类神经节。</li>
	<li>用荧光黄-CH（3.0%）和氯化锂（300 mM）溶液填充微电极。</li>
	<li>按照上述方法，刺入位于神经节腹侧的一个感觉细胞或Rz细胞。</li>
	<li>通过电极施加负电流（3 nA）持续15分钟，以将染料注入细胞。设定脉冲持续时间为100毫秒，频率为2 Hz。</li>
	<li>使用汞灯配合FITC/GFP滤光片组激发染料，观察染料标记的神经元。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本系列实验的目的在于：1）教授并展示对可识别神经元进行细胞内记录的基本原理；2）利用成年医用水蛭识别这些特定类型神经元所产生的特征性电信号波形。水蛭在神经生理学研究中具有悠久的研究历史，目前仍被广泛用于探讨发育过程中以及突触修复与再生期间的神经回路和基因调控问题10。神经调制，特别是通过生物源性胺类通路的调制，也是水蛭研究中取得成功的重要方向。通过在灌流液中添加多巴胺及其他药理学试剂，已证明多巴胺能够调制参与决策过程23以及爬行行为运动模式24,25的神经网络。这种实验方法为教学实验室引入调制机制提供了一种简单且低成本的途径，而调节灌流液的离子成分则是讲授能斯特方程和Goldman-Hodgkin-Katz方程的有效方式。
要成功进行神经节制备，关键在于尝试用细胞内电极穿刺胞体之前，必须使神经节保持紧绷状态。否则，在下压胶质包膜时胞体会随之移动。此外，在剥离神经节以获取用于培养的神经元时，切割神经节应避开目标区域，以免在取出过程中损伤胞体。同时，酶消化时间过长可能导致神经元过于脆弱而难以完整取出。由于每批酶的活性略有差异，理想的消化时间需通过多次尝试和调整才能确定。
进一步优化培养基的培养条件可改进该技术。可考察胰岛素、糖类或生长因子等因素对培养物长期维持的影响。为确定细胞是否保持合成神经递质的能力（例如Rz细胞中5-羟色胺的合成），可应用中性红染色标记5-羟色胺能纤维。此外，在损伤后数天，可通过核染色对损伤及再生组织中小胶质细胞的侵入情况进行定量分析。
尽管这种制备方法在研究再生与修复以及神经回路方面具有诸多优势，但突触处各类受体亚型的药理学和分子鉴定尚未完全明确。目前已建立表达序列标签文库26，医蛭基因组也正在组装中27，但与某些模式生物制备相比，医蛭的主要局限在于难以对特定细胞类型中的特定基因进行基因组改造。在胚胎中，该局限已通过注射DNA或dsRNA以调控基因表达的方式得到解决28。基因枪技术最近已被用于在医蛭神经元中表达无脊椎动物连接蛋白（innexin）。表达来自Hirudo verbana的innexin蛋白（Hve-inx6）足以在医蛭中形成异位间隙连接29。在未来几年内，医蛭——即H. verbena30 &#160;，必将推动我们对电突触生理学及其进化机制的理解。&#160;

水蛭制备标本可用于研究动物中枢神经系统（CNS）中可识别的神经元（包括感觉神经元、运动神经元和中间神经元）的功能。水蛭神经元的一个重要特性是，其动作电位的波形和生物物理特性对特定类型的细胞具有特征性。即 P、N、T、Rz。此外，可将神经元从动物体内取出，并在合适的培养基中进行培养，细胞的电学特性可维持长达45天。1,2.
利用蛭类神经节学习电生理记录技术的一个显著优势在于，细胞在神经节内具有特征性且可靠的排列模式，这种模式使得不同神经节之间以及不同个体之间的特定细胞类型得以识别。早在1891年，Retzius就已注意到蛭类神经节中神经元的独特位置和形态3。了解神经元的身份及其功能，有助于神经回路的研究，并便于针对特定类型的细胞开展实验。由于神经节内神经元的胞体相对较大，在解剖显微镜下即可观察到，因此可选择性地用微电极穿刺胞体，以记录其电学特性。
染料和大分子可被注入单个细胞中，并通过膜片钳技术研究其通道特性。已在不同神经元中鉴定出产生特征性动作电位各种波形的离子电流4-7。通过对中枢神经系统内单个神经元的支配模式和分支结构的研究，已在培养条件下重建了已鉴定神经元之间的突触连接2,8。对蛭类神经节的研究有助于理解功能性神经回路的发育过程，这些回路既可通过电生理学方法检测，也可通过整体动物行为学研究进行观察。此外，蛭类中枢神经系统也已成为研究整体动物及体外培养条件下神经元修复与再生机制的重要实验模型4-6,9-12。
在哺乳动物大脑中，要根据已鉴定单个神经元的特性及其连接关系来解释行为是一项艰巨的任务。原则上，人们可以寄希望于通过研究结构较为简单的系统（如蛭类），来揭示高等动物所使用的基本机制。目前，已对蛭类中产生游泳模式13,14以及心脏节律15所依赖的神经连接进行了充分表征。某些蛭类神经元能够同时形成电突触和化学突触，这一能力引人关注。一些连接为单向化学传递，而另一些则为化学单向但电学双向传递7。理解动物体内的突触连接，以及在培养皿中重建相同类型的连接，是研究突触发生16-18和突触药理学特性分析19的有力工具。本文所述的细胞内记录与刺激技术，为神经行为学、发育研究以及药理学检测奠定了基础。
此外，可将节段性腹神经索与一块受神经支配的皮肤一同解剖下来。通过维持皮肤组织及其神经元的存活状态，可通过记录细胞体的电信号来探测感觉感受野。即 中枢神经系统内相应腹神经节中感觉神经元的胞体。通过在皮肤上施加不同程度的力，可评估感觉末梢的敏感性，并绘制其感受野：轻触、压力和有害（疼痛）刺激20,21.
这种蛭类神经节-皮肤制备方法的一个优点是，在记录电反应的同时，可以绘制出解剖学上的感受野图谱，并追踪神经元突起至已鉴定的神经元。以下描述的三项蛭类实验均可在同一标本上重复多次完成，因此该方法是一种经济高效的学术实验教学模块。

<table><tbody><tr><td>硅胶固化剂 Sylgard</td><td>道康宁 Dow Corning</td><td>182 型硅胶试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 NaCl</td><td>西格玛-奥德里奇 Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 KCl</td><td>西格玛-奥德里奇 Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛-奥德里奇 Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris/顺丁烯二酸</td><td>西格玛-奥德里奇 Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液 Bleach&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>用于氯化银丝电极</td></tr><tr><td>氢氧化钠 NaOH</td><td>西格玛-奥德里奇 Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>用于调节 pH</td></tr><tr><td>盐酸 HCl</td><td>西格玛-奥德里奇 Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>用于调节 pH</td></tr><tr><td>胶原酶/中性蛋白酶 Collagenase/Dispase</td><td>勃林格曼海姆 Boehringer Mannheim</td><td>269-638</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基（含 L-谷氨酰胺）</td><td>吉布科 Gibco</td><td>041-01415H</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Ready Systems Ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>04-001</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一水合葡萄糖 D-Glucose-Monohydrate</td><td>默克 Merck</td><td>8342</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素 Gentamycin sulfate&amp;nbsp;</td><td>任意供应商 any supplier</td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>谷氨酰胺 Glutamine</td><td>吉布科 Gibco</td><td>043-0503H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>西格玛 Sigma</td><td>3375</td><td>游离酸，结晶粉末</td></tr><tr><td>刀豆蛋白 A IV 型 Concanavalin A Type IV</td><td>西格玛 Sigma</td><td>C 2010</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>西格玛 Sigma</td><td>P 7890</td><td>分子量 15–30,000</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;微量培养板，60 × 10 &amp;mu;l</td><td>法尔肯 Falcon</td><td>3034</td><td>平底，每袋 10 块</td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>世界精密仪器公司 World Precision Instruments</td><td>混合装</td><td></td></tr><tr><td>细胞内电极探针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>法拉第屏蔽笼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>精细科学工具公司 Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜（100X）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光纤灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型可调反射镜</td><td></td><td></td><td>用于将光束导向样本</td></tr><tr><td>玻璃电极</td><td>西格玛-奥德里奇 Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>每盒 200 支，用于吸液电极</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>世界精密仪器公司 World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>&amp;nbsp;可固定于底座或金属杆上</td></tr><tr><td>抬高的样本支架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>银丝（10/1,000 英寸）</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>任意厂商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>交流/直流差分放大器</td><td>A-M Systems</td><td>Model 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>前置放大头 stage</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>随交流/直流放大器配套提供</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电极导线</td><td>任意厂商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃制工具&amp;nbsp;</td><td>自行制备</td><td></td><td>用于操作神经</td></tr><tr><td>电缆与连接器</td><td>任意厂商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带橡胶头的移液管 Pipettes with bulbs&amp;nbsp;</td><td>费希尔科技 Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>每盒 500 支</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>任意厂商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡或油泥</td><td>任意厂商或本地商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>刺激器</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 或 S88</td><td></td></tr><tr><td>吸电极用塑料尖端</td><td>本地五金店（Watt&amp;rsquo;s 品牌）</td><td>&amp;frac14; 英寸外径 × 0.170 英寸内径</td><td>切成小段，用火焰拉细后修剪至合适尺寸</td></tr></tbody></table>

细胞内记录、感觉野定位及医用水蛭（hirudo medicinalis）中已鉴定神经元的培养

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

淡水医蛭（Hirudo medicinalis）是一种多用途的模式生物，已被广泛用于神经生理学、神经行为学和发育生物学等领域的科学研究。本报告旨在将医蛭实验系统中的多种实验技术整合于一篇文章中，以供熟悉其他神经系统制备方法的生理学研究人员，或缺乏电生理学经验的生物学学生参考使用。我们演示了如何解剖医蛭，以便从神经节中对已知功能的神经回路进行细胞内记录。接着展示了如何将功能明确的单个细胞从神经节中分离，并在培养皿中进行原代培养，以及如何对培养中的神经元进行电生理记录。随后，我们介绍了如何制备带神经支配的皮肤区域，用于感觉或运动功能区的定位图谱绘制。这些医蛭制备方法至今仍被广泛用于研究神经网络的基本电学特性、行为机制、突触形成以及发育过程。同时，它们也是神经科学或生理学教学实验室中适宜的培训模块。

通过蛭类神经节中的感觉神经元进行细胞内记录，其特征表现为 图4C 所示的独特电压-时间轨迹。健康蛭类神经节细胞的静息膜电位为 -45 至 -60 mV。若测得电位值较小（即负值较低），应更换玻璃电极；若电位仍偏低，则应转至神经索的另一节段进行记录。若记录到振幅较小的自发动作电位，可能提示电极位于运动神经元中。若在神经节-体壁连接处出现此情况，可通过注入电流来判断该神经元是否支配仍附着于皮肤的肌肉。环状隆起肌运动神经元（AE）位于神经节腹侧（图4B），其可通过激活环状隆起肌，引起环状隆起（脊状结构或体节）的抬升。
向感觉细胞注入电流应引发具有图4C所示特征波形的动作电位。如果波形表现不同，可能是由于电桥未平衡或电容补偿偏移所致。应参考信号采集单元附带的手册，了解如何在细胞内平衡电桥的具体操作。请注意图4C中电流脉冲起始和结束时出现的刺激伪迹。当电桥平衡时，伪迹即呈现为此种形态。
从水蛭神经节分离的神经元原代培养物在培养皿中可形成电突触和化学突触。最初，培养细胞的电生理特性与体内情况并不完全相同 体内然而，几天后这些冲动与在神经节中记录到的冲动几乎无法区分。这一点在下文中得到证实。 图6C 与一对Rz细胞共培养。培养7小时后，突触电位的幅度为1-2 mV。培养56小时后，突触电位大于10 mV（上方图迹） 图6C）。动作电位的波形在培养56小时后也发生变化。在所述条件下，这些细胞可存活数天。
通过刺激神经根或神经索并在神经节中的神经元上记录信号，可以演示细胞间通讯。刺激这些神经可在不同的神经节细胞中产生显著的突触电位和动作电位。图8B中的记录来自从动物体内取出并固定在培养皿中的神经节内的一个Retzius细胞。黑色轨迹是由施加于神经索的阈下刺激通过细胞外电极诱发的。增加刺激电压可使该细胞产生动作电位（红色轨迹）。可通过向这些细胞内注射荧光染料或辣根过氧化物酶来研究其形态。通过电极施加负电流将 Lucifer yellow 注入一个 Rz 神经元。另一种方法是利用空气压力脉冲注射染料。图9A显示了注射开始后不久的染料分布情况。30分钟后，染料已扩散至神经根（图9B）。染料的类型取决于具体应用，例如，可穿过缝隙连接的小分子量染料可用于鉴定电突触。
<img alt="昆虫解剖，固定在培养皿中，标本A（整体）和B（解剖细节），生物学研究。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 蚂蟥腹面解剖图。 (A) 将动物腹面朝上牢固地固定在盛有蚂蟥生理盐水的弹性材料衬里培养皿中。(B) 在中线外侧沿前后轴方向做一浅表切口，以避免损伤神经索。黑色的血窦（内含腹神经索）清晰可见。注意与周围鞘膜相比呈白色的单个暴露神经节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="解剖过程示意图，用带注释的箭头突出显示组织层和结构。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 黑窦的解剖。 应小心地在一侧切开血管（箭头），以暴露腹神经索（双箭头）。在节段性根部周围保留部分血管组织，作为操作手柄，以便在解剖皿与记录皿之间转移时操控腹神经索。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="蜘蛛腿部结构的显微图像，显示辐射对称性和蛛网附着点。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg" width="400px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 分离的腹神经索节段。 利用节段神经根及节间连索末端残留的血管碎片将腹神经索固定，可暴露神经节，便于进行电生理记录。适度拉紧神经节有助于观察可识别的细胞体，并更易使用尖锐的玻璃电极穿透神经胶质鞘。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="神经元网络、标注图示以及显示神经元动作电位的电压-时间曲线图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 蚂蟥神经节的细胞解剖结构。(A) 若显微镜和光源聚光器调节得当，应能清晰观察到R细胞（R，Retzius细胞）及其他大型细胞体（P- 压力感受细胞，T- 触觉感受细胞，N- 伤害性感受细胞，AE- 环状竖毛肌细胞）。(B) 神经节内细胞的示意图。由于神经节在拉伸和固定时的张力差异，每个神经节中细胞胞体的位置可能存在轻微差异。(C) 从这些神经元胞体记录到的动作电位具有特征性的波形。这些锋电位是通过向细胞内注入正向电流（叠加在电压-时间轨迹上的方波脉冲）诱发的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="神经元细胞操作、荧光显微镜图像、细胞形态学分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 剥离神经节以分离单个细胞体。 (A) 应小心地横切胶质鞘，以避免损伤目标细胞。红线表示切割位置，以避开Rz神经元的胞体。打开胶质鞘可使消化酶进入结缔组织基质。 (B) 胶质鞘打开后，健康的细胞体从神经节中突出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="微电极电生理实验装置；随时间变化的神经细胞反应图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 从医用水蛭神经节培养神经元。(A) 使用微移液管从神经节中吸取细胞，并将其转移至含有培养基的培养皿中。(B) 将多个细胞彼此靠近放置可提高可识别神经元之间的突触形成速率。此处两个神经元的残端已形成一个突触。(C) 培养中的神经元表现出略有不同的电学特性。上方曲线显示了在细胞接种后7小时和56小时，通过刺激相邻细胞所诱发的突触电位。下方曲线则是通过直接向其中一个Rz细胞注入电流所诱发的反应。注意培养56小时后，突触电位幅度增加，动作电位波形也发生变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="利用力图进行神经反应分析；感觉装置及显示随时间变化的毫伏值的数据图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 用于绘制感受野的蛭类神经节-体壁制备示意图。 (A) 一种方法是连同1-3个神经节一起移除一段完整的体壁组织。此处已切断一侧的神经根，并将神经节固定于侧方。 (B) 高倍镜下展示被固定展开的神经节。 (C) 另一种方法是在体壁上开一个小窗，保持神经节完整的同时进行感受野的记录。 (D-G) 每种感觉神经元对机械刺激均表现出特征性的反应模式。 (D) 轻触刺激可诱发T细胞放电，但不会激活P细胞或N细胞。 (E) 当刺激增强时，T细胞反应被抑制，转而激活P细胞。随着刺激进一步增强，N细胞开始被激活 (F-G)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="神经元活动分析：显微镜图像、动作电位图、电生理实验装置。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. 蛭类神经节中的诱发电活动。 通过在神经索的连合纤维上施加细胞外刺激，可引发突触传递。(A) 该操作通过将一个吸吮电极连接至其中一条连合纤维并施加微小电压来实现。图中可见尖锐的玻璃电极（箭头）刺入神经节中的一个雷氏细胞（Retzius cell）。(B) 电压-时间轨迹图显示刺激伪迹后跟随一个突触电位（黑色）和一个动作电位（红色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="神经元活动的荧光显微镜观察；实验显示细胞中呈现绿色发光。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 
图9. 向医用水蛭神经元注射染料。 (A) 可通过记录用微电极施加电流，将荧光黄（Lucifer yellow）注入细胞体。随后可使用汞灯和FITC滤光片组观察荧光信号。 (B) 注射约30分钟后，染料已扩散至Rz轴突。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。

本文介绍了利用水蛭进行的三种神经系统制备方法：腹神经节神经元的细胞内记录、腹神经节神经元的培养，以及对受神经支配的皮肤区域进行记录以绘制感觉域图谱。

细胞内记录、感觉野定位及医用水蛭（Hirudo medicinalis）中已鉴定神经元的培养

淡水医蛭（Hirudo medicinalis）是一种多用途的模式生物，已被用于解答神经科学、发育生物学、生理学和生态学等领域的科学问题。

本实验的总体目标是学习如何制备蛭的背根神经节以进行单个神经元的细胞内记录，如何制备皮肤小片以绘制感觉感受野图谱，以及如何培养蛭的神经元。首先使用冰对蛭进行麻醉，并将其腹面朝上固定。下一步是解剖出大约三个独立的神经节，并将其拉伸以用于记录。最后一步是刺入单个神经元并记录动作电位。总体而言，通过结合生理学表征与实验，可以对神经网络的行为进行刻画。相较于其他简单的无脊椎动物标本（如 S 蜗牛或甲壳类动物），使用 leeches 的主要优势在于其神经节含有略多于 400 个易于接近的神经元，且这些神经元在培养条件下可维持数天的活性。该方法的可视化演示至关重要，因为皮肤制备以及单个神经元的分离操作难以掌握。操作者很容易损伤侵入皮肤区域的神经节，或在培养过程中损伤神经元。当你听说将要观看一部关于水蛭神经系统的影片并阅读相关文字时，很自然会提出这样一个问题：既然人类大脑要有趣得多，为什么还要去研究无脊椎动物的脑呢？如果你要研究一种无脊椎动物，为何会选择水蛭——一种令人厌恶的、会突然分泌黏液并吸食血液的动物呢？实际上，选择水蛭有多个充分的理由。第一个原因是，与人类相比，水蛭的神经系统极为简单。在它体内，你可以研究单个神经细胞，观察它们之间的连接方式，并了解这些连接如何导致动物行为的发生，而这种研究在更复杂的动物中是完全无法实现的。另一个原因是，水蛭（Leach）自1960年由Stephen Koffler首次引入神经科学研究以来，为研究一些基本问题提供了机会，而这些问题实际上与我们人类大脑的工作方式密切相关。这样的例子有很多，我可以举出许多。一个原因是，大脑中的大多数细胞并非神经细胞，而是所谓的胶质细胞，即卫星细胞。这些细胞最初是在水蛭中被研究的，之后一旦了解了它们在水蛭中的功能，就可以探究它们在我们人类大脑中是否具有相似特性，而事实确实如此，这一点对许多临床问题也具有重要意义。但研究这种动物最主要的原因是，正如你在影片中将看到的，它拥有一个极为优美的神经系统。该神经系统由一系列神经节组成，即成簇的神经细胞，数量有限。可以观察到所有细胞，并能对它们进行单独记录。可以探明它们之间的连接方式，就像研究巴黎地铁线路图一样。正是这种特性使得该制备样本在操作时极具吸引力，再结合发现某些基本原理的能力，更凸显其在开始解剖前的研究价值。务必先设置好记录软件和记录电极。准备在一个盛有林格溶液的大号硅胶衬里培养皿中用大头针固定蚂蟥并进行解剖。用10号或11号解剖刀将动物腹侧朝上展开。在腹面中线处用极浅的切口做纵向切开。尽量不要切断腹侧血窦，直到将动物完全打开且血窦被拉直无扭曲。此时腹神经索已暴露。使用精细虹膜剪在血管窦处做一小切口，将剪刀的一叶插入血管窦下方，轻轻抬起剪刀叶以分离血管窦与神经组织。随后沿腹神经索（VNC）的走向剪开血管窦，注意避开神经根、节段神经或神经节间的连合。接下来，通过在血管汇入神经根位置的远端切断神经根，去除部分腹神经索。现在将神经节转移至盛有生理盐水的洁净培养皿中，并用神经根和神经连索将其固定。利用此制备样品对感觉神经元胞体进行细胞内记录。将神经节腹面朝上固定在含有 L 15 的洁净培养皿中。使用胎牛血清（FCS）时，应用精细剪刀轻轻拉伸神经根。在胶质囊一端做一小切口，将剪刀的一侧刀片插入囊内并横向穿过胶质囊。接着，向培养皿中加入100 µL胶原酶溶液，将培养皿置于摇床上作用15分钟后，通过移动覆盖在暴露的细胞体上的培养基来观察细胞状态。将细胞放回摇床上继续振荡15分钟或更长时间，直至可用火焰抛光、内径约50微米（略大于细胞体直径）的移液管以最小负压从神经节中吸出细胞。为释放细胞外基质（ECM），向细胞中加入数滴含胎牛血清（FCS）的L-15培养基，并在室温下孵育数小时至24小时。待细胞准备就绪后，将其接种于经基质包被的多孔培养板中，使细胞彼此相邻生长。使用 L 15 培养基，不要使用胎牛血清（FCS）。24 小时后，细胞即可用于电生理实验，并可保持数天的活性。最初，其电学特性与体内标本并不完全相同。然而，数天后，其产生的冲动几乎无法区分。按照先前所述方法，将水蛭背侧朝下固定在衬有弹性体的培养皿中。接下来，将皮肤固定在一侧，使根神经位于切断的神经节另一侧。或者，在水蛭腹侧的神经节上方制作一个窗口，保留所有通向体壁的神经根完整。在某一感觉细胞中获得稳定的细胞内记录后，使用一根细小的火焰抛光玻璃棒轻轻触碰同一节段中具有 t 细胞和 p 细胞的皮肤。轻触皮肤即可产生电反应。对于终末细胞，需要施加更大的压力才能引发反应，大多数情况下，只有用镊子夹捏皮肤时，终末细胞才会产生反应。因此，为尽量减少潜在的组织损伤，应最后记录N细胞的反应，以确定所检测的神经元在特定位置是否存在突起。可以切断神经节之间的连接纤维，并重新检查感受野是否存在任何缺失。从医蛭神经节的感觉神经元进行的细胞内记录，其特征在于具有明显的时间轨迹。它们的静息电位介于负45至60毫伏之间。若测量值更低，则应使用新的玻璃电极或重新制备样本。振幅较小的自发动作电位提示该细胞可能是运动神经元。在神经节体壁制备标本中，可通过电流注入来确定神经元是否支配任何仍附着的肌肉。例如，位于神经节腹侧的环状肌竖肌运动神经元将使环眼上升。如果在电流注入后观察到非典型的波形，可能是由于电桥未平衡或电容补偿偏移所致。当电桥平衡时，在七小时后电流脉冲的起始和结束位置可见刺激伪迹。在原代培养中，从一对网状细胞中记录测量结果。突触电位的幅度约为一到二毫伏。培养56小时后，突触电位超过10毫伏。动作电位的波形也发生了改变。在同一制备标本中，刺激了神经根或神经连合。黑色迹线是由施加于神经连合的细胞外电极的阈下刺激所诱发的。红色轨迹显示了刺激电压的增加如何引起细胞产生动作电位。通过电极施加负电流，将 Lucifer yellow 注入视网膜细胞。注射后不久，染料仍局限于胞体。30分钟后，染料已扩散至神经根。该技术有助于神经生物学领域的研究人员探索动作电位波形背后的机制，并进一步研究神经回路，同时促进对可识别神经元再生与修复过程的理解。本视频演示了一系列实验技术。利用该方法可应用于突触形成、神经调节或神经生理学的基本研究。

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在蜜蜂中建立了同时对两个不同脑神经簇或两个不同解剖通路进行的细胞外长期记录。这些记录使得能够在活体动物中，在单个神经元水平以及神经元集群水平上，研究不同脑区之间神经活动处理的时间特性。...

在行为蜜蜂中同时进行两个神经处理阶段的长期记录

我们介绍一种在多电极阵列上培养原代小鼠螺旋神经节神经元外植体的方案，用于研究神经元的反应特性并优化刺激参数。此类研究旨在改善人工耳蜗植入体的神经元-电极界面，从而提高患者的听力效果，并降低设备的能量消耗。...

螺旋神经节神经元外植体培养及多电极阵列电生理记录

本文中，我们讨论了三种用于全细胞膜片钳记录以研究视网膜-顶盖环路的脑组织制备方法 非洲爪蟾 蝌蚪。每种制备方法都有其特定的优势，有助于提高实验的可操作性 非洲爪蟾...

全细胞膜片钳记录的制备与操作方案 Xenopus laevis 中脑顶盖神经元

本文介绍了一种利用动态钳技术研究钠钾泵（Na+/K+ pump）和持续性钠电流（persistent Na+...

Na+/K+泵在节律性簇状放电中的作用：基于建模与动态钳分析的研究

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

学习医用水蛭神经节细胞内记录技术，用于神经科学和电生理学研究。该方法可培养神经元并绘制感觉野图谱，为理解神经回路和细胞功能提供重要实验基础。

细胞内记录、感觉野定位及医用水蛭（Hirudo medicinalis）中已鉴定神经元的培养

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